Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2018-05-04T17:50:45Z No. of bitstreams: 1 2014 - Paloma Martins Mendon?a.pdf: 5837915 bytes, checksum: 4380ed0e7adefff59205996c112ae7af (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-04T17:50:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014 - Paloma Martins Mendon?a.pdf: 5837915 bytes, checksum: 4380ed0e7adefff59205996c112ae7af (MD5) Previous issue date: 2014-10-16 / CNPq / The Order Diptera is composed by about 153 thousand described species, but it is believed that the number of unknown species is much bigger. Adults and immature of some muscoid dipteran groups have little morphological differences, making the identification process more difficult. Besides, the available dichotomous keys are based on adults, but in the case of myiasis and cadaver colonization, only immature are found. These insects are known pathogen vectors, their larvae parasite humans and animais and they play an important role in forensic entomology. Therefore, the correct identification of these species is very important. This study aims to characterize features of medical, veterinary and forensic important dipteran species using two new approaches. The first chapter uses scanning electron microscopy which gives detailed information on the morphological characters that can help identify the immature forms of the flies. Immatures belonging to three muscoids with forensic and sanitary importance were studied using this methodology: Peckia (Eubaettcheria) cal/usar (Diptera: Sarcophagidae) (larvae and puparia), Luc?lia cuprina (larvae and puparia) e Cachliamyia macellaria (eggs, larvae and puparia) (Diptera: Calliphoridae). The size ofthe chorionic cells as well as the absence of spines at the posterior spiracle allowed to differentiate C. mace/faria from C. haminivarax, both myiasis causing species. The maxillary palp complex composed by a group of papillae inside a cavity seem to be specific to the subgenus Eubaeucheria. The anterior spiracular openings displaced in an irregular row are found exclusively in Sarcophagidae. The filiform spines at the anal segments are found only in the genus Lucilia. In the second chapter, barcading is used to provide a gene sequence database of medical, veterinary and forensically important Calliphoridae flies. This technique is based on the sequencing of a portion of the genome of the mitochondrial cytochrome oxidase l (cal) gene. Nine species of flies were collected in four regions in Brazil, corresponding to 346 specimens. Two other gene fragments ( elongation factor 1 alpha and white) were sequenced for the first time for some species. The barcade proposal was successfully achieved for Hemilucilia segmentaria, Hemi/ucilia semidiaphana, Chlarapracla idiaidea, Cachliamyia macellaria, Chrysamya megacephala and Chrysamya albiceps, for which the intraspecific variation was less than 3%. However, for Lucilia eximia, Chrysamya putaria and Chrysamya rufifacies, this methodology brought incipient results. Intraspecific variation among Lucilia eximia samples was 4.6%, suggesting that the threshold proposed should not be used for ali dipteran species without previous analysis of the studied group. Chrysamya putaria is polyphyletic according to nuclear and mitochondrial genes. In addition, a set of samples grouped with samples of C. albiceps and C. rufifacies. Therefore, more studies need to be clone to better explain these taxonomic problems. / A ordem Diptera ? composta por aproximadamente 153 mil esp?cies descritas, mas acredita-se que o n?mero de esp?cies ainda desconhecidas ? muito grande. Alguns grupos de d?pteros musc?ides possuem imaturos e adultos com poucas varia??es morfol?gicas, dificultando muito o processo de identifica??o. Al?m disso, as chaves dicot?micas existentes s?o baseadas nos adultos, entretanto, s?o os imaturos mais encontrados causando mi?ases ou colonizando cad?veres. Estes inselos s?o conhecidos vetores de pat?genos, suas larvas s?o parasitas de humanos e animais e apresentam papel importante como auxilio a entomologia forense. Assim, a correta identifica??o das esp?cies que desempenham estas fun??es ? muito importante. O presente estudo tem como objetivo principal caracterizar esp?cies de d?ptcros mnscoidcs de import?ncia m?dica-veterin?ria e forense, atrav?s da utiliza??o de duas t?cnicas modernas de identifica??o. O primeiro cap?tulo utiliza a microscopia eletr?nica de varredura que permite a visualiza??o e a determina??o de caracteres que possam ser utilizados na identifica??o das esp?cies. Foram estudados imaturos de tr?s esp?cies de d?pteros de duas fam?lias diferentes: Peckia (Eubaettcheria) callusar (Diptera: Sarcophagidae) (larvas e pup?rios), Lucilia cuprina (larvas e pup?rios) e Cachliamyia macellaria (ovos, larvas e pup?rios) (Diptera: Calliphoridae) atrav?s desta t?cnica. O tamanho das c?lulas do exoc?rion permitiu diferenciar entre C. macellaria e C. haminivarax, duas esp?cies causadoras de mi?ases. A aus?ncia de espinhos no espir?culo posterior das larvas de C. macellaria tamb?m a diferencia de C. haminivarax. As papilas do complexo do palpo maxilar em uma cavidade parecem ser espec?ficas do subg?nero Eubaettcheria. As aberturas respirat?rias do espir?culo anterior dispostas em fileiras irregulares s?o exclusivas da fam?lia Sarcophagidae. A presen?a de espinhos filamentosos no ?ltimo segmento larval ? caracter?stica espec?fica do g?nero Lucilia. No segundo cap?tulo, a t?cnica de harcade ? utilizada para a forma??o de um banco de dados contendo sequ?ncias g?nicas de esp?cies de import?ncia m?dica-veterin?ria e forense da fam?lia Calliphoridae. Esta t?cnica baseia-se no sequenciamento de uma por??o do gene mitocondrial citocromo oxidase I (cal). Foram analisadas nove esp?cies de d?pteros, coletadas em quatro regi?es do Brasil, em um total de 346 esp?cimes utilizados. Dois segmentos do genoma nuclear (fator de elonga??o 1 alfa e white) tamb?m foram sequenciados pela primeira vez para algumas esp?cies. A proposta de barcade foi bem sucedida em Hemilucilia segmentaria, Hemilucilia semidiaphana, Chlaraprocta idiaidea, Cachliamyia macellaria, Chrysamya megacephala e Chrysamya albiceps, onde a varia??o intraespec?fica foi menor do que 3%. Entretanto, em Lucilia eximia, Chrysamya putaria e Ch1ysamya rufifacies esta metodologia trouxe resultados incipientes. A varia??o intraespec?fica em Lucilia eximia foi 4,6%, sugerindo que o limiar proposto n?o deve ser aplicado em todos os d?pteros sem an?lise pr?via do grupo estudado. Chrysamya pularia ? uma esp?cie polifi!?tica comprovada tanto pelos genes nucleares quanto mitocondrial, al?m isso, uma parte das amostras forma um agrupamento com as amostras de C. albiceps e C. nijifacies. Assim, acrcditase que mais estudos precisam ser conduzidos com o objetivo de esclarecer melhor estas quest?es taxon?micas.

Durante o desenvolvimento deste projeto adotou-se como estratégia o sequenciamento de ESTs, com a finalidade de encontrar mensagens relacionadas com desenvolvimento, metabolismo e principalmente amplificação/politenização em glândulas salivares de Rhynchosciara americana, um díptero (Sciarídeo) que apresenta cromossomos politênicos e amplificação gênica rigidamente regulada ao longo do desenvolvimento larval, tanto neste tecido quanto em outros. Um total de 8193 ESTs foi gerado, estas foram anotadas e categorizadas segundo os termos do Gene Ontology Consortium, proporcionando uma visão geral do status metabólico, como em um Northern eletrônico, de um ponto importante no desenvolvimento desta espécie, quando surgem amplificações gênicas específicas e a glândula salivar necessita secretar as proteínas do casulo. Outros frutos deste seqüenciamento foram a determinação de 91 polimorfismos e a criação de uma tabela de códon usage. Diversos ESTs foram identificados com potencial envolvimento com os endociclos observados neste tecido, destes, RaDup e RaMCM5 foram selecionados para estudo. Suas regiões genômicas foram isoladas e suas localizações cromossômicas foram identificadas, em relação a RaDup, toda a porção codificante de seu mensageiro e 12kb de DNA genômico contendo seu gene foram seqüenciados, revelando sua estrutura gênica. Anticorpos foram produzidos para detectar esta proteína, gerando evidências de sua participação tanto na replicação mitótica como nos endociclos presentes nas glândulas salivares. A localização cromossômica de RaDup é um dado muito interessante, pois pela primeira vez um pufe amplificado é relacionado com um gene regulatório. / In this work EST sequencing was used as strategy to find messages related to development, metabolism and polyteny/amplification in salivary glands of Rhynchosciara americana, a dipteran (Sciaridae) that shows in this tissue giant polytene chromosomes and gene amplification tightly regulated throughout development of the larvae. A total of 8193 EST sequences were generated, annotated and categorized using Gene Ontology Consortium terms, providing a general view of the metabolic status, like an electronic Northern, of an important point in development of the larvae, that shows where specific genes are amplified and the salivary gland needs to secrete the proteins to form the cocoon. Other data include determination of 91 SNPs and a statistic of codon usage. Several ESTs were identified with potential connection to endocicles, from these RaDup and RaMCM5 were selected for further studies. Both chromosomal loci were identified and genomic regions isolated, for RaDup the coding region of its mRNA and 12kb of genomic region were completely sequenced, revealing its gene structure, and antibodies were raised against this protein, making evident data about its involvement in replication in mitotic cells and in endocicles in salivary glands. About the chromosomal locus of RaDup, it becomes very interesting, because for the first time one amplified puff can be related to a regulatory gene.

Durante o desenvolvimento deste projeto adotou-se como estratégia o sequenciamento de ESTs, com a finalidade de encontrar mensagens relacionadas com desenvolvimento, metabolismo e principalmente amplificação/politenização em glândulas salivares de Rhynchosciara americana, um díptero (Sciarídeo) que apresenta cromossomos politênicos e amplificação gênica rigidamente regulada ao longo do desenvolvimento larval, tanto neste tecido quanto em outros. Um total de 8193 ESTs foi gerado, estas foram anotadas e categorizadas segundo os termos do Gene Ontology Consortium, proporcionando uma visão geral do status metabólico, como em um Northern eletrônico, de um ponto importante no desenvolvimento desta espécie, quando surgem amplificações gênicas específicas e a glândula salivar necessita secretar as proteínas do casulo. Outros frutos deste seqüenciamento foram a determinação de 91 polimorfismos e a criação de uma tabela de códon usage. Diversos ESTs foram identificados com potencial envolvimento com os endociclos observados neste tecido, destes, RaDup e RaMCM5 foram selecionados para estudo. Suas regiões genômicas foram isoladas e suas localizações cromossômicas foram identificadas, em relação a RaDup, toda a porção codificante de seu mensageiro e 12kb de DNA genômico contendo seu gene foram seqüenciados, revelando sua estrutura gênica. Anticorpos foram produzidos para detectar esta proteína, gerando evidências de sua participação tanto na replicação mitótica como nos endociclos presentes nas glândulas salivares. A localização cromossômica de RaDup é um dado muito interessante, pois pela primeira vez um pufe amplificado é relacionado com um gene regulatório. / In this work EST sequencing was used as strategy to find messages related to development, metabolism and polyteny/amplification in salivary glands of Rhynchosciara americana, a dipteran (Sciaridae) that shows in this tissue giant polytene chromosomes and gene amplification tightly regulated throughout development of the larvae. A total of 8193 EST sequences were generated, annotated and categorized using Gene Ontology Consortium terms, providing a general view of the metabolic status, like an electronic Northern, of an important point in development of the larvae, that shows where specific genes are amplified and the salivary gland needs to secrete the proteins to form the cocoon. Other data include determination of 91 SNPs and a statistic of codon usage. Several ESTs were identified with potential connection to endocicles, from these RaDup and RaMCM5 were selected for further studies. Both chromosomal loci were identified and genomic regions isolated, for RaDup the coding region of its mRNA and 12kb of genomic region were completely sequenced, revealing its gene structure, and antibodies were raised against this protein, making evident data about its involvement in replication in mitotic cells and in endocicles in salivary glands. About the chromosomal locus of RaDup, it becomes very interesting, because for the first time one amplified puff can be related to a regulatory gene.