Le vieillissement cellulaire cutané résulte d’attaques aussi bien endogènes qu’exogènes dont les conséquences multiples telles que l’apparition de rides, la cancérisation, les troubles de la pigmentation ou encore l’atrophie cutanée sont autant de sources d’une prise de conscience globale sur l’importance de la prévention des dégâts et de la régénération du système cellulaire de la peau. Les kératinocytes, les fibroblastes et les mélanocytes qui constituent ce système cellulaire sont le siège, à la fois des altérations résultant des divers stress environnementaux et oxydatifs, et des processus de réparations mis en place pour y répondre. Parmi ces systèmes de protections endogènes des cellules, nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux enzymes de phase II, au protéasome 20S et au facteur de transcription Nrf2 qui constituent ensembles des acteurs essentiels de la survie cellulaire.Nous avons en premier lieu, sélectionné comme actifs des molécules naturelles soufrées (le sulforaphane et l’acide α-lipoïque) connues comme étant de puissants cytoprotecteurs, et nous avons évaluées leur capacité à contrecarrer les effets oxydatifs, générateurs d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de carbonylation des protéines. Nous avons ensuite déterminé leur capacité à augmenter significativement l’expression et l’activation du protéasome 20S puis vérifié que cette activation était influencée de manière indirecte par modulation de l’expression du Nrf2. Au vu des résultats obtenus, nous avons démontré que des molécules soufrées pouvant être retrouvées dans la nature étaient capables d’augmenter significativement l’activité de ces enzymes de phase II dans les kératinocytes HaCat d’une part, et du protéasome 20S dans les fibroblastes NHDF d’autre part. Le SFN a montré un potentiel intéressant sur les enzymes de phase II tandis que l’AL s’est avéré être un puissant inducteur du protéasome. Nous avons également étudié l’action bénéfique du SFN et de l’AL sur l’état oxydatif général de la cellule. Nous avons démontré que ceux-ci étaient capables de la protéger contre les dégâts induits par le peroxyde d’hydrogène que nous avons utilisé pour reproduire le stress provoqué par les agressions extérieures. En effet, nos résultats ont montré que le SFN et/ou l’AL utilisés à des concentrations précises pouvaient diminuer le taux intracellulaire de ROS, l’oxydation des protéines, augmenter l’expression du facteur de transcription Nrf2 et améliorer la prolifération cellulaire à moyen terme.Ce travail de doctorat nous a également permis de mettre au point, d’adapter et d’améliorer une série de tests in vitro permettant de mesurer les capacités de détoxification de différentes molécules, et ce à différents niveaux.En conclusion, l’ensemble de nos résultats suggèrent que le SFN et l’AL, deux molécules soufrées naturelles, pourraient représenter des molécules d’intérêt pour combattre les dégâts oxydatifs causés par les agents délétères de l’environnement en réactivant les mécanismes de défense naturelle dans les cellules dans la peau. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ces dernières années, le nombre d’agents thérapeutiques issus des biotechnologies n’a cessé d’augmenter. Parmi ceux-ci, plus de 85% sont administrés par voie parentérale, principalement par injection sous-cutanée ou intraveineuse. Cette forme d’administration ne favorisant pas la compliance des patients, de nombreuses recherches ont été effectuées afin de trouver des alternatives à ces voies invasives, telles que la voie intranasale, pulmonaire, transdermique ou orale. Cette dernière a pour avantage, en plus d’être non invasive, de ne pas nécessiter de formation particulière du patient au moment de la délivrance. Elle permet donc une plus grande compliance, et ce d’autant plus lorsqu’il s’agit d’un traitement chronique. Malheureusement, il a été démontré que la biodisponibilité relative des peptides et protéines non formulés administrés oralement est inférieure à 1%.Lors des nombreux développements destinés à augmenter l’absorption intestinale de ces macromolécules, l’insuline a souvent été utilisée comme modèle de peptide. En effet, elle est facilement disponible dans le commerce et est utilisée de façon chronique dans le traitement de certaines formes de diabète, principalement le diabète de type I. De plus, son administration orale permet de bénéficier d’un premier passage hépatique bénéfique car il permet de mimer sa sécrétion naturelle à partir du pancréas dans la veine porte hépatique.Au vu des nombreuses études réalisées dans le cadre de l’administration orale de peptides et protéines, nous avons opté pour une stratégie de formulation reposant sur l’encapsulation de ces molécules afin de les protéger des conditions défavorables présentes tout au long du tractus gastro-intestinal.Les systèmes nanoparticulaires nous semblant les plus prometteurs, nous nous sommes fixé comme objectif d’obtenir des nanoparticules dont le diamètre moyen ne dépassait pas 300 nm, valeur généralement reprise dans la littérature comme étant la plus efficace en vue d’augmenter leur absorption à travers l’épithélium intestinal. A partir de cette hypothèse, nous avons développé deux types de nanoparticules :des nanoparticules polymériques et lipidiques. Dans les deux cas, nous avons cherché à obtenir des nanoparticules mucoadhésives dont les avantages sont (i) une protection partielle contre l’environnement intestinal, (ii) une diminution de la clairance permettant une augmentation du temps de résidence au site d’absorption, (iii) une diminution de la distance de diffusion et enfin, (iv) une augmentation du gradient de concentration vers la circulation systémique.Les formulations polymériques consistaient en des nanoparticules composées d’un polymère cationique (chitosan et ses dérivés), d’un peptide (insuline ou colistiméthate sodique) et éventuellement d’un dérivé polyanionique. La formation de ces nanoparticules repose sur des interactions électrostatiques entre le polymère chargé positivement et le peptide présentant des charges négatives. Ce type de formulations a l’avantage de ne pas utiliser de solvant organique durant le processus de fabrication et d’être bioadhésif. Un autre avantage, grâce aux propriétés promotrices d’absorption du chitosan, est de pouvoir ouvrir les jonctions serrées présentes entre les cellules épithéliales du tractus digestif afin de faciliter l’absorption du principe actif. Les formulations obtenues présentaient un diamètre inférieur à 300 nm et un potentiel zêta dont la valeur se situait toujours entre +24 mV et +40 mV. Grace à cette charge de surface, nos nanoparticules présentaient des propriétés mucoadhésives. Celles-ci étaient d’autant plus marquées lorsque le diamètre des particules diminuait et que leur potentiel zêta augmentait. Les taux d’encapsulation pour ces formulations étaient supérieurs à 50%, atteignant 64 ± 4% pour la meilleure formulation. Nous avons également observé que les profils de libération du peptide à partir de ces nanoparticules pouvaient être modulés par le choix du polymère, et plus particulièrement son degré de quaternisation, ainsi que par l’emploi d’un dérivé polyanionique. De cette façon, certaines formulations permettaient une libération continue sur 210 minutes tout en offrant une protection efficace contre les enzymes digestives. Enfin, comparativement à de l’insuline en solution, nous avons pu montrer que le passage à travers une monocouche cellulaire de Caco-2/HT-29 mimant l’épithélium intestinal était supérieur pour nos formulations avec un passage atteignant 3,9 ± 0,5% après 240 minutes contre 1,2 ± 0,3% après le même temps pour une solution d’insuline. Finalement, nous avons démontré in vivo que le processus de formulation ne dénaturait pas notre peptide puisque son efficacité biologique était conservée. Les formulations lipidiques étaient, quant à elles, obtenues à partir d’émulsions solidifiées. Pour cela, une double émulsion E/H/E était réalisée avec, en phase interne, une phase aqueuse contenant le peptide et une phase externe organique contenant les lipides. Cette émulsion primaire était ensuite émulsifiée dans une phase aqueuse externe contenant des tensioactifs. Le solvant organique était ensuite évaporé, conduisant à la solidification des lipides sous forme de nanoparticules lipidiques solides. L’emploi d’un lipide cationique permettait d’obtenir une charge de surface positive conduisant aux propriétés mucoadhésives. Comme pour les formulations à base de chitosan, les nanoparticules obtenues présentaient un diamètre inférieur à 300 nm et un potentiel zêta toujours supérieur à +33 mV. Le taux d’encapsulation était compris entre 30% et 42%. Ces formulations permettaient également la protection du peptide encapsulé envers les enzymes digestives (pepsine et trypsine). La libération du peptide à partir des nanoparticules était biphasique, avec une libération importante durant les trente premières minutes, suivie d’une libération continue. Ces formulations permettaient également d’augmenter le passage du peptide sur une monocouche cellulaire mimant l’épithélium intestinal puisque nous obtenions un passage égal à 2,9 ± 0,4% après 4h pour nos cSLN, contre 1,2 ± 0,3% pour une solution d’insuline. Comme précédemment, l’intégrité du peptide n’était pas modifiée par notre processus de formulation. Afin de confirmer que nos principes de formulation pouvaient être transposables à d’autres peptides et protéines, nous avons réalisé des formulations similaires avec le colistiméthate de sodium, une prodrogue d’un antibiotique polypeptidique, la colistine.A la suite de ces évaluations in vitro, nous avons sélectionné les meilleurs candidats pour chaque type de formulation contenant de l’insuline afin de réaliser une étude in vivo. Cette dernière consistait en l’administration orale, chez le rat, d’une gélule gastrorésistante contenant nos formulations. A la suite de cette administration, nous avons suivi la glycémie chez le rat afin de comparer nos résultats avec une administration sous cutanée d’insuline correspondant au traitement classique, ainsi qu’à l’administration orale d’insuline non formulées. Les résultats obtenus ont démontré une diminution, parfois importante, de la glycémie lors de l’administration orale de nos formulations. Dans le cas des formulations à base de chitosan et d’insuline, administrées à 100 IU/kg, cette réduction de la glycémie a été observée chez deux animaux sur onze et à conduit à leur décès par hypoglycémie. Ce profil « tout ou rien » serait dû à la dissolution précoce des gélules alors qu’elles étaient encore présentes dans l’estomac. Concernant les formulations lipidiques, lorsque celles-ci étaient administrées à 50 IU/kg, nous observions une diminution de la glycémie de 28 ± 7% du taux basal, et ce pour les onze animaux. A l’avenir, il serait intéressant de pouvoir observer séparément la gélule de son contenu après administration, par des techniques d’imagerie médicale, afin de comprendre les variabilités observées in vivo. Il serait également intéressant de connaitre plus en détails les mécanismes de passage de l’épithélium intestinal. De telles études ont été réalisées in vitro ou ex vivo mais, à notre connaissance, pas in vivo. / In the last few years, research in biotechnology has produced a plethora of new therapeutics based on peptides and proteins. These new biotherapeutics are currently injected (e.g. subcutaneously), with lower patient compliance than for the oral route of administration. Indeed, the oral route is still considered as the most convenient way for drug delivery, offering high compliance by patients, especially in long-term treatments. However, proteins and peptides are characterized by low bioavailability when administered orally (lower than 1%). This is essentially due to their poor stability in the gastrointestinal (GI) tract (e.g. resulting from pH, enzymatic and microbial degradation) as well as limited permeability through the gastro intestinal mucosa.Numerous researches have been performed on oral administration of peptides and proteins with the use of insulin as the model drug. Indeed, insulin, a peptide hormone, is usually administered subcutaneously for the treatment of diabetes mellitus. Moreover, the oral administration of insulin can mimic the endogenous secretion by the pancreas as the absorbed insulin passes through the portal vein to the liver avoiding peripheral hyperinsulinemia. In this work, encapsulation strategy was selected to increase the oral bioavailability of macromolecules. These novel formulations were developed in the form of both polymeric and lipid cationic nanoparticles, which were characterized by a mean diameter lower than 300 nm. Such cationic nanoparticles allowed protecting the biomolecule against early degradation in the gastrointestinal tract as well as getting adhesive properties to decrease intestinal clearance and increase the concentration gradient toward the systemic circulation by shorting the diffusion pathway. The polymeric formulations were based on the use of a cationic polymer (e.g. chitosan and chitosan derivatives), a peptide (e.g. insulin or sodium colistimethate) and, alternatively, a polyanion. These formulations were prepared by self-assembly, via electrostatic interactions between the negatively charged drug and the positively charged polymers. An advantage of such formulations was to avoid the use of organic solvents during the preparation. Moreover, these formulations were characterized by bioadhesive properties and the use of chitosan derivatives as permeation enhancer was supposed to promote the intestinal absorption of macromolecules. The polymeric nanoparticles were all characterized by a mean diameter lower than 300 nm and a positive zeta potential that was ranged between +24 mV and +40 mV. The bioadhesive properties were found to be enhanced with a decrease of the nanoparticles diameter, as well as, by an increase of the zeta potential. The encapsulation efficiencies were found to be always higher than 40%. It was demonstrated that dissolution profiles of the encapsulated peptide from the polymeric nanoparticles was greatly influenced by the nature of the polymer (e.g. derivatization degree) and the use of a polyanion. A proper selection of both materials allowed getting a sustained-release of the peptide over 210 minutes. An effective protection against digestive enzymes was also demonstrated. Moreover, it was shown that the diffusion of insulin through Caco-2/HT-29 cell monolayers was increased when encapsulated in polymeric nanoparticles compared to a solution of raw insulin (e.g. 3.9 ± 0.5% vs. 1.2 ± 0.3% after 240 min.). Interestingly, it was also proved that the in vivo biologic activity of insulin was not altered during the formulation process.The so-called water-in-oil-in-water (W/O/W) double emulsion technique was used to produce the cationic solid lipid nanoparticles (cSLN). With the double emulsion method, the first emulsion is water in oil, which means that the protein is dissolved into the inner aqueous phase, emulsified with an organic phase including the lipids. This first emulsion was then emulsified with an outer aqueous phase including surfactants. The organic solvent was removed by evaporation to get solid lipid nanoparticles. It was decided to select cationic lipids to get ionic interactions between the positively charged surface of the cSLNs and the negative charges present in the mucus at the surface of the intestinal tract. The mean diameter of the cSLN remained lower than 300 nm and the zeta potential was always higher than +33 mV. The encapsulation efficiency was ranged between 30% and 42% and all the formulations were characterized by bioadhesive properties. Moreover, it was demonstrated that the cSLN allowed an effective protection against digestive enzymes (e.g. pepsin and trypsin). The dissolution profiles of the insulin from the cSLN were characterized by a biphasic release. There was an initial burst release in the first 30 min, followed by a sustained release of the peptide. Moreover, compared to free insulin in solution, these formulations significantly increased the passage of the encapsulated insulin through Caco-2/HT-29 cell monolayer to reach 2.9 ± 0.4% after 4h for the cSLN, instead of. 1.2 ± 0.3% for the unencapsulated raw insulin. Finally, as for the previous formulation based on chitosan, the peptide and its biological activity were preserved during the formulation process.In order to confirm that the developed formulations could be used with others peptides and proteins, similar formulations were developed with sodium colistimethate, a prodrug of a polypeptide antibiotic, the colistine.After these in vitro characterizations, the best formulation of each type containing insulin was selected to perform in vivo evaluation. Both polymeric and lipidic formulations were orally administered by the mean of an enterosoluble capsule. Glycemia in rat was monitored and compared to that obtained after a subcutaneous injection, as well as an oral administration of insulin solution. The results showed a tremendous decrease of the glycemia after the oral administration of our formulations. For the chitosan-based formulation, which was administered to eleven animals (100 IU/kg), a tremendous decrease of glycemia was observed in two animals, leading to their death by hypoglycemia. These results could be explained by an early dissolution of the capsule in the stomach, leading to the early release of our formulations. For the cSLN containing insulin and administered at 50 IU/kg, the mean decrease of the glycemia was 28 ± 7%. Nevertheless, consequent variability was observed for the highest decrease of the glycemia (20.8% - 42.2%) as well as for the time need to get this highest decrease (180 – 330 minutes). This variability can also be explained by an early dissolution of the capsule in the stomach and, even if these lipid formulations were stable in gastric media, their bioadhesive properties prevent them to reach the intestine.In the future, it would be interesting to simultaneously follow the capsule pathway and its content. This could be done by medical imaging and would help to understand the variability that was observed during our in vivo evaluation. It would also be interesting to evaluate more deeply the passage mechanism through the intestinal epithelium. Such studies have been done in vitro and ex vivo but not in vivo to the best of our knowledge. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Tuberculosis (TB) remains the leading cause of death due to a single infectious agent with more than 1.5 million people killed each year. In 2018, the World Health Organization (WHO) estimated that one third of the world’s population was infected with Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the pathogen responsible for the disease.In 2000, EthR, a mycobacterial transcriptional repressor, was identified as a key modulator of ethionamide (ETH) bioactivation. ETH is one of the main second-line drugs used to treat drug-resistant strains and it is a prodrug that is activated in Mtb by the mono-oxygenase EthA and then inhibits InhA, an enzyme involved in the mycolic acid biosynthesis. In 2009, it was demonstrated that co-administration of ETH with the drug-like inhibitors of EthR was able to boost ETH activity by a factor three in a mouse-model of TB-infection, thus validating EthR protein as a target for a new therapeutic strategy. The first part of this thesis deals with the validation and deep characterization of the solved EthR-ligand structures based on all analysis of how each ligand bind to the EthR. In this section, based on the study of both co-crystal structures and the physicochemical properties of the ligands, we have rationalized the information currently available and understood the interaction of all EthR inhibitors in order to lead to more effective inhibitor design.More recently, another mycobaterial repressor, denoted EthR2, was identified as a putative target that appears to be functionally comparable to EthR (then the locus has been termed EthA2/EthR2, due to its similarity to the EthA/EthR locus). Furthermore, a spiroisoxazoline family of small-molecules, generically denoted as SMARt, has been identified as effective ligand of EthR2. However, according to the data present in the literature, this spiroisoxazoline family can also bind to the former EthR. In order to investigate this proposition, I have solved these small molecules in complex with EthR and compared their binding interactions to the EthR2 protein as well. The opportunity for the design small-molecules is capable of targeting both repressors, thereby opening the way to a dual-target approach.Finally, the third part of this thesis is devoted to the mycobacterial transcriptional factor MabR (Rv2242). Several studies identified this protein as a regulatory transcription factor of the fatty acid synthase II operon, which is mainly responsible for the mycolic acid biosynthesis in Mtb. I therefore purified to homogeneity and characterized the MabR protein as well as I determined the crystal structure of its C-terminal part. Finally, the functional role of MabR is largely discussed, and the way on how to interfere with its DNA binding ability is commented with respect to our results. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Chromosomal rearrangements of the nucleoporin genes NUP214 and NUP98 are recurrent in aggressive cases of acute myeloid and lymphoid leukemias. NUP214 and NUP98 are components of the nuclear pore complex, a giant multiprotein structure that mediates nucleocytoplasmic shuttling. The two nucleoporins are enriched in phenylalanine-glycine (FG) repeats, which form the NPC permeability barrier and are essential for the interaction with nuclear transport receptors. NUP214 and NUP98 exhibit high affinity for the nuclear export receptor chromosomal region maintenance 1 (CRM1), which, alone, mediates the nuclear export of thousands of proteins and ribonucleoproteins. In the first part of this project, we report that the leukemogenic fusion proteins SET-NUP214 and DEK-NUP214 affect nucleocytoplasmic transport by perturbing the localization of essential nuclear transport factors, including endogenous nucleoporins and CRM1 nuclear export complexes. We further demonstrate that the two fusion proteins are sensitive to CRM1 inhibition and that targeted inhibition of nuclear export is sufficient to reduce the cell viability and proliferation of patient-derived cell lines with SET-NUP214 and DEK-NUP214 rearrangements. In the second part of the project, we used proximity-dependent biotin identification (BioID) to study the landscape of the NUP98-HOXA9 and SET-NUP214 environments. Though distinct endogenous binding partners have been documented for NUP214 and NUP98 chimeras, their total interactome has not been fully disclosed. Our results suggest that both fusion proteins interact with major regulators of RNA processing, with translation-associated proteins, and that both chimeras perturb the transcriptional program of the tumor suppressor p53. We further purpose that the two fusion proteins affect distinct cellular processes. According to our results, NUP98-HOXA9 likely perturbs Wnt, MAPK and estrogen receptor signaling pathways, as well as the cytoskeleton, the latter likely due to its interaction with the nuclear export receptor CRM1. Conversely, SET-NUP214 appears to affect cellular metabolism, likely due to the interaction with mitochondrial proteins and metabolic regulators. Overall, this research project provided new data supporting that CRM1 might be a possible therapeutic target in NUP214-related leukemia and revealed new clues on the mechanistic actions of nucleoporin fusion proteins. Hence, our findings might be of particular relevance in the search of new druggable targets for the treatment of nucleoporin-related leukemia. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le génome humain contient plus de huit cents gènes de récepteurs olfactifs et 25 gènes derécepteurs au goût amer, qui sont exprimés dans de nombreux tissus. Très peu de données existentsur leur présence au niveau des muqueuses nasosinusiennes humaines. Les récepteurs olfactifs ontprobablement des fonctions en dehors de l’olfaction. Il est donc nécessaire d’établir lesquels d’entreeux participent à l’olfaction en les recherchant au sein de la muqueuse olfactive. Par ailleurs, lesrécepteurs au goût amer participent potentiellement à d’autres processus physiologiquesindépendants de la gustation. Au niveau du nez et des sinus, ces récepteurs pourraient êtreimpliqués dans l’immunité innée nasale.La première partie de ce travail s’est intéressée à l’expression des gènes des récepteurs olfactifs dansla muqueuse olfactive humaine. Des prélèvements de muqueuse olfactive entière ont pu êtreréalisés lors de 26 autopsies, puis analysés par les techniques de RT-qPCR. Nous mettons en évidenceque 273 gènes sont exprimés en moyenne. Un groupe de 90 gènes est exprimé chez tous les sujets,un autre groupe de 140 gènes est exprimé chez plus de la moitié des sujets et enfin un derniergroupe de 125 gènes est exprimé chez moins de la moitié des sujets. Cette variabilitéinterindividuelle d’expression des gènes de récepteurs olfactifs pourrait donc intervenir dans lavariabilité des performances olfactives entre individus. Nous avons également réalisé une deuxièmesérie de six prélèvements dans le but de préciser si une différence d’expression existait entre lamuqueuse olfactive antérieure et postérieure. Nos résultats montrent une expression semblableentre ces deux parties.La deuxième partie de ce travail a été consacrée aux récepteurs au goût amer. Le premier objectifconsistait à déterminer parmi les gènes de cette famille de 25 récepteurs, lesquels étaient expriméset à quel niveau dans la sphère nasosinusienne. Nous avons eu recours à la même approche baséesur la RT-qPCR, pour identifier et quantifier les ARN messagers de ces récepteurs au sein de septrégions des muqueuses nasosinusiennes provenant de prélèvements obtenus lors de sept autopsies.Nos résultats montrent une expression similaire parmi les différentes régions étudiées.Enfin, partant de données de la littérature qui suggèrent un rôle du récepteur au goût amer T2R38dans l’immunité nasale innée, nous avons exploré in vitro la capacité de ce récepteur à reconnaîtredifférents métabolites bactériens. Nos résultats montrent 7 nouveaux agonistes, suggérant que lerécepteur T2R38 est capable de détecter des métabolites bactériens plus variés que ce qui étaitprécédemment connu. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Environmental pollution represents one of the most pressing problems in developed countries and in recent years has raised concern and doubts also from the scientific perspective. In fact, an ever-growing number of epidemiologic-observational studies, carried out on population at risk, correlated the exposure to environmental chemicals with the incidence of several pathological conditions, ranging from metabolic to cardiological and reproductive diseases, until the development of cancers. These evidences have made more urgent the need for further investigations on the biological mechanism at the basis of pollutants toxicity. In particular, significant attention has been paid to evaluating the impact of organochlorine pesticides (OCPs) on human health. OCPs belong to a large class of organic compounds that the Stockholm Convention catalogued as “POPs” (Persistent Organic Pollutants). The list of banned chemicals includes dioxins and their derivatives, hexachlorocyclohexane, polychlorinated biphenyls and aldrin, whereas many other similar substances are subjected to restrictions. OCPs are widely distributed in the biosphere and their hazardousness is mostly related to physicochemical properties such as lipophilia and energetic stability, that allow these molecules to be resistant to biodegradation and to bio-accumulate into the adipose tissue. Information about the molecular mechanisms of the most popular OCPs (i.e. dioxins, DDT) is already present in scientific literature and several studies indicated them as endocrine disrupting chemicals as well as oncogenes. On the other hand, not much is known about a dangerous and widely diffused compound: the hexachlorocyclohexane. Hexachlorocyclohexane (HCH) is a chlorinated cyclic saturated hydrocarbon that exists in four isomers: α, β, γ and δ hexachlorocyclohexane. The g-isomer of HCH, also known as lindane, is a broad-spectrum insecticide that has been extensively used for the control of agricultural pests and for health purposes. Among HCH isomers, which are by-products of lindane industrial synthesis, β-HCH is the most recalcitrant because of its higher energetic stability due to the equatorial position of all six chlorine atoms in the chair cyclohexane conformation; in addition, few reports are available about its metabolic breakdown. For this characteristic, it is usually the predominant isomer remaining in soils and in animal tissue and can still be detected at low background environmental levels. The improper disposal of huge amounts of β-HCH led to the generation of contaminated sites in several parts of the world (Italy, Turkey, Spain, Kazakhstan, Canada, India, China, Russia, Poland, Germany, Argentine): this classifies “lindane’s contamination” as one of the environmental catastrophe of global proportions on the planetary scale. A detailed epidemiological study, ongoing since 2006, has found correlation between high blood levels of β-HCH and the occurrence of a wide range of diseases in a sample of 660 exposed patients living close the Valle del Sacco, south of Rome. The Valle del Sacco, in fact, is characterized by the presence of a large industrial conglomerate in which lindane production has been stopped in 70’s. Although the biomonitoring study highlighted a link between β-HCH contamination and the incidence of several pathological conditions, few data are currently available in the scientific literature regarding the molecular mechanism of β-HCH. For this reason, our laboratory is investigating since 2015 the intracellular effects of β-HCH with a particular focus on its impact on cancer cells. In a first published study, experiments were carried out on a panel of cells representing different human tumor types (i.e. liver, lungs, prostate, breast) associated with the expression and activation of specific receptors or kinases that are related to STAT3 activity. The experimental concentration of 10 µM for β-HCH was chosen averaging across all the plasma concentration values detected in patients under the biomonitoring study carried out in the Valle del Sacco, in order to reproduce the real exposure conditions. After evaluating the effects of β-HCH on cellular viability, different types of analysis were performed to identify the transduction cascades involved in the molecular responses to β-HCH. Obtained results established that β-HCH can activate cell-line specific pathways that all converge in STAT3 activation. Then, a special focus was placed on investigating the putative role of β-HCH in prostate cancer progression; in fact, literature data, together with our previous findings, suggest that β-HCH could have an endocrine disrupting activity by interfering with Androgen Receptor (AR) signaling. To confirm this hypothesis, LNCaP cells (hormone-sensitive prostate cancer cell line) were treated with β-HCH or testosterone in the presence or absence of the chemotherapeutic agent bicalutamide. The outcomes show that AR nuclear translocation occurs upon both β-HCH and testosterone treatment, whereas is inhibited in the presence of bicalutamide, as evidenced by immunoblotting analysis on nuclear extracts and immunofluorescence experiments. Subsequently, was verified whether β-HCH could affect the activity of AhR (Aryl Hydrocarbon Receptor), the xenobiotic sensor par excellence, in both hormone-dependent and independent tumor types. Immunofluorescence analysis evidenced the capability of β-HCH to induce AhR nuclear translocation. In addition, immunoblotting analysis were performed on cells treated with β-HCH in the presence or not of MG-132 (proteasome inhibitor) and CH223191 (AhR inhibitor) and obtained results clearly highlighted the influence of β-HCH on AhR signaling. Then, experiments were performed to investigate whether β-HCH, on par with other organochlorine pesticides, can induce oxidative stress. For this purpose, ROS production and GSSG/GSH ratio were measured, evidencing the impact of β-HCH on cellular redox homeostasis. In parallel, variations in cellular bioenergetic profile were monitored, demonstrating that β-HCH promote a metabolic shift toward aerobic glycolysis. In this altered context, β-HCH can also induce DNA damage through H2AX phosphorylation. Subsequently, the potential role of β-HCH as a contributor in tumor initiation was inspected. Experiments were carried out on a continuous normal bronchial epithelium cell line to investigate whether β-HCH could trigger cellular malignant transformation toward cancer development. For this reason, β-HCH impact was evaluated on cells viability and morphology and some markers for tumorigenesis, as Ki67 positive-cells and EGF secretion, were studied along with β-HCH activation pathways. Experimental outcomes strongly support the oncogenic potential of this molecule. Considering the capability of β-HCH to promote cell growth and tumor progression, the next question to answer is whether the exposure to β-HCH may lead to a loss of response to chemotherapeutic agents such as tyrosine kinases inhibitors. Experiments carried out on a HER2-positive lung cancer cell line revealed that β-HCH can counteract the inhibitory activity of lapatinib, leading to a higher cell proliferation rate via STAT3 activation. Further investigations were conducted using other chemotherapeutic agents (cisplatin, camptothecin and paclitaxel) and preliminar results seem to confirm the loss of sensitivity to drugs in the presence of β-HCH. From an environmental point of view, the persistence of β-HCH still represents an open question for the presence of massive illegal repositories all around the world. For this reason, β-HCH degradation through a copper-based Fenton-like method was explored by setting up a HPLC protocol under different experimental conditions. The process focused on the quantitative degradation of the parental β-HCH, since the detection of its breakdown products or transformed molecules would need a mass-spectrometry for their qualitative characterization. In parallel with the β-HCH research topic, the role of the protein STAT3 in prostate cancer was further deepened. STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3) is a converging point for many signaling cascades and has been reported constitutively activated in a wide range of solid tumors and hematological malignancies. STAT3 is a latent cytosolic transcription factor and upregulates the expression of genes involved in cell survival and proliferation upon a wide variety of stimuli, including cytokines, oncogenes, growth factors or cytosolic kinases. The dynamic biological behavior of STAT3 can explain the higher proliferation rate triggered by β-HCH through the activation of STAT3-mediated pathways. STAT3 fulfils its multifaceted molecular functions through two different intracellular mechanisms, generally referred as canonical and non-canonical pathways. The canonical activation of STAT3 is strictly dependent on its phosphorylation at the tyrosine residue 705; upon phosphorylation at Y705, induced by the binding of a ligand to its receptor, STAT3 undergoes homodimerization to form an active dimer that can translocate to nucleus and mediates its transcriptional activity. Besides its well-described canonical signaling, STAT3 can be subjected to alternative post-translational modifications. In addition, recent studies assessed the involvement of STAT3, by means of both its canonical and non-canonical pathway, in the metabolic shift toward aerobic glycolysis known as Warburg Effect, which is typical of the more aggressive tumor phenotypes. On the basis of these premises, the existence of a link between PTMs and specific STAT3-mediated pathways was investigated in LNCaP (less aggressive PCa form) and DU-145 (more aggressive) cells performing experiments that simulated inflammatory and oxidative-stress conditions. Cells were treated with IL-6 to induce an inflammatory response, whereas tert-butyl hydroperoxide (t-BHP) was used to simulate oxidative stress. Obtained results on cellular models confirmed the relationship between STAT3 PTMs and cellular conditions, thereby reinforcing the hypothesis that PTMs can drive intracellular responses through STAT3-mediated signaling pathways. Thus, it is possible to identify STAT3 PTMs and STAT3 modulators as suitable markers or targets for PCa prevention, diagnosis and therapy. Then the role of STAT3 in prostate cancer energy metabolism was further investigated, with particular focus on the protein SHMT2 (Serine-Hydroxymethyltransferase). Results indicate that SHMT2 is an active player in STAT3 signaling and that its expression is upregulated by the JAK2/STAT3 canonical pathway upon IL-6 stimulation. Experiments were carried out on two different prostate cancer cell lines, LNCaP (less aggressive) and DU145 (more aggressive). The observation was extended to PCa formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue sections obtained from total prostatectomies: collected specimens are characterized by a different Gleason score, ranging from 6 (less aggressive) to 9 (more aggressive). In both cell lines, STAT3 activation mode, the amount and distribution of PKM2, SHMT2, and HIF-1a proteins, as well as the cellular metabolic conditions, were evaluated in the presence or absence of IL-6-induced inflammation. Expression levels of PKM2, SHMT2, and HIF-1a, together with interleukin-6, were also analyzed utilizing normal and tumor FFPE tissues. / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Introduction La République Démocratique du Congo (RDC) est caractérisée actuellement par une fréquence élevée des maladies cardiovasculaires, dont l’hypertension artérielle (HTA) constitue un facteur de risque majeur. Ceci sous-entend entre autres un faible contrôle de l’HTA qui peut être influencé par plusieurs facteurs à savoir le système de santé, les prestataires des soins et les patients. D’où une série d’études a été menée pour identifier les barrières au contrôle de la pression artérielle en vue de contribuer à la réduction de la morbidité et de la mortalité cardiovasculaire en RDC. Et cela par la définition d’un cadre de prise en charge globale du risque cardiovasculaire au niveau des structures sanitaires de base qui constituent le premier contact entre la communauté et le système de santé.Méthodes Six études ont été menées dans la ville de Kinshasa de 2013 à 2015. La première étude, était transversale et a été conduite auprès des prestataires de soins pour évaluer leur niveau de connaissances et pratiques sur les facteurs de risque cardiovasculaires en général et l’HTA en particulier. Au total, 102 infirmiers de 36 centres de santé (CS) ont été interviewés.La deuxième étude également transversale, était conduite auprès des malades hypertendus suivis dans les CS de la ville de Kinshasa pour déterminer les facteurs associés à la non-adhérence au traitement, qui est l’un des principaux facteurs de risque de non contrôle de l’hypertension artérielle. Au total 395 patients hypertendus sous traitement médical étaient interviewés.La troisième étude, transversale a été effectuée auprès de 280 patients hypertendus suivis dans les CS pour mesurer la fréquence du recours à la médecine alternative et complémentaire ainsi que leurs facteurs de risque.La quatrième étude avait comme objectif de déterminer l’association entre le contrôle de l’HTA et le niveau des soins. Pour ce faire, une étude transversale a été conduite auprès de 260 patients hypertendus dont 130 suivis par les médecins dans les formations sanitaires (FOSA) de deuxième échelon (Hôpitaux Généraux de Référence) et 130 autres suivis par les infirmiers au niveau des CS. La cinquième étude a consisté en une étude des caractéristiques de base des patients avant de mettre en place une intervention. Au total 974 patients hypertendus éligibles enrôlés dans les ménages ont été référés dans les CS et enquêtés. Cette étude avait comme objectif de déterminer la fréquence des facteurs de risque cardiovasculaire (FRCV) auprès des malades hypertendus et leurs facteurs associés.La sixième étude a consisté en un essai randomisé par grappes, 974 patients enrôlés ont été répartis dans 12 centres de santé dont six étaient affectés de manière aléatoire à l’intervention et six autres ont servi de contrôle. Les patients ont été suivis pendant une année et l’objectif était de déterminer l’effet de la formation des prestataires des soins sur le contrôle de la pression artérielle et des autres FRCV. Résultats L’enquête auprès des prestataires de soins a trouvé que seuls 9,5% avaient déjà bénéficié d’une formation en cours d’emploi sur les FRCV, à peine près de la moitié (51,7%) disposaient des protocoles pour la prise en charge de l’HTA. Moins d’un quart connaissaient le seuil de positivité de l’HTA (22,5%), du diabète (3,9%) et de l’obésité (2,9%). Seuls 14,7% connaissaient les objectifs thérapeutiques pour un patient hypertendu non compliqué. Les antihypertenseurs utilisés n’étaient pas appropriés selon les recommandations utilisées.La deuxième enquête a trouvé une faible proportion de patients hypertendus ayant une pression artérielle contrôlée (15,6 % ;IC95 % :12,1%–20,0%) ;en outre plus de la moitié n’étaient pas adhérents au traitement médical (54,2 % ;IC 95 % :47,3–61,8). L’étude a trouvé que la non adhérence au traitement était liée au non contrôle de la PA (OR = 2,0; IC 95 % :1,1–3,9). Les facteurs associés à la non adhérence étaient le faible niveau de connaissances des complications de l’HTA (OR = 2,4; IC 95 % :1,4–4,4) ;le fait de ne pas bénéficier des séances d’éducation sanitaire (OR = 1,7; IC 95 % :1,1–2,7) ;la non disponibilité des antihypertenseurs dans la formation sanitaire (OR = 2,8; IC 95 % :1,4–5,5); la présence des effets secondaires (OR = 2,2; IC 95 % :1,4–3,3) et le fait de prendre des médicaments non prescrits par les prestataires de soins (OR = 2,2; IC 95 % :1,2–3,8).La troisième étude a trouvé que plus d’un quart de patients hypertendus recouraient aux soins alternatifs et complémentaires (26,1% ;IC 95 %: 20,7% - 31,8%). Les types de soins alternatifs les plus cités étaient l’usage des plantes médicinales (42,5%) et la prière (35,6%). Les facteurs associés à ce recours étaient la mauvaise perception de la curabilité de l’HTA (OR = 2,1; IC 95 %: 1,1-3,7) et l’expérience des effets secondaires (OR = 2,9; IC 95 %: 1,7-5,1). La mauvaise perception de la curabilité de l’HTA était quant à elle associée à la religion et à la durée de l’HTA.La quatrième étude a trouvé qu’il n’y avait pas de différence en termes de contrôle de la pression artérielle entre les malades suivis au niveau des FOSA de deuxième échelon et ceux suivis au niveau des FOSA de premier échelon (CS) (23,8% vs 22,3%, p = 0.771) quoi qu’en moyenne par mois dans un CS, un malade dépense 7,7 $US ± 0,6 $US alors que dans une FOSA de deuxième échelon cette dépense moyenne est de 34,2 $US ±3,34$US. Les facteurs associés au non contrôle de la PA étaient la présence de comorbidité(OR= 10,3; IC95%: 3,8 – 28,3) et le type d’antihypertenseurs utilisé (OR= 4,6; IC95%: 1,3 –16,1).La cinquième étude a trouvé une prévalence importante d’autres facteurs de risque cardiovasculaire auprès des malades hypertendus. La consommation de légumes et de fruits était à 65,8% ;la surcharge pondérale /obésité à 57,7% ;l’usage non modéré de l’alcool à 43,9% ;l’inactivité physique à 42,3% et la consommation du tabac était de 5,4%. Ces facteurs de risque étaient différemment repartis en fonction du milieu de résidence. La fréquence de l’obésité chez les malades hypertendus était quasiment le double de celle de la population générale. La surcharge pondérale/obésité était associée au sexe féminin en milieu urbain (OR= 2,7; IC 95%: 1,6-4,9) tandis qu’en milieu rural, elle était associée au haut niveau d’étude (OR= 3,0; IC 95%: 1,1-7,8), à l’inactivité physique (OR=5,3; IC 95%: 1,2-23,6) et à un régime alimentaire pauvre en légumes et fruits (OR= 3,3; IC 95%: 1,1-10).La dernière étude, l’essai randomisé par grappes, a trouvé que la formation des prestataires des soins a eu un effet sur la réduction de la pression artérielle dans le groupe intervention par rapport au groupe contrôle :-8,1 mm Hg de différence entre la PAS du recrutement et celle du douzième mois. L’étude a également rapporté que les patients du groupe intervention avaient plus de probabilité d’être contrôlés à toutes les visites que ceux du groupe contrôle (OR= 6,4 ;IC 95%: 1,8-22,5). L’étude n’a pas trouvé d’effet de l’intervention sur les autres facteurs de risque cardiovasculaire, excepté pour la consommation de légumes où les patients du groupe intervention avaient deux fois plus de chance d’augmenter la quantité des légumes consommée que ceux du groupe contrôle (OR=2,2; IC 95%: 1,3-3,8).Discussion et conclusion Ces études ont montré que les barrières au contrôle adéquat de la pression artérielle décrites dans la littérature s’appliquent pour la ville de Kinshasa en RDC. La faiblesse du système de santé peut expliquer en grande partie ce faible contrôle de la PA. Le fait de ne pas disposer des protocoles de prise en charge et de ne pas bénéficier d’une formation en cours d’emploi peut expliquer le faible niveau des connaissances et de pratiques des prestataires des soins. Ces derniers, non informés, ne peuvent rien transmettre aux patients comme informations sur leur maladie. Du côté patients, il a été noté un problème de faible motivation, et d’insatisfaction qui se sont traduites par la faible adhérence au traitement ;et au recours aux soins complémentaires et alternatifs. En dépit du fait que l’intervention ait corrigé certaines barrières, la proportion de contrôle de la PA est restée faible au bout de 12 mois de suivi. Et malgré l’accessibilité financière et géographique, il y a eu une très faible utilisation spontanée des services par les malades hypertendus. Il est donc possible d’améliorer le contrôle de l’hypertension artérielle dans les structures sanitaires du niveau primaire de la ville de Kinshasa, en mettant en place un protocole simple de prise en charge, un outil d’éducation des patients mais il est important d’utiliser une approche plus centrée sur le patient pour améliorer sa motivation. / Doctorat en Santé Publique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

An important quest in genomics since the publication of the first complete human genome in 2003 has been its functional annotation. DNA holds the instructions to the production of the components necessary for the life of cells and organisms. A complete functional catalog of genomic regions will help the understanding of the cell body and its dynamics, thus creating links between genotype and phenotypic traits. The need for annotations prompted the development of several bioinformatic methods. In the context of promoter and first exon predictors, the majority of models relies principally on structural and chemical properties of the DNA sequence. Some of them integrate information from epigenomic and transcriptomic data as secondary features. Current genomic research asserts that reference genome annotations are far from being fully annotated (human organism included).Physicians rely on reference genome annotations and functional databases to understand disorders with genetic basis, and missing annotations may lead to unresolved cases. Because of their complexity, neurodevelopmental disorders are under study to figure out all genetic regions that are involved. Besides functional validation on model organisms, the search for genotype-phenotype association is supported by statistical analysis, which is typically biased towards known functional regions.This thesis addresses the use of an in-silico integrative analysis to improve reference genome annotations and discover novel functional regions associated with neurodevelopemental disorders. The contributions outlined in this document have practical applications in clinical settings. The presented bioinformatic method is based on epigenomic and transcriptomic data, thus excluding features from DNA sequence. Such integrative approach applied on brain data allowed the discovery of two novel promoters and coding first exons in the human DLG2 gene, which were also found to be statistically associated with neurodevelopmental disorders and intellectual disability in particular. The application of the same methodology to the whole genome resulted in the discovery of other novel exons expressed in brain. Concerning the in-silico method itself, the research demanded a high number of functional and clinical datasets to properly support and validate our discoveries.This work describes a bioinformatic method for genome annotation, in the specific area of promoter and first exons. So far the method has been applied on brain data, and the extension to the whole body data would be a logical by-product. We will leverage distributed frameworks to tackle the even higher amount of data to analyse, a task that has already begun. Another interesting research direction that came up from this work is the temporal enrichment analysis of epigenomics data across different developmental stages, in which changes of epigenomic enrichment suggest time-specific and tissue-specific functional gene and gene isoforms regulation. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

It has been generally recognised that sick children have an increased risk on malnutrition. An activated immune system requires more nutrients while illness is often associated with a lower absorption and decreased consumption because of lack of appetite. When these increased needs are not balanced with an adequate availability of nutrients, the sick child is at higher risk of developing malnutrition.Médecins Sans Frontières investigated the question whether this process is mitigated by simple short term nutritional supplementation given to sick children alongside medical treatment. Three Randomised Controlled Trials (RCT’s) were conducted. The first, in Democratic Republic of Congo, was a pilot; 180 children with malaria were randomised in 2 arms: 1 group receiving 2 weeks of ready to use therapeutic food (RUTF) and a control group. The children were followed for a period of 4 weeks. Children in the RUTF group showed a higher weight gain in the first 14 days compared to the control group, at day 28 the weight gain in both groups was similar.Thereafter, 2 RCT’s were implemented in Uganda and Nigeria using a similar methodology. Children with malaria, lower respiratory tract infection or diarrhoea (sample size of 2202) were randomised in three groups: supplemented with 2 weeks of RUTF, supplemented with 2 weeks of micronutrient powder (MNP), and not receiving supplementation after each disease episode. The incidence of malnutrition was compared after an observation period of 6 months. The trial in Uganda showed a reduction in malnutrition in the RUITF group with 31%, while in Nigeria, there was no significant reduction in the RUTF group. The MNP group did not show reduction in malnutrition in any site. In the group of moderate malnourished children the RUTF and MNP supplementations were not effective in preventing deterioration to severe malnutrition. However, when the studies were combined the RUTF group showed a lower mortality compared to the MNP group.Multi-variate analysis did not show a reduction of incidence of malnutrition in the supplementation groups. A strong association with morbidity was found. A higher frequency of diarrhoea was associated with an increased incidence of malnutrition. The association with malaria episodes was mixed; it was associated with a higher incidence of malnutrition in Kaabong, but in Goronyo a higher frequency of malaria decreased the incidence of malnutrition. In addition, a more frequent monitoring of the children and treatment of their illnesses was associated with a decreased incidence of malnutrition.The difference in effectiveness of supplementation between the sites can be explained by differences in food security and level of morbidity. It is argued that the fragile food security in Kaabong limits the supply of nutrients, and therefore supplementation with RUTF was effective. In Goronyo the high frequency of morbidity limits convalescence and therefore supplementation was not effective.It is likely that malnutrition is more effectively prevented when several interventions are combined like water and sanitation to prevent diarrhoea, malaria chemoprophylaxis and preventative and curative health and nutrition interventions.This dissertation will present the background, the methods of the trials and the results, followed by a discussion on the implications for programming and research. / Doctorat en Santé Publique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les tumeurs sont, au moins en partie, des maladies de la régulation du cycle cellulaire. Le point de restriction (R) est un point fondamental du cycle cellulaire où les cascades de signalisation mitogéniques (y compris leurs perversions oncogènes) et l'état métabolique des cellules sont intégrés pour engager le cycle de division cellulaire. Les CDK4 et CDK6 sont les premières CDKs à être activées en réponse aux signaux de prolifération cellulaire.En initiant la phosphorylation inactivatrice de l'oncosuppresseur central pRb, les CDK4 / 6 liées aux cyclines D jouent un rôle essentiel dans le passage du point R et donc dans la décision de multiplication cellulaire, en particulier dans la plupart des cellules cancéreuses dans lesquelles l'activité de CDK4 est fortement dérégulée. Les médicaments inhibiteurs de CDK4 / 6 sont maintenant évalués dans la plupart des cancers dans de nombreux essais cliniques. Le plus avancé (Palbociclib-PD0332991) a été approuvé en 2015 par la FDA pour le traitement des cancers métastatiques du sein. Notre groupe a identifié la phosphorylation activatrice sur la Thr172 comme l'étape hautement régulée qui détermine l'activation de CDK4. La question de savoir si les phosphorylations de CDK4 et de CDK6 sont catalysées par la seule « CDK-activating kinase » (CAK, cycline H-CDK4-Mat1) reste incertaine. En utilisant des cellules de cancer colorectal (HCT116) exprimant une version de CDK7 spécifiquement inhibable (dite « analog sensitive »), nous avons participé à une étude qui démontre, d’une part, une implication cruciale de la CDK7 dans la phosphorylation / activation de CDK4 et CDK6 et, d’autre part, l'existence de kinase(s) activatrice(s) de la CDK4 différente(s) de la CDK7. De plus, cette étude a démontré que l'activité de la CDK7 était conditionnée, au moins en partie, par la liaison de p21 à la CDK4, laquelle augmentait en réponse à l'inhibition de CDK7. L’augmentation de cette liaison coïncidait avec la disparition de la phosphorylation la plus abondante de p21, que nous avons localisée (par des analyses d'électrophorèse bidimensionnelle) sur la Ser130 et que nous avons montré être catalysée par la CDK4 et la CDK2. De manière surprenante, la phosphorylation sur Ser130 de p21 était inhibée non seulement par l'inhibition de CDK7, mais également par la Roscovitine et le CR8 (inhibiteurs de CDK2) et le Palbociclib. Ensemble, ces observations suggèraient que l'inactivation de pRb et le passage de R sont contrôlés par des mécanismes de rétroaction positive dépendants de la CDK7 médiés par la phosphorylation de la p21 par la CDK4 et la CDK2 pour faciliter et maintenir l'activation de la CDK4. De plus, nos résultats confirmaient l’hypothèse de l'existence kinase(s) activatrice(s) de la CDK4 autre(s) que la CDK7. Notre groupe avait démontré précédemment que la régulation de la phosphorylation de la CDK4 ne s'applique pas à son homologue CDK6, ce qui s'expliquait par l'absence d'une proline critique dans le domaine phosphoaccepteur (QMALTPVVVT dans CDK4 vs QMALTSVVVT dans CDK6). Ces données iniquaient que la ou les kinase (s) responsable(s) de la phosphorylation sur Thr172 de CDK4 devrai(en)t être dirigée(s) par la proline 173 uniquement présente dans la CDK4 (« proline-directed kinase(s) »).L'objectif principal de cette thèse est l'identification de kinase(s) impliquée(s) dans cette phosphorylation. Nous avons donc sélectionné une liste restreinte de « proline-directed kinases » (PDK) requises pour la prolifération cellulaire. Parmi celles-ci, les JNK, qui sont des PDKs, sont des interacteurs de p21 et CDK4 et peuvent avoir un rôle oncogène. De manière importante, nous avons observé que les JNKs, mais pas la CAK / CDK7, phosphorylaient in vitro la p21 et la CDK4 liée aux cyclines D. Les JNKs phosphorylaient également p21 sur ses trois sites P-T/S (Thr57, Ser130, Ser98). En mutant ces sites (T57A, S130A, S98A, T57A / S130A), nous avons montré que la phosphorylation de p21 par les JNKs n'est pas nécessaire pour la phosphorylation et l'activation de la CDK4 liée à p21. Par conséquent, in vitro les JNKs peuvent activer les complexes CDK4 liés à la p21, en agissant d’une part comme des kinases phosphorylant directement la CDK4 dans les complexes de cycline D-CDK4 stabilisés par la liaison de p21 et d’autre part en phosphorylant indépendamment des résidus de p21 impliqués dans l'activation de CDK4 dépendante de la CAK. Pour démontrer la relevance in vivo du rôle des JNKs comme kinases activatrices de la CDK4, nous avons analysé l'effet de leur inhibition dans les lignées de cellules tumorales T98G et MCF-7, les cellules MEF et des cellules CHO transfectées: dans tous ces cas, l'inhibition des JNKs, y compris l'inhibition spécifique de l'activité de JNK2 par une approche de génétique chimique en collaboration avec le groupe de Roger Davis, a réduit l'entrée du cycle cellulaire, et la phosphorylation et l'activation des complexes de cycline D1-CDK4. De manière intéressante, l’activation des complexes de cycline D3-CDK4 n’était pas affectée par l’inhibition des JNKs, apparemment parce que ces complexes étaient principalement associés à la p27 plutôt qu’à la p21. Mis ensemble, ces différents résultats nous amènent à proposer un nouveau modèle dans lequel différentes kinases activatrices de la CDK4, y compris les JNKs (indépendamment des phosphorylations de p21) et la CAK/CDK7 (de manière dépendante des phosphorylations de p21), coopèrent pour initier et maintenir l'activation de la CDK4 et générer la décision du cycle cellulaire. Cette nouvelle compréhension pourrait révéler de nouveaux mécanismes ciblables dans une perspective thérapeutique anti-cancéreuse. / Tumors are, at least in part, diseases of cell cycle regulation. The restriction (R) point is a fundamental point of the cell cycle in which mitogenic signaling cascades (including their oncogenic perversions) and cell metabolic status are integrated to commit the cell division cycle. CDK4 and CDK6 are the first CDKs to be activated in response to cell proliferation signals. By initiating the inactivating phosphorylation of the central oncosuppressor pRb, cyclin D-bound CDK4/6 play an essential role at the passage through R and thus in the cell multiplication decision, especially in most cancer cells in which CDK4 activity is highly deregulated. CDK4/6 inhibitory drugs are now evaluated in many clinical trials against most cancers, and the most advanced (Palbociclib-PD0332991) was approved in 2015 by FDA for treatment of metastatic breast cancers. Our group has identified the activating Thr172 phosphorylation as the highly regulated step that determines CDK4 activation. Whether CDK4 and CDK6 phosphorylations are catalyzed by the sole CAK (cyclin H-CDK7-Mat1) remains unclear. In analogue-sensitive CDK7 (as/as) mutant HCT116 cells in which CDK7 can be specifically inhibited, we participated to a study demonstrating a crucial CDK7 involvement in phosphorylation/activation of CDK4 and CDK6 and existence of non-CDK7 CDK4 activating kinase(s). Moreover, this study demonstrated that CDK7 activity was conditioned, at least in part, by p21 binding to CDK4, which increased in response to CDK7 inhibition. This coincided with disappearance of the most abundant phosphorylation of p21, which was localized (by 2D-gel electrophoresis analyses) at Ser130 and found to be catalyzed by both CDK4 and CDK2. Surprisingly, Ser130 p21 phosphorylation was not inhibited only by CDK7 inhibition, but also by Roscovitine and CR8 (CDK2 inhibitors) and Palbociclib. All together, these observations suggested that pRb inactivation and R passage are controlled by CDK7-dependent positive feedbacks mediated by p21 phosphorylation by CDK4 and CDK2 to sustain CDK4 activation. Importantly, these results confirm the hypothesis of a non-CDK7 CDK4 activating kinase(s). Our group has previously demonstrated that the regulation of CDK4 phosphorylation does not apply to its homologue CDK6, which was explained by the lack of a critical proline in the phospho-acceptor domain (QMALTPVVVT in CDK4 vs QMALTSVVVT in CDK6). These data have indicated that the activity of kinase(s) responsible for Thr172 phosphorylation of CDK4 should be directed by the unique proline 173 of CDK4 (proline-directed kinase(s)). The primary objective of this thesis is the identification of kinase(s) involved in this phosphorylation. We thus selected a shortlist of proline-directed kinases (PDKs) required for cell proliferation. Among them JNKs, which are PDKs, are interactors of p21 and CDK4 and can have an oncogenic role. Importantly, we observed that JNKs, but not CAK/CDK7, did phosphorylate CDK4 in vitro in their complexes with cyclins D stabilized by p21 binding. JNKs also phosphorylated p21 in the three P-T/S phosphorylation sites (Thr57, Ser130, Ser98). Mutating p21 phosphorylation sites (T57A,S130A,S98A,T57A/S130A) we also demonstrated that in vitro, the phosphorylation of p21 by JNKs is not required for the phosphorylation and activation of p21-bound CDK4. Therefore, in vitro JNKs might activate p21-bound CDK4 complexes by acting as a direct CDK4-activating kinases for cyclin D-CDK4 complexes stabilized by p21 binding and also by independently phosphorylating p21 residues involved in CAK-dependent activation of CDK4. To demonstrate the relevance of the role of JNKs as possible CDK4-activating kinases in vivo we analyzed the effect of their inhibition in T98G and MCF-7 tumor cell lines, MEFs and transfected CHO cells: in all these cases, inhibition of JNKs, including specific inhibition of JNK2 activity by a chemical genetic approach in collaboration with Roger Davis group, reduced the cell cycle entry and phosphorylation and activation of cyclin D1-CDK4 complexes. Interestingly, the activation of cyclin D3-CDK4 complexes was not affected by the JNK inhibition, apparently because these complexes were mainly associated with p27 instead of p21. Putting together all these results, we propose a new model in which different CDK4-activating kinases, including JNKs (independently of p21 phosphorylation) and CAK/CDK7 (dependently on p21 phosphorylation), cooperate to initiate and maintain the activation of CDK4 and generate the cell cycle decision. This new understanding may reveal new druggable mechanisms and anti-cancer therapeutic targets. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished