The research of new therapeutic strategies for cardiovascular diseases has seen in the last 15 years the introduction of a new participant: pericardial adipose tissue (PAT). This tissue is able to modulate cardiac function and its volume was sometimes linked to risk of cardiovascular diseases. Moreover, adipose-derived stem cells (ASCs) isolated from PAT are considered as the best suitable for new regenerative strategies aiming at healing ischemic myocardium. Although the interests in understanding the functions and the formation of pericardial adipose tissue are high, the current knowledge on this tissue is still scarce. In this work, the starting point was the consideration that nucleotide receptors are established regulators of many biological functions, including the differentiation of adult mesenchymal stem cells, immunity and inflammatory process. The P2Y4 receptor has been recently recognized as a negative regulator of cardiac fat formation and ASCs differentiation. The purpose of this thesis was to analyze the involvement of the nucleotide receptor P2Y2 in the formation of pericardial adipose tissue (PAT) and its ASCs differentiation. We also investigated the possible contribution of this receptor to the functions of recently discovered fat-associated lymphoid clusters (FALCs). Our study analyzed the PAT of mice deficient for P2Y2 at basal conditions and in a model of myocardial infarction. P2Y2-null mice showed a lower mass of PAT compared to WT, which was correlated with decreased adipogenic differentiation and maturation potential of pericardial ASCs in vitro. PAT of basal P2Y2-deficient mice displayed a reduced density of FALCs due to a reduced number of B cells. RNA-sequencing experiments identified many P2Y2 target genes in PAT linked to immunomodulation. We identified a polarization of FALCs macrophages towards anti-inflammatory M2c subtype in P2Y2-null mice. We correlated it with a decreased number of follicular helper T cells, known to contribute to B cell expansion in germinal centers. These data could be correlated with increased apoptosis of B lymphocytes. The data obtained using the mouse infarct model confirmed an expected enlargement of pericardial FALCs in ischemic conditions. P2Y2-null mice were characterized by a reduced expansion of B cells and myeloid cells migration in PAT. These results suggested a participation of P2Y2 receptor in regulating the post-MI inflammatory response by modulating the leukocytes populations in the pericardial adipose tissue’s lymphoid clusters. The effect of P2Y2 on PAT post-ischemic inflammatory state could contribute to the P2Y2-mediated cardioprotective effect of UTP described in previous literature. Our study defines P2Y2 nucleotide receptor as a regulator of the formation of pericardial fat and its inflammatory status in ischemic conditions. P2Y2 receptor could represent an interesting therapeutic target for the regulation of PAT functions before and after MI. In general, a better comprehension of PAT and its consideration in the post-ischemic regeneration process could lead to the development of new therapeutic strategies for treating cardiovascular diseases and the adjustment of existing therapies. / Durant les 15 dernières années, un nouvel arrivant a fait son apparition dans la recherche de nouvelles approches thérapeutiques dans le domaine cardiovasculaire: le tissu adipeux cardiaque. Ce tissu est capable de moduler les fonctions cardiaques et son volume a pu être associé parfois à un risque de maladie cardiovasculaire. De plus, les cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASCs) cardiaque sont considérées comme les mieux appropriées pour des stratégies thérapeutiques visant la réparation du myocarde ischémié. Bien que la compréhension de la fonction et de la formation du tissu adipeux cardiaque présente un intérêt majeur, la connaissance actuelle de ce tissu particulier est encore assez limitée. Pour le présent travail, le point de départ a été l’observation que les récepteurs nucléotidiques sont des régulateurs établis de nombreuses fonctions biologiques, incluant la différentiation des cellules souches mésenchymateuses et plus généralement la régulation de la réponse immune et inflammatoire. Le récepteur P2Y4 a été récemment reconnu comme un régulateur négatif de la formation du tissu adipeux cardiaque et de la différentiation des ASCs. Le but de cette thèse a été l’étude de l’implication du récepteur nucléotidiques P2Y2 dans la formation du tissu adipeux péricardique (TAP) et la différentiation des ASCs. Nous avons également investigué la contribution possible de ce récepteur dans la fonction des structures leucocytaires associées au tissu adipeux appelées FALCS pour fat-associated lymphoid clusters.Nous avons étudié le TAP de souris déficientes pour le récepteur P2Y2 à l’état de base et dans un modèle d’infarctus du myocarde. Les souris P2Y2 knock-out (KO) présentent une masse réduite du TAP corrélée avec le fait que l’absence du P2Y2 diminue la différentiation adipogénique et le potentiel de maturation des ASCs péricardiques in vitro. Le PAT des souris P2Y2 KO présentent une diminution de la densité de FALCs à l’état de base, principalement due à un nombre réduit de lymphocytes B, potentiellement corrélé à une apoptose accrue observée dans ces cellules. Nos expériences de RNA-sequencing ont identifié de nombreux gènes cibles du P2Y2 dans le PAT impliqués dans l’immunomodulation. Nous avons identifié une polarisation des macrophages de type M2c dans les FALCs de souris P2Y2 KO. Nous l’avons corrélée avec une diminution des lymphocytes T helper folliculaires connus pour contribuer à l’expansion des lymphocytes B dans les centres germinaux. Les données obtenues dans le modèle d’infarctus chez la souris ont confirmé une augmentation des FALCs péricardiques dans les conditions d’ischémie cardiaque. Les souris P2Y2 KO sont caractérisées par une expansion réduite des lymphocytes B et des cellules myéloïdes dans le TAP. Ces résultats suggèrent une participation du récepteur P2Y2 dans la régulation de la réponse inflammatoire post-infarctus par la modulation des populations leucocytaires dans les clusters lymphocytaires du tissu adipeux cardiaque. L’effet du P2Y2 sur l’état inflammatoire post-ischémique pourrait contribuer à l’effet cardioprotecteur de l’UTP médié par le P2Y2 et précédemment décrit dans la littérature.Notre étude définit le récepteur nucléotidique P2Y2 comme un régulateur de la formation du tissu adipeux péricardique et de son niveau inflammatoire dans des conditions ischémiques. Le récepteur P2Y2 pourrait représenter une cible thérapeutique intéressante pour la régulation des fonctions du PAT avant et après infarctus du myocarde. Plus généralement, une meilleure compréhension du tissu adipeux cardiaque et de son implication dans le processus de régénération cardiaque pourrait mener au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement de maladies cardiovasculaires et à l’ajustement de thérapies déjà existantes. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) were first discovered in bone marrow and can be isolated from “virtually all organs”. They could participate in tissue maintenance and self-renewing process. They are able to adhere to plastic surfaces and acquire a fibroblastic shape when isolated. They are characterized by a particular phenotype and are able to differentiate into several cell types if cultivated in a specific induction medium. These characteristics were defined on MSC in culture and do not represent how they may be in situ.MSC present particular properties. They can secrete growth factors and several cytokines that give them a trophic activity on one hand and the ability to modulate the immune system on the other hand. They are also able to differentiate. These different properties make them an attractive candidate for cell therapy.MSC are already the focus of several pre-clinical and clinical studies. Nevertheless, the results of these studies are difficult to interpret due to limited understanding of their basic biology. MSC are poorly defined in situ and are heterogeneous. Their heterogeneity is dictated by their tissue of origin and cell preparation. To date, there is no standard protocol for MSC isolation and culture. This leads to numerous questions regarding patient safety, and these questions require answers.The first part of the work deals with the methods used to optimize the extraction of MSC and purification from adipose tissue, one of the main sources of autologous MSC with bone marrow. Classical methods require an enzymatic digestion step. The enzyme used and the duration of adipose tissue digestion time can induce cellular alterations and modify cell functions. Moreover, the addition of a xenobiotic increases the risk of contamination and complicates the monitoring of good manufacturing practices (GMP). We propose a method that does not require this enzymatic digestion step while being easier, safer, faster, gentler and less expensive. Compared to the classical enzymatic method, our method yields an equivalent number of MSC from adipose tissue while preserving their properties.The second part of this work focuses on the characterization of the MSC subpopulations from adipose tissue and compares them to those from bone marrow, which are the historical gold standard. The study made it possible to deepen the knowledge of MSC surface markers in situ from these 2 sources. It also evaluated the various properties of the isolated subpopulations thanks to the cell surface markers CD271, SUSD2, MSCA-1, CD44 and CD34. We showed that MSC from bone marrow express MSCA-1, CD271 and SUSD2 markers in situ. We also found that a population clearly positive for the CD34 does exist in situ with different properties compared to those of the unselected populations or the negative counterpart. 2 populations that are negative and positive for CD44 also exist with similar properties.In contrast to bone marrow MSC, only one selection was able to effectively isolate MSC from adipose tissue by a positive selection based on the expression of CD34. We also isolated a CD271+ population but only from lipoaspirate samples and not from abdominoplasty samples. Collectively, our results suggest that MSCA-1 seems to be the best marker through which to isolate MSC from bone marrow and that CD34 is the only marker able to positively isolate cells from adipose tissue. Thus, we show that the MSC from the different sources share similar properties although they have specific characteristics. The choice of the source and of the marker with which to isolate a particular subpopulation is important depending on their intended clinical use. / Les cellules stromales mésenchymateuses multipotentes (CSM) ont été mises en évidence dans la moelle osseuse et peuvent être isolées de « virtuellement tous les organes ». Elles participeraient à la maintenance et au renouvellement des tissus. Une fois isolées, elles sont capables d’adhérer à des surfaces en plastique en prenant une forme fibroblastique. Elles sont caractérisées par un phénotype particulier et peuvent se différencier en divers types cellulaires lorsque cultivées dans un milieu d’induction spécifique. Ces caractéristiques ont été définies sur les CSM en culture et ne reflètent pas forcément ce qui se passe in situ.Les CSM présentent des propriétés particulières. Elles peuvent sécréter des facteurs de croissance ainsi que de nombreuses cytokines qui leur permettent d’une part d’avoir une activité trophique et d’autre part de moduler le système immunitaire. Elles sont aussi capables de se différencier. Ces différentes propriétés les rendent particulièrement attractives pour la thérapie cellulaire.Les CSM font déjà l’objet de nombreuses études pré-cliniques et cliniques dont les résultats sont difficilement interprétables car nous n’avons à l’heure actuelle qu’une compréhension limitée de leur biologie de base. Les CSM sont encore mal définies in situ et sont hétérogènes. Cette hétérogénéité provient de leur différence d’origine et de leur préparation cellulaire :il n’existe aucune standardisation des protocoles d’isolation et de culture. Cette hétérogénéité entraine de nombreuses questions relatives à la sécurité du patient qui doivent être élucidées.La première partie de ce travail cherche à optimiser les méthodes d’extraction et de purification des CSM du tissu adipeux humain, la principale source de CSM autologues avec la moelle osseuse. Les méthodes classiques requièrent une étape de digestion enzymatique dont l’enzyme utilisée et le temps de digestion du tissu adipeux peuvent induire des altérations cellulaires et modifier leurs fonctions. De plus, l’adjonction de xénobiotiques augmente le risque de contamination et complique le suivi des bonnes pratiques de fabrication (BPF). Nous proposons une méthode qui s’affranchit de cette étape de digestion enzymatique tout en étant plus facile, plus sûre, plus rapide, moins chère et moins traumatisante pour les cellules. Elle permet d’obtenir un nombre tout aussi important de CSM du tissu adipeux que la méthode enzymatique classique en préservant leurs propriétés.La deuxième partie de ce travail vise à caractériser les sous populations de CSM du tissu adipeux humain en les comparant à celles de la moelle osseuse, source de référence historique. Cette étude a permis d’approfondir la connaissance des marqueurs de surface des CSM de ces 2 sources in situ, tout en évaluant les différentes propriétés des sous-populations isolées grâce aux marqueurs de surface CD271, SUSD2, MSCA-1, CD44 et CD34. Nous avons montré que les CSM de la moelle osseuse expriment les marqueurs MSCA-1, CD271 et SUSD2 in situ et qu’il existait une sous-population clairement positive pour le CD34 avec des propriétés différentes de celles de la population non sélectionnée ou négative pour ce marqueur. Il existe aussi 2 sous-populations positive et négative pour le CD44 avec des propriétés similaires.Contrairement aux CSM de la moelle osseuse, une seule sélection a permis d’isoler efficacement les CSM du tissu adipeux par une sélection positive sur base de l’expression du CD34. Nous avons pu aussi isoler une population CD271+ mais seulement des prélèvements de lipoaspirations et non des abdominoplasties.Au vu de nos résultats, MSCA-1 semble le meilleur marqueur pour isoler les CSM de la moelle osseuse tandis que le CD34 est le seul marqueur capable d’isoler positivement celles du tissu adipeux. Ainsi, nous montrons que les CSM issues de différentes sources partagent des propriétés similaires avec cependant des caractéristiques propres. Le choix de la source et du marqueur pour isoler une sous-population sont donc importants en fonction de leur utilité clinique envisagée. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

The accurate maintenance of genomic integrity in stem cells (SCs) is essential for tissue homeostasis and its deregulation leads to developmental defects, cancer and ageing. We have shown that Brca1, key homologous recombination (HR) gene and critical regulator of the choice of the DNA double strand break (DSB) repair pathway, is specifically required for hair follicle formation and the establishment and maintenance of adult hair follicle SC pool in a conditional knock-out (CKO) mouse model. Brca1 loss leads to DNA damage-induced cell death in the hair follicle (HF), particularly in the matrix transient amplifying progenitors and moderately so in prospective quiescent adult HF SCs. This cell loss causes compensatory hyper-proliferation of the prospective HF SCs and their subsequent depletion. In striking contrast, the interfollicular epidermis (IFE) and its resident SCs remain unaffected by Brca1 deletion. I uncovered two mechanisms underlying the ability of the SCs and progenitors of the IFE to survive the deletion of Brca1. Collectively, this data reveals how distinct SCs and progenitors respond differently to Brca1 loss. Furthermore we show how the IFE can survive Brca1 loss through the use of two particular mechanisms as to sustain tissue homeostasis. The mechanisms uncovered here are likely to be relevant in other tissue-specific SCs and will have important implications in understanding cancer initiation and ageing. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Malgré les progrès réalisées en matière de traitement et de diagnostic, le cancer du poumon demeure le plus répandu et le plus mortel dans le monde. La chimiothérapie conventionnelle, associant un composé de platine (cisplatine ou carboplatine) à un autre agent antinéoplasique est utilisée à quasiment tous les stades. Comme celle-ci est administrée par voie intraveineuse (IV), elle entraîne des effets secondaires systémiques importants dont certains sont dose- limitant (DLT) comme la néphrotoxicité pour le cisplatine ou la myélotoxicité pour le doublet carboplatine-paclitaxel. Par conséquent, ces agents sont administrés selon des cycles bien espacés pendant lesquels les tissus se rétablissent, et ce incluant la tumeur ;conduisant à une repopulation tumorale. En effet, une corrélation significative a été établie entre la concentration de platine dans les tumeurs pulmonaires et l’efficacité du traitement. Le but de ce travail était d’évaluer le potentiel de combiner une poudre sèche pour inhalation (CIS-DPI-50) avec le traitement de chimiothérapie IV, afin d’exposer la tumeur à l’agent cytotoxique de manière continue.La première partie de ce travail a permis de développer le CIS-DPI-50. Afin d’éviter qu’une haute concentration en cisplatine ne soit complètement solubilisée une fois dans les poumons, et afin d’assurer une exposition suffisante, il était essentiel de développer des formulations à libération contrôlée et à rétention pulmonaire suffisante. Ceci consistait en l’optimisation d’une formulation à base de microparticules lipidiques solides (CIS-DPI-TS) préalablement développée par Levet et al. Cette formulation a été reproduite afin d’évaluer son efficacité chez des souris greffées avec le modèle M109-HiFR (0.5 mg/kg, trois fois par cycle pendant deux cycles) et a démontré une survie similaire au CIS-IV (1.5 mg/kg, une fois par cycle pendant deux cycles). Cela a été effectué en (i) utilisant des excipients de grade pharmaceutique, reconnus comme sûrs (GRAS) (49,5 % (w/w) d’HCO et 0,5 % (w/w) de TPGS) selon un processus facilement transposable, et (ii) en augmentant la libération initiale afin d’améliorer la réponse antitumorale. Le CIS-DPI-50 a montré une performance aérodynamique prometteuse à des débits d’air différents (100 et 40 L/min) avec une fraction de particules fines par rapport à la dose délivrée (FPF_d) de 86 ± 1 % et de 74 ± 1 %, respectivement. La reproductibilité du procédé a été démontrée sur 3 lots différents et la stabilité maintenue pendant les 6 mois de stockage avec une FPF_d variant de 81,0 ± 0,6 % au T0 à 81 ± 2 % après 6 mois. Ceci était lié à (i) la stabilisation de la forme β de HCO et de l’état cristallin du cisplatine, et (ii) à la faible teneur en solvant résiduel (< 0,2 % w/w). De plus, cette formulation était caractérisée par une libération initiale plus marquée qu’avec CIS-DPI-TS ainsi que par des propriétés de libération contrôlée in vitro puisque 48 ± 2% ont été dissous en 2 h, vs. 35 ± 11 % pour CIS-DPI-TS et 76 ± 5 % pour les microcristaux de cisplatine non enrobés. Cela a été confirmé in vivo et a prouvé que le changement vers HCO a diminué le Tmax dans le sang de 120 min pour CIS-DPI- TS à 1 min pour le CIS-DPI-50. De plus, la rétention pulmonaire a été maintenue pendant 4 heures avec une aire sous la courbe (AUC) dans les poumons de 4 611 ± 932 ng.min.mg1 vs. 6 072 ng.min.mg-1 pour CIS-DPI-TS. Par conséquent, cette formulation a été choisie pour la suite des investigations.La deuxième partie de ce travail visait tout d’abord à évaluer la biodistribution après l’administration de CIS-DPI-50 à 0.5 mg/kg chez des souris greffées avec le modèle LLC1- Luc. Suite à cette administration, une exposition plus soutenue et dix fois plus élevée a été retrouvée dans les tumeurs par rapport au tissu sain (AUC0-∞ de 10 683 ± 5 826 ng.min.mg-1, vs. 1 071 ± 825 ng.min.mg-1, respectivement). Le deuxième objectif était de sélectionner le schéma d’administration du CIS-DPI-50 le plus adapté à sa combinaison avec la chimiothérapie IV. Le CIS-DPI-50 a été administrée 5 fois par cycle pendant deux cycles à 0,3, 0,5 et 1 mg/kg, ou à 0,5 mg/kg 3 fois par cycle pendant deux cycles. Après le premier cycle de traitement, aucune différence en termes de concentrations en platine n’a été observée dans les tumeurs ou dans les organes sains entre les groupes traités de manière répétée et ceux administrés une seule fois. Cependant, un cycle plus tard, toutes les concentrations en platine ont augmenté dans les organes sains et diminué dans les tumeurs. Ceci était lié à une augmentation de la taille tumorale d’un facteur de 23 entre les deux cycles (533 ± 23 mg vs. 23 ± 3 mg), ainsi qu’à la dégradation de l’état général des animaux. De plus, aucun des schémas n’a démontré une toxicité pulmonaire ou une efficacité. Cette efficacité limitée était liée à la faible sensibilité du modèle LLC1-Luc au cisplatine. Par conséquent, les schémas caractérisés par la plus faible dose cumulée (0,5 mg/kg trois fois par cycle et 0,3 mg/kg cinq fois par cycle) ont été sélectionnés afin d’évaluer leur efficacité chez des souris greffées avec le modèle M109-HiFR-Luc2. Une réduction significative de la taille tumorale dans les groupes traités (p < 0,0001) par rapport au groupe non traité a été observée ;confirmant la réponse de ce modèle au cisplatine. Cependant, aucune différence en termes de croissance tumorale (tendances similaires), de proportion de répondeurs (33 % pour les deux groupes) ou de survie (31 jours pour les groupes traités vs. 23 jours pour le groupe non traité) n’a été rapportée entre ces deux groupes. Par conséquent, le schéma le moins fréquent a été choisi pour éviter une éventuelle accumulation de platine et une atteinte rénale aigue (AKI).La troisième partie de ce travail avait pour but d’étudier la tolérance pulmonaire et rénale du CIS-DPI-50, du CIS-IV et de leurs combinaisons. Les résultats de quantification des cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6, IL-1β) dans le fluide de lavage bronchoalvéolaire (BALF) ont montré une meilleure tolérance pour le CIS-DPI-50 par rapport au CIS-IV. Les neutrophiles granulocytes (NT-GRA) ont augmenté proportionnellement à la dose pour tous les groupes traités avec le CIS-DPI-50. Ces augmentations étaient réversibles une semaine plus tard uniquement pour les monothérapies et le groupe combiné, dont les administrations ont été espacées de 24h. Compte tenu des résultats d’inflammation et de cytotoxicité, l’ajout de CIS- DPI-50 au CIS-IV à sa dose maximale tolérée (MTD) semblait avoir un plus grand impact que si CIS-DPI-50 était ajouté à une dose IV réduite de 25%. Les résultats de quantification des biomarqueurs AKI plasmatiques (NGAL, cystatine C et créatinine) ont augmentés lorsque les deux monothérapies ont été administrées à leur DMT le même jour ou 24 heures plus tard. Par conséquent, la MTD du CIS-IV devait être réduite de 25% et les administrations séparées de 24h pour préserver la tolérance. L’efficacité de ce schéma a été évaluée sur des souris greffées avec le modèle M109-HiFR-Luc2 en combinant le CIS-DPI-50 au doublet IV cisplatine- paclitaxel. Malgré le fait que ces résultats n’étaient pas significativement différents, des tendances intéressantes en termes de réduction de la croissance tumorale, de survie (31 jours pour le groupe combiné vs. 26 pour le doublet IV, vs. 21 jours pour le groupe non traité) et de proportion de répondeurs (67 % pour le groupe combiné, vs. 50 % pour le doublet IV) ont été observés pour le groupe combiné.Comme les différentes adaptations ont probablement pu entraver le potentiel des combinaisons, il était intéressant d’étudier l’association de CIS-DPI-50 avec un doublet moins néphrotoxique (carboplatine-paclitaxel), et qui nécessiterait éventuellement moins d’ajustements. Compte tenu de la DLT du carboplatine et du paclitaxel, l’évaluation de la myélotoxicité était incluse dans cette étude. Les résultats ont montré que l’ajout de CIS-DPI-50 au doublet carboplatine- paclitaxel IV le même jour à leur MTD ont induit une augmentation du nombre de globules blancs et de cellules totales dans le BALF, une proportion plus élevée de NT-GRA dans le BALF et une anémie régénérative plus précoce qu’avec le doublet IV. Ces effets étaient réversibles. La stratégie de réduction de la dose IV de 25 % et la séparation des administrations par 24h ont permis d’éviter le développement d’une anémie régénérative et/ou l’augmentation de globules blancs ou du nombre de cellules totales dans le BALF par rapport aux doublets IV. De plus, toutes les combinaisons ont induit une cytotoxicité non réversible tout en étant mieux tolérées que celles avec le CIS-IV. Leurs efficacités devraient donc être testées sur des modèles de cancer pulmonaire murin seuls ou en combinaison avec l’immunothérapie (inhibiteurs de checkpoint).Ce travail a démontré la faisabilité de combiner une modalité de traitement locorégionale avec les traitements de chimiothérapie conventionnelle par voie IV à base de cisplatine et de carboplatine contre les tumeurs pulmonaires. Ceci a été effectué en optimisant les combinaisons afin d’éviter des toxicités pulmonaire, rénale et hématologique (pour la chimiothérapie à base de carboplatine) tout en démontrant une tendance vers une efficacité (pour le doublet cisplatine- paclitaxel) dans un modèle préclinique agressif. Par conséquent, ces résultats ouvrent la voie à plusieurs autres possibilités de combinaisons (traitements localisés et inhibiteurs de checkpoint) qui doivent être investiguées afin de sélectionner les indications pour lesquelles ce traitement serait le plus efficace. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished