BACKGROUND Aging is characterized by a progressive decline in immune surveillance that favors tumor development in older patients. One of the mechanisms used by malignant cells to escape immune surveillance is genetic or epigenetic modifications of tumor suppressor genes. Studies in B-cells and our previous report on the correlation between 6q deletion and progression into a T cell lymphoproliferative disease, identifying the BACH2 gene as a candidate tumor suppressor gene. Together, BACH2 and PRDM1 are described as having a fundamental role in oncogenesis, differentiation and apoptosis control of B and T lymphocytes during oxidative stress. Furthermore, several studies in mice model suggested that BACH2 gene is sensitive to DNA damage during aging and plays a role in the cellular senescence process. The impact of these genes in the immune response of the older adult is unclear. OUR HYPOTHESIS 1. Recent reports (including our previous study) on the transcription factor BACH2 and PRDM1 have highlighted their impact on immunological changes. It has been shown that BACH2 is highly sensitive to transcription-blocking DNA lesions in aged mice. Despite the growing interest in BACH's role, there have been many studies in mice models, studies on BACH2 in humans are still limited. This concept prompted us to investigate the variation of BACH2 and PRDM1 expression with age in major lymphocyte subsets from healthy individuals. 2. Apoptosis and senescence are two types of cellular response affected by cancer and aging processes, albeit through different mechanisms. Carcinogenesis is associated with a progressive reduction in the ability of the cells to trigger apoptosis and senescence. The lymphocytes apoptosis process and the markers of cell senescence were thus studied in both populations. 3. Chronic lymphocytic leukemia, one of the aging-related diseases, is characterized by the accumulation of “anergic” phenotypes in both B-cells and T-cells. In chronic lymphocytic leukemia, malignant cell anergy is associated with failure of inducing PRDM1 (BLIMP1), a critical regulator of differentiation into plasma cells, and that epigenetic modification account for such failure. We thus examined the expression of specific transcription factors BACH2 and PRDM1 in the leukemic lymphocytes subsets and compared the results with age-matched normal population. POPULATION & METHODS Blood samples were obtained from 60 healthy donors, aged from 20 to 90 years, and 41 untreated chronic lymphocytic leukemia were studied. Lymphocyte subsets (CD19+ B-cells, CD8 T-cells, CD4 T-cells, CD4 naïve T-cells, CD4 effector memory T-cells) were isolated for subsequent molecular analyses using the MACS Technology (Miltenyi), with the purity of each lymphocyte subpopulation between 95%-99%. BACH2, PRDM1, IL-4, IFNG, TP53, CDKN2A (p16INK4A), PDCD1 (PD-1) and CD274 (PD-L1) mRNA transcripts were quantified using qRT-PCR. BACH2 protein expression was examined by Western blotting. To investigate BACH2-target genes in apoptosis, we performed a “Human Apoptosis EpiTect ChIP qPCR Array” profiles including 84 key genes involved in programmed cell death. Etoposide was used to induce intracellular oxidative stress followed by cell apoptosis. Apoptotic cells were identified with the annexin-V-FITC apoptosis detection kit (BD Pharmingen). To measure ß-galactosidase by flow cytometry, we used Fluorescein-di-beta-D-galactopyranoside as a substrate for beta-galactosidase (Molecular Probes).RESULTS 1. BACH2 and PRDM1 gene expression were strongly correlated with age in healthy donor’s major lymphocyte subsets. BACH2 mRNA expression declined by age, with statistically significant differences observed in all lymphocyte subsets: CD4+, CD4+ naïve, CD4+ memory, CD8+ T-cells and CD19+ B-cells (p<0.0001, <0.0001, 0.0118, <0.0001 and 0.0004 respectively). In contrast, PRDM1 gene expression significantly increased with age in the same subpopulations. The phenotypic changes of immune lymphocytes are related to the BACH2 and PRDM1 gene expression. Along with the decline of BACH2, the older group had a severe decrease in number and quality of cytotoxic T-cells (p=0.0005 and <0.0001), while increasing the rate exhausted T-cells that highly expressed of PD-1 and PD-L1. Both PCCD1 (PD-1) and CD274 (PD-L1) gene expression had inversely correlated with BACH2 in the same lymphocyte subsets (p=0.0342; 0.0254 and 0.0429 respectively). Western blotting analysis demonstrated that BACH2 protein expressions in the T and B cell subpopulations significantly correlated with transcript expression. 2. Age-related BACH2 down-regulation enhanced the increasing of senescent cells and the resistance to apoptosis in the major lymphocyte subsets. We, further, found the correlation of BACH2 with senescence markers, such as p16INK4A (CDKN2A) and SA-β-GAL along with loss of CD28+ on T-lymphocytes. ChIP-qPCR Array demonstrated that BACH2 bound directly several genes involved in programmed cell death. A reduction in apoptosis was observed with age in CD4+ T-cells and CD19+ B-cells (p=0.03 in both subpopulations). As recently reported for BACH2-deficient mice, our data show that BACH2 down-regulation is strongly correlated with a decrease in CD4+ T-cell and CD19+ B-cell apoptosis (r=0.57 and 0.61). 3. Decreases in BACH2 mRNA expression were greater in CD4+ and CD8+ T-cells, as well as leukemic B-cell subpopulations from untreated CLL patients, compared with age-matched healthy donors (p=0.0006; 0.0003 and 0.0083, respectively). As expected, PRDM1 was significantly upregulated in the CD4+ and CD8+ T-cell subpopulations (p=0.003 and 0.001, respectively) from CLL patients but not their leukemic B-cells. CONCLUSION In this research work, we examined BACH2 and PRDM1 gene expression to investigate its potential as a predictive marker of aging. Our data suggest BACH2 and PRDM1 mRNA expression, in the inverse correlation, associated with the phenotypic changes of immune lymphocytes in aging. Age-related BACH2 down-regulation enhanced the increasing of exhausted phenotypes, senescent cells and resistance to cell apoptosis. BACH2 and PRDM1 could involve in cellular and immunological functions deterioration of the immunosenescence process. Further investigations on BACH2 and PRDM1 genetic mutations provide a better understanding of the role of the unbalanced expression of those genes in lymphocytes functions and survival according to age. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les agents cytotoxiques et les thérapies moléculaires ciblées sont l’un des piliers du traitement des patients atteints de tumeurs génito-urinaires. Cependant, il existe de nombreuses situations médicales pour lesquelles l’on manque d’options thérapeutiques standards dans la pratique clinique. Ce travail de recherche clinique vise à identifier et comprendre de telles situations ainsi qu'à essayer d'améliorer les résultats cliniques de ces sous-groupes de patients. Afin d'atteindre cet objectif, différents projets cliniques ont été développés.La première partie de cette thèse est consacrée à l'évaluation de l'efficacité et de l'innocuité du cabozantinib, un puissant multi-inhibiteur de la tyrosine kinase approuvé dans le carcinome rénal avancé, ceci dans deux entités cliniques associes aux besoins médicaux non satisfaits :les patients avec un diagnostic de carcinome rénal pas à cellules claires métastatique et les patients avec un cancer du rein et métastases cérébrales.La deuxième partie de la thèse est consacrée au cancer de la vessie musculo invasif non métastatique pour lequel un traitement néoadjuvant et une résection chirurgicale sont recommandés. Nos projets évaluent les facteurs prédictifs potentiels de réponse à la chimiothérapie néoadjuvant standard à base de platine, l'efficacité et l'innocuité de l'ajout d'un agent immunothérapeutique à la chimiothérapie néoadjuvante ainsi que le rôle de l’ajout d’une chimiothérapie adjuvante chez les patients présentant une maladie résiduelle malgré une chimiothérapie néoadjuvante. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La prévalence de l’allergie à l’arachide semble s’élever entre 0.6 et 1.9% de la population générale. Elle se caractérise par des doses déclenchantes particulièrement faibles. Des doses de l’ordre du milligramme sont suffisantes pour déclencher une réaction objectivable. Les valeurs de ED05 et de ED50 sont respectivement estimables à 7.3 mg, et de 100mg jusqu’à 1000 mg. Les réactions cliniques peuvent s’avérer très sévères et mener à des chocs anaphylactiques létaux. Or, l’examen du contenu et des différents allergènes qui ont été décrits ne permettent pas de pointer des caractéristiques qui pourraient expliquer ces éléments. Dix-sept allergènes ont été décrits dans l’arachide (Ara h 1 à 17). Ils appartiennent à des familles largement présentes parmi les protéines alimentaires végétales (Viciline, conglutine, …). Si l’on examine les raisons usuellement invoquées pour expliquer l’allergénicité des protéines (nombres d’épitopes, résistance à la protéolyse et aux traitements physico-chimiques, glycosylation, …) on constate que les allergènes de l’arachide, dans leur ensemble, possèdent ces propriétés sauf l’activité enzymatique qui n’avait pas été décrite jusqu’alors. Dès lors les deux premiers objectifs de ce travail ont consisté d’une part à mettre en évidence la présence d’activité protéolytique dans les graines, et d’autre part de tenter de purifier la protéase par des techniques de chromatographie, de la caractériser par des tests d’inhibition et de l’identifier. Le troisième objectif fut de déterminer si l’activité protéolytique pouvait avoir un rôle dans la sévérité de la réaction allergique. A cette fin nous avons mesuré les productions d’anaphylatoxine C3a et C5a et évalué le rôle de l’activité protéolytique dans l’activation du système du complément par la mesure de la production du complexe d’attaque membranaire SC5b-9. Le quatrième objectif consistait déterminer si l’activité protéolytique avait une influence sur la perméabilité tissulaire via la mesure de la lyse des jonctions serrées à l’aide d’un modèle de culture cellulaires MDCK.Partie Expérimentale-RésultatsLes extractions de protéines et les différentes chromatographies effectuées nous ont fourni une séquence de purification (IEX, Benzamidine et Thiopropyl) qui nous a permis d’isoler, de façon répétable, une protéine active d’un poids de 30-35 kDa dont l’activité est de type thiol-sérine protéase. En effet, l’activité protéolytique n’est pas inhibée par des inhibiteurs d’aspartique protéase (pepstatine) ni de métallo-protéase (EGTA, EDTA, O-phénanthroline), mais elle est totalement inhibée par les inhibiteurs de sérine protéase (PEFABLOC, TLCK, Benzamidine), partiellement par les inhibiteurs de cystéine protéases (MMTS, iodoacétamide, E64) et qu’elle interagit avec le thiopropyl et le PEG. Son séquençage n’a pas permis de l’identifier de façon certaine mais révèle qu’elle présente des homologies avec la conglutine-7 (Ara h 2), et des analogies avec la conglutine-γ du lupin, décrite comme sérine protéase. Concernant la réaction allergique, l’activité protéolytique de l’arachide induit clairement une production d’anaphylatoxines C3a et C5a dans les sérums et plasmas in vitro. De plus, les dosages du SC5b-9 ont démontré la production du complexe d’attaque membranaire. Cette activation du complément se fait de manière totalement indépendante des voies classique, alterne, ou des lectines. En effet, nous n’avons pas décelé de production de C3 convertase (tests d’hémolyse nuls et dosage de Bb) alterne et nous avons extrait et vérifier l’inactivité protéolytique des lectines de l’arahide. Enfin, les tests réalisés sur cultures cellulaires ont montré que l’activité protéolytique de l’arachide induit la lyse de l’occludine au sein des jonctions serrées, induisant de ce fait une augmentation de la perméabilité pouvant favoriser la pénétration des allergènes. Conclusions et PerspectivesNotre travail met en évidence la présence d’une activité protéolytique de type thiol-sérine protéase qui est d’une part responsable de la production d’anaphylatoxine C3a et C5a de façon totalement indépendante des voies d’activation du complément, et qui mène à la formation du MAC et d’autre part, d’affecter la perméabilité cellulaire en lysant l’occludine au sein des jonctions serrées. Nous émettons également l’hypothèse de l’influence de l’activité protéolytique de l’arachide en tant que « facilitateur » de la réaction allergique au vu des quantités d’anaphylatoxine produites et de son influence sur la perméabilité tissulaire, ainsi que de la sensibilisation à l’allergie via la potentialité d’une action sur les CD23, les PARs, et du C3a et C5a produits sur leurs récepteurs en surface des APCs.PublicationIsolation of a thiol-dependent serine protease in peanut and investigation of its role in the complement and the allergic reaction. Cédric Javaux, Patrick Stordeur, Mohamed Azarkan, Françoise Mascart, Danielle Baeyens-Volant. Molecular Immunology 75 (2016) 133–143. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Early-onset myopathies are genetically heterogeneous mendelian diseases. We have performed solo or trio whole exome sequencing (WES) in a cohort of 24 individuals with genetically undiagnosed early-onset myopathies from 21 families. We have identified single nucleotide variant (SNV) or copy number variants (CNV) in known genes in 52% of the patients. We contributed to the expansion of the phenotypic spectrum for two genes (TTN, TRIP4). In particular, through international collaborative efforts, we described the severe end of the phenotypic spectrum of congenital titinopathy. Fifteen cases, with biallelic TTN truncating or canonical splice site mutations, presented with severe in utero features and/or severe weakness and respiratory compromise at birth, leading to termination of pregnancy, neonatal death or survival with long term respiratory support. The presence of multiple congenital limb contractures, congenital long bone fracture and/or complete absence of muscle groups can be diagnostic clues. All severely affected patients that survived until birth had at least one mutation predicted to result in the production of at least some near-normal-length titin, a finding that seems to be essential for human in utero survival.WES also allowed us to identify three novel candidate genes (JAG2, R. U.). Through Matchmaker Exchange, we assembled a cohort of 23 individuals with undiagnosed muscular dystrophy from 13 unrelated families with rare homozygous or compound heterozygous variants in JAG2. Individuals with JAG2 variants had a wide spectrum of phenotypes and disease severity but the muscle MRI findings appear to be the unifying feature that helps to identify these patients. Transcriptome analysis in the muscle of two affected individuals suggests satellite cell depletion, a finding that is also present in other muscular dystrophies linked to the Notch pathway like POGLUT1 or MEGF10 related muscular dystrophies. If the implication of our three novel candidate genes is confirmed, the diagnostic yield in the cohort would increase to 67%. The zebrafish has been widely used to validate the implication of novel genes of myopathy, mostly with morpholino or mutated mRNA injections. As the specificity of morpholinos and mutated mRNA injections had been questioned, we have decided to use CRISPR-Cas9 to model loss-of-function or gain-of-function by creating knockout or knockin lines. We generated a knockout line for mtm1 and a knockin line for the S619L gain-of-function mutation in dnm2a because these mutations were associated with severe myopathic phenotypes in humans and had already been modeled in zebrafish with morpholino or mutated mRNA injections. In contrast to the severe phenotype of morpholino/mRNA injected fish, we did not observe any structural or functional defect in the muscle of mtm1 mutants and dnm2a mutants. Off-target effects of morpholino or mRNA injections as well as genetic compensation mechanisms in mutant lines are possible mechanisms explaining these discrepancies. The absence of phenotype in a zebrafish mutant line is not sufficient to rule out the implication of a gene in a human phenotype. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ce travail de thèse consiste en l’étude de deux membres de la famille des NADPH oxydases :Duox1 et Duox2, et leurs partenaires DuoxA1 et DuoxA2. Exprimées dans la thyroïde, ces deux enzymes sont essentielles à la synthèse des hormones thyroïdiennes, puisqu’elles produisent du peroxyde d’hydrogène (H2O2), indispensable à l’organification de l’iodure par la thyroperoxydase. Duox1 et Duox2 sont également exprimées dans de nombreux autres tissus, comme les voies respiratoires et le tractus digestif, au sein desquels elles jouent un rôle primordial dans la défense de l’organisme contre les pathogènes. Afin d’être exprimées à la surface des cellules où elles sont actives, les protéines Duox nécessitent la présence de facteurs de maturation, appelés DuoxA1 et DuoxA2. Initialement identifiées comme des protéines résidentes du réticulum endoplasmique lors de leur découverte en 2006, les protéines DuoxA ont été détectées à la surface des cellules et pourraient dès lors former un complexe membranaire avec les protéines Duox. Les mécanismes d’activation des Duox par leurs facteurs de maturation DuoxA ne sont pas encore complètement connus à ce jour et la preuve formelle d’une interaction entre les deux partenaires à la surface des cellules était encore manquante lorsque ce travail de thèse a débuté. Nous avons généré des clones de cellules HEK293 Tet-On3G exprimant de manière constitutive les protéines Duox1 ou Duox2, ainsi que les protéines DuoxA1 ou DuoxA2 sous le contrôle d’un promoteur inductible à la doxycycline, et ce pour les 4 combinaisons suivantes :D1DA1, D2DA2, D1DA2 et D2DA1. Ces cellules ont permis d’étudier l’expression, la stabilité et l’activité des enzymes Duox en fonction de l’expression modulée de DuoxA. De plus, la présence d’étiquettes HA et V5 au niveau de l’extrémité NH2-terminale des protéines Duox et DuoxA, respectivement, a permis de comparer de manière fiable l’expression des protéines dans les différents types de clones et de mettre en évidence une interaction entre les deux partenaires. Nous avons confirmé l’efficacité de ce système cellulaire pour reconstituer l’expression des protéines DuoxA1 et DuoxA2, ainsi que la maturation et l’activité concomitantes des protéines Duox1 et Duox2. Lorsqu’elles sont exprimées seules, ni les protéines Duox ni les protéines DuoxA ne sont exprimées à la surface des cellules. Dans les cellules exprimant les partenaires non pairés (Duox1/DuoxA2 et Duox2/DuoxA1), l’expression des protéines à la surface des cellules est plus faible, tout comme la production d’H2O2 ionomycine-dépendante qui y est associée. En normalisant cette production d’H2O2 à l’expression des protéines Duox et DuoxA à la surface des cellules, nous avons montré que l'association Duox2/DuoxA2 était plus active que le partenariat Duox1/DuoxA1, ce qui justifie que Duox2/DuoxA2 constitue le système générateur majeur de peroxyde d’hydrogène dans la thyroïde. Par ailleurs, nous avons montré que l’H2O2 produit par les cellules exprimant le couple Duox2/DuoxA2 induisait des cassures double brins à l’ADN, après stimulation de l’activité de Duox2 par l’ionomycine et le PMA. Enfin, nous avons montré que les protéines Duox et DuoxA stabilisent leur partenaire respectif. Lorsqu’elles sont associées à leur partenaire pairé (D1DA1 et D2DA2), les protéines Duox et DuoxA sont plus stables et leur temps de demi-vie est augmenté, par rapport aux couples non pairés (D1DA2 et D2DA1). Nous avons montré une interaction spécifique entre les protéines Duox et DuoxA à la surface des 4 types de clones HEK293 Tet-On3G, à l’aide de la technique de Duolink®. Les complexes formés par les couples pairés se sont avérés encore une fois plus stables au cours du temps que les complexes non pairés. Finalement, nous avons démontré l’importance de la glycosylation des facteurs de maturation dans leur expression à la surface, ainsi que dans la maturation et l’activité des enzymes Duox. Ce travail de thèse a permis de démontrer que le système générateur d’H2O2 tel qu’il est retrouvé au pôle apical des thyrocytes est un complexe enzymatique membranaire constitué de la NADPH oxydase DUOX1/2 qui interagit avec les DUOXA1/2 respectivement. Le complexe DUOX2/DUOXA2 est le plus actif et des mutations dans l’un des partenaires sont fréquemment responsables d’hypothyroïdies congénitales. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Producing competent and fertilizable oocytes from in vitro grown primordial follicles could revolutionize female infertility treatment, particularly using fertility preservation approaches that use cryopreserved ovarian tissue. However, the protracted length of folliculogenesis in humans makes follicular culture complex, and the mechanisms controlling the tightly-regulated activation of primordial follicles remain largely unknown. The delicate balance between follicular recruitment and quiescence might be affected by preservation procedures, such as ovarian fragmentation or in vitro culture, that disrupt crucial pathways, such as the Hippo and PI3K/Akt/mTOR signaling pathways, that are involved in this process. When activated, these pathways induce massive recruitment of primordial follicles and accelerate follicular growth in vitro, with potential negative consequences on future oocyte developmental competence. Therefore, we hypothesized that the inhibition of the PI3K/Akt/mTOR pathway might improve follicular growth by slowing down the activation process.In the first part of this thesis, we explored the potential benefit of inhibiting PI3K/Akt/mTOR signaling on the regulation of in vitro follicular activation and growth, as well as its impact on the Hippo pathway. The effect of everolimus (EVE), a specific mTORC1 inhibitor, was compared to the PI3K/Akt activators recently used to reinitiate the growth of residual follicles in the ovarian tissue of patients with premature ovarian insufficiency. We showed that short-term incubation of ovarian cortex with EVE partially delayed follicular recruitment while supporting follicle survival and steroidogenesis. However, morphological abnormalities were observed in all conditions, suggesting that EVE failed to protect follicles from accelerated in vitro growth-related defects.Our findings also provided evidence that ovarian fragmentation, which disrupts the Hippo pathway, contributes to the triggering of primordial follicle recruitment and early development of quiescent human follicles. Moreover, our data suggested that both PI3K/Akt and Hippo signaling could act synergistically to promote follicular activation and growth.In the second part of the project, we further investigated the integrity of EVE-treated follicles based on their ultrastructural and functional status. Our observations indicate that the integrity of oocyte and granulosa cells, as well as their physical contacts, were preserved in EVE and control conditions, although some in vitro grown follicles sustained cryopreservation- and culture- induced damage. We also found that short exposure to EVE allowed the maintenance of intra-follicular communication while preserving follicular developmental potential. Importantly, results obtained suggested that, at a similar developmental stage, cell coupling and oocyte growth may be improved in EVE-treated follicles.Altogether, these data provide better insight into the regulation of the follicular activation process and emphasize the importance of getting closer to physiological conditions to preserve follicle integrity. They also provide proof-of-concept evidence that reducing the initiation of growth is feasible, and suggest that mTORC1 inhibitors are a potentially useful pharmacological tool to regulate in vitro follicular growth. / La production d'ovocytes compétents et fécondables à partir de follicules primordiaux développés in vitro pourrait révolutionner les traitements liés à l'infertilité féminine, en particulier les approches de préservation de la fertilité à partir du tissu ovarien cryopréservé. Cependant, la longue durée de la folliculogenèse chez l'Homme rend la culture folliculaire complexe, et les mécanismes contrôlant l'activation des follicules primordiaux restent largement inconnus. L’équilibre fragile entre quiescence folliculaire et entrée en croissance pourrait être affecté par la fragmentation ovarienne ou la culture in vitro elle-même, qui perturbent deux voies de signalisation cruciales: les voies Hippo et PI3K/Akt/mTOR, respectivement. Lorsqu'elles sont activées, elles induisent un recrutement massif de follicules primordiaux et accélèrent la croissance folliculaire in vitro, avec des conséquences potentiellement néfastes sur la capacité future des ovocytes à devenir compétents. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que l’inhibition de la voie PI3K/Akt/mTOR pourrait améliorer la croissance folliculaire via un ralentissement du processus d’activation.Dans la première partie de cette thèse, nous avons exploré le potentiel bénéfice d’une inhibition de la voie PI3K/Akt/mTOR sur la régulation de l'activation et de la croissance folliculaire in vitro, ainsi que son impact sur la voie Hippo. L’effet de l’évérolimus (EVE), un inhibiteur spécifique de mTORC1, a été comparé à ceux d’activateurs de PI3K/Akt, récemment utilisés afin d’initier la croissance des follicules résiduels au sein de tissus ovarien de patientes en insuffisance ovarienne précoce. Nous avons montré que l'exposition à court terme de cortex ovarien à l'EVE retardait partiellement le recrutement folliculaire tout en préservant la survie et la stéroidogenèse des follicules. Toutefois, des anomalies morphologiques ont été observées dans toutes les conditions, ce qui suggère que l’EVE ne préserve pas les follicules de défauts liés à une croissance accélérée.Nos résultats ont également prouvé que la fragmentation ovarienne, en perturbant la voie Hippo, contribue au recrutement et au développement précoce des follicules primordiaux. De plus, les données obtenues suggèrent que les voies PI3K/Akt/mTOR et Hippo pourraient agir de manière synergique pour promouvoir l'activation et la croissance folliculaire.Dans la deuxième partie du projet, nous avons étudié la qualité des follicules traités avec de l’EVE en se basant sur des critères ultrastructural et fonctionnel. Nos observations ont indiqué que l'intégrité des ovocytes et des cellules de la granulosa ainsi que leurs contacts physiques était préservée dans les conditions EVE et contrôle, bien que certains follicules en croissance présentent des signes de dommages induits par la cryopréservation et la culture. Nous avons également constaté qu'une courte exposition à l’EVE permettait de maintenir les communications intra-folliculaires tout en préservant le potentiel de développement des follicules. De façon importante, les résultats obtenus suggèrent qu’à un stade de développement similaire, le couplage cellulaire et la croissance des ovocytes pourraient être améliorés dans les follicules traités à l’EVE.En conclusion, ces données contribuent à une meilleure compréhension de la régulation de l'activation folliculaire in vitro, et soulignent l'importance de mimer les conditions physiologiques pour préserver l'intégrité des follicules. Elles apportent également la preuve qu’un ralentissement de l’initiation de la croissance est réalisable, et suggèrent que l’utilisation d’inhibiteurs de mTORC1 pourrait représenter un outil pharmacologique efficace pour réguler la croissance folliculaire in vitro. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

RésuméAvec près de 17 millions de décès chaque année, les maladies cardiovasculaires (MCV) restent la première cause de mortalité dans le monde. De plus, le nombre de décès est inexorablement appelé à augmenter avec le vieillissement de la population, l’urbanisation et les nouveaux comportements alimentaires. Leur surveillance est basée sur l’évaluation de facteurs de risque cardiovasculaire. Ces facteurs sont liés à un état physiologique, une pathologie ou une habitude de vie corrélée à une incidence accrue d'une maladie cardiovasculaire. Il existe des facteurs de risque non modifiables, des facteurs de risque comportementaux et des facteurs de risques physiologiques. L'obésité est considérée comme un facteur de risque critique pour l’apparition d'autres facteurs de risques de MCV. La lutte contre l’obésité contribuerait à réduire l’incidence des MCV dans le monde. Le développement de l'obésité résulte d’un déséquilibre entre la consommation et la dépense énergétiques ;l'organisme recevant plus qu'il ne dépense, il stocke une partie de l'apport sous forme de triglycérides dans le tissu adipeux. Un tissu adipeux dysfonctionnel est caractérisée par :une accumulation préférentielle de graisse au niveau viscéral; une augmentation du volume et ou du nombre des adipocytes; une augmentation du nombre de cellules immunitaires infiltrant le tissu adipeux; des changements dans la composition cellulaire du tissu adipeux; et une hypersécrétion d'adipokines pro-inflammatoires. Afin de mieux comprendre l’origine des facteurs de risque de MCV au Cameroun, nous nous sommes fixés comme premier objectif de thèse d’évaluer les facteurs de risque de MCV au sein de deux populations du Cameroun à habitude alimentaire distincte mais à valeur énergétique équivalente. Afin de mieux comprendre la pathogenèse de l’obésité, le deuxième objectif de thèse a été d’identifier les voies de signalisation impliquées dans la régulation d’expression d’aquaporines (AQPs), et en particulier d'aquaglycéroporines impliquées dans le métabolisme du glycérol et des triglycérides dans les adipocytes, en réponse à des conditions inflammatoires mimant celles rencontrées dans l’obésité. Enfin, en vue de mieux comprendre les effets bénéfiques engendrés par la forskoline (FK) sur la composition corporelle de patients en surpoids ou obèses, le troisième objectif de thèse a été d’étudier l’effet de la FK, ainsi que les voies de signalisation modulées par celle-ci dans des adipocytes, en réponse à des conditions inflammatoires mimant celles rencontrées dans l’obésité.L’évaluation des facteurs de risque de MCV au Cameroun réalisée à l’aide d’un questionnaire montre que les Camerounais du Sud consomment des huiles saturées, sont obèses, et possèdent des paramètres lipidiques qui sont corrélés avec d'autres facteurs de risque de MCV (diabète, hypertension artérielle). Par contre, les Camerounais du Nord consomment des huiles polyinsaturées et saturées, possèdent des paramètres lipidiques qui ne sont pas corrélés avec leur glycémie et leur pression artérielle. Dans les adipocytes murins 3T3-L1, nos résultats montrent clairement que de nombreuses AQPs y sont exprimées. En outre, dans des conditions inflammatoires (traitement au LPS), mimant celles rencontrées dans l’obésité, nous remarquons que la diminution des taux d'ARNm des AQP7, AQP11 et GPR120 et l’augmentation des taux d'ARNm d’AQP3 et MCP-1. Ces modifications sont susceptibles de contribuer à la physiopathologie de l’obésité. En effet, la FK est un agent impliqué dans la perte de poids chez les sujets obèses qui inhiberait l’augmentation des taux d’ARNm de MCP-1 et la diminution du taux d’ARNm de GPR120 induite par le LPS dans les adipocytes. Enfin, la stimulation de TLR-4 par le LPS induit l'activation de la kinase JNK et/ou du facteur de transcription NFkB et pourrait être impliquée dans la régulation de l’expression des aquaglycéroporines, de MCP-1 et de GPR120 dans les adipocytes. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’overdose au paracétamol est l’une des intoxications médicamenteuses la plus fréquente au monde, caractérisée par une atteinte hépatique dont l’issue peut être fatale. Les études réalisées sur ce phénomène ont montré que la phase initiale de la toxicité est induite par le métabolite actif du paracétamol, le N-acétyl-p-benzoquinone imine (NAPQI). Ce dernier, en l’absence de quantité suffisante de glutathion, s’accumulent dans la cellule et finit par se lier à d’autres protéines, principalement mitochondriales, formant alors des adduits. Cette liaison va altérer la fonction primaire des protéines et conduire, en cas d’overdose sévère, à la mort des hépatocytes. La mort cellulaire s’accompagne alors de la libération de composants cellulaire dont le rôle sera d’alerter le système immunitaire des lésions tissulaires. Ces composants prennent alors le nom d’«alarmines» ou de « damage-associated molecular patterns » (DAMPs). La protéine HMGB1 (High Mobility Group Box 1) fait partie de cette catégorie.Au cours de cette thèse nous nous sommes intéressés de plus près à la protéine HMGB1, à son origine ainsi qu’à son rôle dans l’amplification et la propagation des lésions hépatiques initialement induites par l’overdose au paracétamol. Nos travaux se sont d’abord portés sur l’étude de la protéine HMGB1 dans un modèle murin d’hépatite au paracétamol. Nos expériences nous permettent, d’une part, de confirmer que la libération d’HMGB1 est liée à la sévérité des lésions hépatiques et d’autre part, de démontrer que l’amplification et la propagation de ces lésions, dans les phases précoces de l’intoxication au paracétamol, peuvent se produire indépendamment des cellules immunitaires. Sur base de ces résultats, nous avons émis l’hypothèse de l’existence d’un dialogue entre la protéine HMGB1 et les hépatocytes plutôt que du dialogue, généralement décrit dans la littérature, entre la protéine HMGB1 et les cellules du système immunitaire Nos travaux se sont donc poursuivis, in vitro, sur une lignée cellulaire d’hépatocytes humains, les cellules HepaRG. Ces expériences nous ont permis, d’une part, de confirmer l’implication de la protéine HMGB1 dans l’hépatotoxicité au paracétamol et de mettre en évidence la capacité de cette protéine à provoquer, sans intermédiaire, la mort des cellules HepaRG. D’autre part, ces expériences nous permettent de suggérer la participation de la protéine HMGB1 dans la propagation et l’amplification de la mort des hépatocytes exposés au paracétamol par une voie de signalisation impliquant l’axe TLR4/TRIF/RIPK3. Finalement, l’inhibition de la protéine HMGB1 semblant être bénéfique, nous avons investigué la potentielle efficacité de l’administration d’une combinaison de N-acétylcystéine et de glycyrrhizine dans notre modèle murin. L’idée était de combiner une drogue qui agit sur l’accumulation du métabolite toxique et une seconde qui agit sur la phase de propagation du signal. Nos résultats, bien que préliminaires, ont démontré l’efficacité de cette combinaison à la fois sur la nécrose hépatique et sur la survie des souris. En conclusion, nos travaux confirment l’importance du rôle joué par la protéine HMGB1 dans l’hépatotoxicité induite par le paracétamol et nous permettent de mettre en évidence un nouveau mécanisme, impliquant la protéine HMGB1, qui pourrait contribuer à l’amplification et la propagation des lésions hépatiques induites par une overdose de paracétamol. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’hypothyroïdie congénitale est un des troubles endocriniens les plus fréquents chez l’enfant, touchant un nouveau-né sur 2500.[1] Toutefois, même si quatre facteurs de transcription principaux, NKX2.1, PAX8, FOXE1 et HHEX, sont connus pour être impliqués et nécessaires au développement de la glande thyroïde, seuls 2% des patients atteints de dysgénésies thyroïdiennes sont reliés à une mutation au niveau d’un de ces quatre facteurs de transcription. Ceci suggère que d’autres facteurs, encore inconnus, pourraient jouer un rôle important durant l’organogenèse de la glande thyroïde.[1]Les mécanismes moléculaires contrôlant les différentes étapes du développement thyroïdien étant encore très peu connus, l’objectif de ce projet vise à décrypter le réseau génique contrôlant le développement thyroïdien. Pour se faire, la mise au point d’un protocole d’invalidation de gènes candidats impliqués dans le développement thyroïdien au sein de cellules souches embryonnaires murines à l’aide de la technologie des Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) a été mis au point. Ce nouveau protocole d’édition ciblée du génome de cellules souches embryonnaires permet la modélisation des différentes mutations identifiées au sein de patients atteints d’hypothyroïdisme congénital mais aussi la compréhension des différents mécanismes impliqués dans le développement de la glande thyroïde lorsque ce protocole est couplé avec notre modèle in vitro de différenciation de cellules souches embryonnaires murines en cellules folliculaires thyroïdiennes. Grâce à l’utilisation combinée de ces deux protocoles, nous avons pu mettre en évidence la nécessité du gène Foxe1 pour la différenciation in vitro correcte des progéniteurs NKX2.1+ en cellules folliculaires thyroïdiennes. Toutefois, il a été démontré qu’une faible proportion de cellules sont toujours capables de générer des follicules thyroïdiens en l’absence du gène Foxe1. Enfin, la génération inattendue de structures pulmonaires tridimensionnelles parmi les cellules Foxe1 KO différenciées avec du 8-br-cAMP a été observée. Cette génération de structures pulmonaires ne semble pas être une conséquence directe de la diminution d’expression du gène Pax8 observée au sein de ces lignées Foxe1 KO mais pourrait refléter un potentiel rôle épigénétique du gène Foxe1 permettant ou non le recrutement de certaines protéines au sein de la chromatine. Le gène Foxe1 semble à la fois jouer un rôle de facteur « pioneer » et de « Gatekeeper » en orientant le destin cellulaire des progéniteurs NKX2.1+ vers une différenciation thyroïdienne à défaut d’une différenciation pulmonaire. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les cellules souches assurent le développement des tissus, leur renouvellement ainsique leur réparation suite à des blessures. L’une des questions clés du domaine de labiologie des cellules souches est l’identification des différents types cellulaires qu’unecellule souche peut donner. Les cellules souches peuvent être multipotentes, c’est-à-direcapables de donner naissance à plusieurs types cellulaires différents, ou unipotentes,c’est-à-dire qu’elles ne peuvent alors se différencier qu’en un seul type cellulaire. Lesexpériences de traçage cellulaire sont réalisées quotidiennement en biologie dudéveloppement et en biologie des cellules souches afin d’évaluer le devenir des cellulessouches in vivo. Cependant, il n’existe à ce jour aucune méthode rigoureuse permettantd’interpréter les résultats d’expériences de traçage cellulaire de manière non ambigüe etde déterminer la multipotence ou l’unipotence des cellules souches avec grande précisionet de manière statistiquement fiable. Nous avons développé de nouvelles méthodes afind’évaluer avec une très grande précision le caractère unipotent ou multipotent descellules souches du sein et de la prostate. Ces nouvelles découvertes démontrent demanière non ambigüe que la prostate provient de cellules souches multipotentes, alorsque seules des cellules souches unipotentes contribuent au développement et auremodelage de la glande mammaire au stade adulte. D’autre part, nous montrons que cesont des cellules souches multipotentes qui sont responsables des phases précoces dudéveloppement embryonnaire de la glande mammaire, et que ces cellules deviennentunipotentes peu avant la naissance. Nous avons étudié les mécanismes régulant le passagede l’état multipotent à l’état unipotent et démontrons que le facteur de transcription p63joue un rôle crucial dans la restriction du potentiel de différenciation des cellules souchesmammaires embryonnaires. Enfin, nous montrons que les cellules souches mammairesadultes, normalement unipotentes, peuvent redevenir multipotentes en conditionsphysiopathologiques telles que l’ablation spécifique d’une lignée cellulaire mammaire ouau cours de l’initiation tumorale. Nous essayons donc de comprendre de manière généraleles mécanismes impliqués dans le passage de l’état unipotent à l’état multipotent descellules souches mammaires adultes, et d’élucider les similarités existant entre lesdifférentes conditions dans lesquelles des cellules souches mammaires multipotentessont observées. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished