Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2006. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 85-97).

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-17Bitstream added on 2014-06-13T18:51:13Z : No. of bitstreams: 1 motheo_tf_me_jabo.pdf: 1290385 bytes, checksum: ce65f89bddd3c29c19638e90cb3193d2 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Atualmente, estudos têm demonstrado a utilização da toxina botulínica do tipo A (TB-A) no tratamento de afecções prostáticas, como a hiperplasia prostática benigna. Ainda, sabe-se que alguns componentes bioquímicos do plasma seminal são relativamente específicos para a regulação da função espermática. O objetivo deste trabalho foi avaliar os possíveis efeitos deletérios ou benéficos da TB-A sobre a fertilidade de cães com HPB. Foram utilizados 18 cães machos, sem raça definida com sinais de HPB. Os animais foram divididos ao acaso em 3 grupos de 6 cães que receberam injeção intraprostática de solução salina de NaCl 0,9% (GC), solução contendo 250U (GI) e 500U de TB-A (GII). Quatro amostras foram colhidas antes da aplicação e 2, 4 e 8 semanas após o tratamento. Foi mensurado o pH e dosadas as concentrações de proteína total, cloretos totais, cálcio, potássio e sódio das amostras de plasma seminal. Ainda, foi realizada eletroforese SDS-Page utilizando géis de poliacrilamida nas concentrações de 12 e 18%. Os resultados foram avaliados por meio de análise de variância (ANOVA) e ao teste de Kruskall-Wallis (p<0,05). Não foram observadas diferenças significativas nos parâmetros bioquímicos avaliados. Outrossim, foram constatadas 31 bandas protéicas, com pesos moleculares variando de 106,2 a 3,9 kDa semelhantemente aos achados descritos na literatura. Destarte, pode-se concluir que os tratamentos com 250U e 500U de TB-A não alteraram os perfis bioquímico e protéico do plasma seminal de cães com HPB e, portanto podem ser considerados uma boa opção para cães destinados à reprodução ou envolvidos em programas de criopreservação de gametas. / Recently, botulinum neurotoxin type A (BoNT-A) application in the lower urinary tract has been extended to prostate disorders such as benign prostatic hyperplasia (BPH). Nevertheless, sperm function is highly dependent on ionic and protein environment. The goal of the present study was to evaluate the effects of BoNTA treatment on seminal plasma biochemical and eletrophoretic profile in dogs with BPH. Eighteen mature male mongrel dogs with BPH, were use in this study. They were randomly divided in three groups, which received intraprostatic injection of 0,9% NaCl normal saline solution (GI), 250U(GII) and 500U (GIII) of BoNT-A. All animals were previously conditioned to semen collection and four semen samples were collected before treatment and at 2, 4 and 8 weeks after injection. The semen was evaluated, and centrifuged to obtain seminal plasma for measurement of pH, total protein concentration (TP), total chlorides (TC), calcium (Ca), potassium (K), and sodium (Na). Additionally, one-dimensional sodium dodecyl sulfatepolyacrilamide gel eletrophoresis (SDS-PAGE) was carried out on 12 and 18% vertical minigel. One way ANOVA and Kruskall-Wallis with Bonferoni as a post hoc test were used to comparison of means (P<0.05). Average pH, TP, TC, Ca, K did not vary significantly at any time point and among each studied group and maintained normal values for the specie. Similarly as described in the literature, the eletrophoresis analysis of the pooled eluded fractions, identified 31 bands, with molecular weights varying from 106.2 to 3.9 kDA, In conclusion, the treatment with 250U and 500U of BoNT-A did not modify the biochemical or protein profiles of the seminal plasma of dogs with BPH.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Um dos principais objetivos de um programa de inseminaÃÃo artificial em caprinos à produzir o maior nÃmero de descendentes de animais geneticamente superiores com a finalidade de melhorar a produÃÃo animal. Para tanto à necessÃrio que se dominem tÃcnicas de diluiÃÃo e de armazenamento de sÃmen nesta espÃcie. Neste trabalho foram testados trÃs diferentes diluidores, citrato-gema (CG), TRIS-gema (TG) e Ãgua de coco industrializada (ACI) e dois grupos de animais, com alto nÃvel inicial de frutose (grupo I) e com baixo nÃvel inicial de frutose (grupo II) no plasma seminal. O sÃmen foi armazenado por atà 48h a 5oC e avaliado nos tempos 0 (fresco), 2, 24 e 48h, onde uma amostra do sÃmen conservado foi submetida ao teste de termo-resistÃncia (TTR) a 38oC por 2h. Durante a incubaÃÃo foram verificados os parÃmetros de motilidade (MOT) e vigor (VIG), nos tempos 5, 60 e 120 minutos e ao final foi calculada a taxa de degradaÃÃo da motilidade (TDM). EsfregaÃos de sÃmen foram realizados para verificaÃÃo das possÃveis alteraÃÃes morfolÃgicas. Houve uma queda significativa nos parÃmetros analisados no decorrer do tempo de armazenamento, independente do diluidor utilizado (P<0,05). Contudo, o diluidor ACI apresentou resultados inferiores aos dos demais. O efeito do grupo foi observado apenas no ACI, mostrando que este diluidor nÃo conseguiu suprir as necessidades energÃticas dos espermatozÃides cuja concentraÃÃo inicial de frutose no plasma estava baixa. Os diluidores CG e TG comportaram-se de forma semelhante nos dois grupos. Foi encontrada diferenÃa significativa na atividade da fosfolipase A2 (PLA2) entre os grupos (P<0,05), sendo que uma atividade superior foi observada no grupo II. Concluiu-se que, independente do diluidor utilizado, os parÃmetros seminais tendem a cair conforme o tempo de conservaÃÃo à prolongado. AlÃm disso, a concentraÃÃo inicial de frutose nÃo interferiu na qualidade espermÃtica quando os diluidores CG e TG foram utilizados, todavia, quando os nÃveis deste componente no plasma seminal foram superiores a 740 mg/dL ocorreu um aumento na sobrevida dos espermatozÃides conservados a 5 oC, quando se utilizou ACI. Sugere-se que o baixo desempenho espermÃtico tambÃm possa ser devido a uma maior atividade de PLA2, contudo mais estudos, contendo um maior nÃmero de animais, sÃo necessÃrios para elucidar esta hipÃtese / One of the main objectives of the artificial insemination program in goats is to produce the highest number of descendants of genetically superior animals with the purpose to improve the animal production. Thus, it is necessary to dominate correct techniques of dilution and semen storage in this specie. In this work three different extenders had been tested: citrate-egg yolk (CE), TRIS-egg yolk (TE) and industrialized coconut water (ICW) and two groups of animals: with high initial level of fructose (group I) and with low initial level of fructose (group II) in the seminal plasma. The semen was stored until 48h at 5oC and evaluated in times 0 (fresh), 2, 24 and 48h, where a sample of the conserved semen was submitted to the term-resistance test (TTR) that consists of incubate the sample at 38oC for 2h. During the incubation it had been verified the parameters of Motility (MOT) and vigor (VIG), in times 5, 60 and 120 minutes and to the end was calculated the tax of degradation of the motility (TDM) and semen slides had been carried through for verification of the possible morphologic alterations. It had a significant fall in the parameters analyzed in elapsing of the time of storage, independent of the used extender (P<0,05). However, extender ICW presented inferior resulted than the others. The effect of the group was observed only in the ICW,showing that this extender did not supply the energy necessities of the spermatozoa whose initial concentration of fructose in the plasma was low. CE and TE worked similarly in the two groups. Significant difference in the activity of phospholipase A2 between the groups was found (P<05), in way that a bigger activity was observed in group II. In conclusion, independent of the used extender, the seminal parameters tend to fall as draw out the conservation time. Moreover, the initial concentration of fructose did not intervene with the sperm quality when extenders CE and TE had been used, however, when the levels of this component in the seminal plasma had been superior to 740mg/dL, occurred an increase in lifetime of the spermatozoa conserved at 5oC, when ICW was used. It suggests that sperm low action also can be due to a higher activity of PLA2, however more studies are necessary, with a large number of animals to elucidate this hypothesis

Equine spermadhesin HSP-7 is a 14 kDa protein isolated from stallion seminal plasma and present on the surface of spermatozoa. HSP-7 displays carbohydrate and zona-pellucida binding properties, but the physiological role in equine fertilization is not well defined. HSP-7 has 98% amino acid sequence homology with the well-studied boar spermadhesin, AWN. Currently, these two proteins are considered to have the same reproductive function. Immunofluorescence studies presented here show that the stallion and boar spermadhesins are localized to different segments on spermatozoa. The variation in molecular compartmentalization of spermadhesin molecules in different species suggests that these structurally related proteins could be involved in independent events of fertilization. While the variation in HSP-7 abundance was not statistically significant between fertile and subfertile stallions, capacitated spermatozoa displayed a marked increase in HSP-7 when compared to neat sperm (P < 0.05). These results indicate that rather than aiding in capacitation, HSP-7 is exposed with capacitation and may have a more significant role in the acrosome reaction and sperm-oocyte recognition than previously documented.

Mammalian fertilization is a sequence of unique and fascinating events, during which seminal proteins are of crucial role. In case of bull (Bos taurus), proteins of seminal plasma (BSP), especially its major component PDC-109, are known to be in aggregated forms, but little is known about mechanism of forming aggregates and their biological function. In present thesis we discovered some interesting properties of PDC-109 and BSP proteins. We found that concentration of these proteins influences their aggregation state significantly, which can be of great biological importance. Separation of seminal proteins by size exclusion chromatography revealed three main fractions denoted I, II and III, with apparent molecular weights of Mr > 150 000, Mr = 30 000 and Mr = 13 000, respectively. In case of PDC-109, molecular weights of theese fractions were retained even after purification procedure, which implies very stable interactions in forming of aggregates. In addition, there was a difference in distribution of PDC-109 glycoforms among fractions, which can be related to the fact, that theese fractions have different sperm membrane binding patterns as we determined by fluorescence microscopy. However, further experiments are needed for better understanding this issue.

A criação de equinos tem se desenvolvido ativamente no Brasil. Assim, o interesse dos proprietários em biotecnologias reprodutivas equinos vem aumentando. Entretanto, o sêmen equino tem baixa tolerância à criopreservação comparada com outras espécies, sendo o estresse oxidativo um entrave por seus efeitos deletérios sobre a célula espermática. Neste contexto, o plasma seminal possui antioxidantes que promovem um papel importante na proteção do espermatozoide. Porém o, durante o processo de criopreservação, o plasma seminal é retirado. Em estudo anterior verificamos que, na ausência do plasma seminal os espermatozoides equinos tornam-se mais susceptíveis ao estresse oxidativo, principalmente causado pelo malondialdeído (MDA), subproduto da oxidação de lipídeos. Um dos motivos para este resultado seria a retirada da carnosina, um dos principais antioxidantes responsáveis pela proteção contra o acúmulo de MDA e seus efeitos deletérios, presente no plasma seminal. O objetivo do presente estudo é identificar e quantificar carnosina no plasma seminal de garanhões e comparar as características seminais em diferentes grupos de bons e maus refrigeradores e congeladores, baseando-se na análise da motilidade posterior ao processo de refrigeração e congelação. Foram colhidos dois ejaculados de quarenta garanhões (idades entre 4 e 16 anos de idade). As variáveis analisadas foram cinética espermática pelo sistema CASA, avaliação funcional (coloração de eosina-nigrosina para membranas, fast-green/rosa bengala para acrossomos, coloração 3-3diaminobenzidina para atividade mitocondrial e SCSA&trade; para susceptibilidade a denaturação de cromatina) e avaliação do índice de peroxidação lipídica (TBARS) do espermatozoide e do plasma seminal. Também foram realizadas análises da integridade de membranas plasmática e acrossomal, e potencial de atividade mitocondrial pelas sondas fluorescentes PI, Hoescht 33342, FITC-PSA e JC-1 além da produção de (ROS) pelo espermatozoide com a sonda fluorescente CellRox. A carnosina do plasma seminal foi mensurada utilizando kit de ELISA Biomatik&reg; comercial. Foram comparados os grupos bons e maus refrigeradores, e bons e maus congeladores (p&le;0,05). Verificamos uma maior concentração de carnosina nos bons refrigeradores em relação aos que refrigeraram mau. Isso pode ter ocorrido pela maior concentração de TBARS no plasma seminal destes animais, possivelmente por um efeito fisiológico de reações de oxidação. Além disto, os bons refrigeradores apresentaram porcentagens significativamente maiores de células com alta atividade mitocondrial, acrossomo intacto e membrana intacta sugerindo um efeito benéfico da carnosina. Em relação ao efeito da congelação do sêmen, não foi observada diferença na concentração de carnosina entre os que congelaram bem ou não. Este resultado era esperado uma vez que, durante o processo de criopreservação do sêmen equino o plasma seminal é retirado. De fato, a maior porcentagem de células com lesão mitocondrial, de membrana e DNA lesado nos maus congeladores e as correlações entre as lesões e o estresse oxidativo pode indicar um mecanismo mitocondrial de geração de estresse oxidativo e consequente lesão das estruturas celulares. Conclui-se que a carnosina apresentou efeito protetor durante a refrigeração espermática protegendo contra injúrias causadas pela mesma e consequentemente é um dos fatores que melhora a qualidade espermática após 24 horas de refrigeração. / Equine breeding has been actively developing in Brazil, leading to increased interest in reproductive biotechnology. However, there is a limitation due to a tolerance of some stallions to cryopreservation, especially when compared to other species. In this context, oxidative stress represents an obstacle due to its deleterious effects on equine sperm. To counterattack such effect, seminal plasma has antioxidants that play an important role in protecting the sperm. However, during the cryopreservation process, the seminal plasma is withdrawn. In a previous study we verified that, in the absence of seminal plasma, equine spermatozoa are more susceptible to oxidative stress, mainly caused by malondialdehyde (MDA), a product of lipid oxidation. One of the reasons for this result would be the removal of carnosine present in the seminal plasma, one of the main antioxidants responsible for protection against the MDA accumulation and its deleterious effects. The objective of the present study was to identify and quantify carnosine in the seminal plasma of stallions and to compare the seminal characteristics in different groups of sperm samples with high and low tolerance to the cryopreservation or cooling, based on analysis of total motility after these processes. Two ejaculates of forty stallions (N= 80; ages between 4 and 16 years old) were collected. Each ejaculate was divided into two aliquots, one submitted to a 24h cooling and the other submitted to cryopreservation. The variables analyzed were: Computer Assisted Sperm Analysis (CASA system), functional evaluation (eosin-nigrosin stain for membranes, fast-green/rose bengal for acrosomes, 3-3\'diaminobenzidine staining for mitochondrial activity and SCSA&trade; for susceptibility to chromatin denaturation) and lipid peroxidation index (TBARS assay) of sperm and seminal plasma. Furthermore, plasma and acrossomal membranes integrities and mitochondrial membrane potential were also analyzed using the fluorescence probes PI, Hoescht 33342, FITC-PSA, JC-1 and ROS detection by CellRox fluorescent probes. Carnosine from the seminal plasma was measured using commercial Biomatik&reg; ELISA kit. Thus, samples with high and low tolerance were compared (p&le;0.05). We found a higher concentration of carnosine in good cooler compared to those showing low motility. This may have occurred in response to the higher concentration of TBARS in the seminal plasma of these animals, possibly due to a physiological effect of oxidation reactions. In addition, good coolers presented significantly higher percentages of cells with high mitochondrial activity, intact acrosome and intact membrane suggesting a beneficial effect of carnosine. Regarding the effect cryopreservation, no difference was observed between those with high and low post-thaw motility. This result was expected since, during the cryopreservation process of equine semen, the seminal plasma is removed. In fact, the higher percentage of cells with mitochondrial lesions, damaged membrane and fragmented DNA in bad freezers and the correlations between lesions and oxidative stress may indicate a mitochondrial mechanism of oxidative stress generation and consequent lesion of cellular structures. In conclusion, carnosine had a protective effect during sperm cooling, protecting against damages being probably one of the factors that improves sperm quality after 24 hours of refrigeration.

A quantificação dos componentes bioquímicos como frutose, ácido cítrico e proteína total existentes no plasma seminal de caprinos e ovinos localizados na região Centro-Oeste do Brasil é uma forma de avaliar a atividade fisiológica e bioquímica espermáticas. Estes dados servem como indicadores de prováveis problemas com os testículos e glândulas acessórias desses animais e de sua respectiva fertilidade. A frutose e o ácido cítrico são importantes para o sêmen como fonte de energia metabólica e como componente de sistema tampão, respectivamente. A frutose é um marcador da função secretora das vesículas seminais, e é um componente importante para a sobrevivência dos espermatozóides em condições anaeróbicas e está estreitamente relacionada com a motilidade inicial das células espermáticas. Sendo assim, os objetivos do presente projeto foram analisar quantitativamente esses componentes do plasma seminal de bodes e carneiros sob latitude 20&deg;31\'S em quatro épocas do ano e purificar, através de técnicas cromatográficas, a enzima fosfolipase A2, importante proteína presente no plasma seminal. As análises bioquímicas foram feitas usando-se um espectrofotômetro UV/Vis para obtenção da curva padrão e para a determinação das concentraçõoes mensais e da concentração anual média dos constituintes analisados. A purificação da PLA2 foi feita por cromatografia líquida preparativa usando-se como fase estacionária a coluna Superdex 75-16/60 (GE HealthCare) de exclusão por tamanho e membranas semipermeáveis de 10 e 30 kDa. Como resultado das análises bioquímicas, obteve-se a concentração anual média de proteínas totais de 3,27 &plusmn; 0,60 g/dL para ovinos e de 5,02 &plusmn; 0,43 para caprinos, ácido cítrico de 1015,33 &plusmn; 66,50 µg/mL para ovinos e de 1584,35 &plusmn; 143,90 µg/mL para caprinos e frutose de 23,40 &plusmn; 4,80 mg/dL para ovinos e 72,73 &plusmn; 18,50 mg/dL para caprinos. Os resultados mostraram que a PLA2 extraída do plasma seminal de ovinos tem massa molecular próxima de 13,8 kDa e a PLA2 do plasma seminal de caprinos tem massa molecular próxima a 12,8 kDa. / Quantification of biochemical components in seminal plasma including fructose, citric acid and total protein of goat and sheep of the Midwest region of Brazil is one way of evaluating the biochemical and physiological activity of the sperm. These data serve as indicators of potential problems with the testicles and accessory glands of these animals and their relative fertility. The fructose and citric acid are important for the semen as a source of metabolic energy and as a component of a buffer, respectively. Fructose is a marker of secretory function of seminal vesicles, important for the survival of spermatozoa under anaerobic conditions, and is closely related to the initial motility of sperm cells. Therefore, the objectives of this project were to quantitatively analyze these components in the seminal plasma of goats and sheep in latitude 20&deg;31\'S 3 1\'S in four seasons and purify by chromatographic techniques the enzyme phospholipase A2, an important protein in the seminal plasma. Biochemical analysis were done using a spectrophotometer UV / Vis to obtaining the standard curve and to determine the monthly and annual average concentration of the constituents analyzed. The purification of PLA2 was performed by preparative liquid chromatography using the column as stationary phase Superdex 75-16/60 (GE HealthCare) by size exclusion and semipermeable membranes 10 and 30 kDa. As a result of biochemical analysis, we obtained the annual average concentration of total protein of 3,27 &plusmn; 0,60 g / dL for sheep and 5,02 &plusmn; 0,43 g/dL for goats, citric acid of 1015,33 &plusmn; 66, 50 g / mL for sheep and 1584,35 &plusmn; 143,90 g / mL for goats and fructose 23,40 &plusmn; 4,80 mg / dL for sheep and 72,73 &plusmn; 18,50 mg / dL for goats. The results showed that the PLA2 extracted from seminal plasma of sheep has a molecular mass of 13,8 kDa and the next PLA2 from goat seminal plasma has a molecular mass close to 12,8 kDa.

A criopreservação do sêmen suíno ainda é um desafio devido a extensão dos danos causados pelo choque-frio. Os espermatozoides oriundos da fração rica do ejaculado suíno possuem a membrana plasmática mais estável, são mais resistentes ao choque-frio e a reação acrossomal precoce do que aqueles oriundo da fração total do ejaculado. Com isso, o uso do plasma seminal oriundo dessa fração do ejaculado suíno também poderia aumentar a criotolerância dos espermatozoides suínos e/ou reverter os danos oriundo da criopreservação. Entretanto, a grande maioria das técnicas de avaliação espermática inclui apenas um parâmetro de funcionalidade espermática. Por outro lado, quanto mais características espermáticas analisadas, mais fiel se torna a avaliação quanto ao potencial fertilizante da amostra. Nesse contexto, esse trabalho objetivou a validação de uma técnica de análise espermática por citometria de fluxo para a avaliação simultânea da integridade das membranas plasmática e acrossomal e potencial de membrana mitocondrial. Além de avaliar os efeitos da adição/manutenção do plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno sobre a cinética espermática, integridade das membranas plasmática e acrossomal e potencial de membrana mitocondrial, fluidez e peroxidação das membranas espermáticas, fosforilação do aminoácido tirosina, taxa de fertilidade e de prenhez precoce. A técnica sugerida em nosso trabalho é capaz de detectar (R2 &#61; 0,9356; p &lt; 0,01) simultaneamente os espermatozoides com a membrana plasmática e acrossomal integras e alto potencial de membrana mitocondrial (PIAIA). O plasma seminal da fração rica do ejaculado suíno gera benefícios para a cinética espermática melhorando a motilidade total e progressiva dos espermatozoides descongelados (p &lt; 0,05). Por outro lado, a manutenção/adição de plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno, não é capaz de alterar (p &gt; 0,05) os espermatozoides PIAIA, a fosforilação do aminoácido tirosina, a fluidez e a peroxidação das membranas espermáticas. Entretanto, essas características devem ser cuidadosamente interpretadas, uma vez que, a fluidez e a peroxidação das membranas espermáticas são alteradas (p &lt; 0,05) pelo processo de centrifugação. As taxas de fertilidade e de prenhez precoce também não foram influenciadas (p &gt; 0,05) pela adição de plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno. Portanto, podemos concluir que o plasma seminal da fração rica possui efeito benéfico sobre a fisiologia dos espermatozoides pós-descongelação, melhorando a criopreservação do sêmen suíno. / Boar semen cryopreservation is still a challenge due to the extension of cold shock damage. Boar spermatozoa arising from sperm-rich ejaculate fraction are reported to have a more stable plasma membrane, more resistant to cold shock and premature acrosome reaction than spermatozoa from the whole ejaculate. Thus, seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction can increase cryotolerance of boar spermatozoa, and in other domestic species it has the ability to reverse cryopreservation damage. However, the majority of actual sperm evaluation techniques include a single sperm parameter, which makes the sperm characterization of a single population difficult. In this context, this work was performed to validate a sperm flow cytometry fourfold coloration technique for the simultaneous evaluation of plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential. Furthermore, we evaluate the seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction effects on sperm kinetics, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential, tyrosine phosphorylation, membrane fluidity and peroxidation, fertility and early pregnancy rate. The proposed technique is able (R2 &#61; 0.9356; p &lt; 0.01) to simultaneous detection of plasma and acrosomal membrane integrity and high mitochondrial membrane potential (IPIAH). Seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction is able to improve (p &lt; 0.05) total and progressive motility. Furthermore, seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction maintenance/addition was not able to improve (p &gt; 0.05) the IPIAH sperm population, tyrosine phosphorylation, membrane fluidity and peroxidation. However, these sperm characteristics need to be carefully interpreted, once, membrane fluidity and peroxidation could be influenced (p &lt; 0.05) by centrifugation. Fertility and early pregnancy rate we not improved (p &gt; 0.05) by seminal plasma addition. Therefore, we concluded that sperm fourfold coloration can be used to evaluate simultaneously plasma and acrosomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential and that whole sperm-rich fraction seminal plasma can be beneficial to post-thawed sperm physiology, thereby improving boar semen cryopreservation.

O plasma seminal é o constituintes não celular do sêmen suíno e contém uma série de componentes orgânicos e inorgânico que desempenham ações variadas tanto no trato reprodutivo masculino como no feminino. No entanto, este fluido de constituição complexa, exerce ações ambiguas sobre os espermatozoides suínos, pois pode atuar ao mesmo tempo de forma benéfica ou deletéria sobre a viabilidade destas células. Nesse sentido, alguns estudos sugerem que este não é o melhor meio para a conservação de espermatozoides. Desta forma o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do plasma seminal sobre a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial do espermatozoide suíno armazenado sob refrigeração a 17&deg;C por 72 horas. Para tanto, foram obtidos 4 ejaculados de 6 cachaços. Em seguida o sêmen in natura foi avaliado quanto às características da motilidade pelo sistema computadorizado de análise do sêmen, morfologia espermática por contraste de interferência diferencial e concentração espermática. Após essa primeira avaliação, os ejaculados foram acondicionados em tubos cônicos de 50 mL para serem divididos em três tratamentos, a saber: não centrifugado (NC), centrifugado e com o plasma seminal retirado pós-centrifugação (CS) e centrifugado resuspendido (CR). A força de centrifugação utilizada foi de 500xg por 10 minutos. Todos os tratamentos foram submetidos à diluição em meio BTS para que se obtenha uma concentração de 30 x 106 espermatozoides por mililitro (mL). Em seguida, as amostras permaneceram por 90 minutos em temperatura ambiente e protegidas da luz antes de serem armazenadas. As doses com os diferentes tratamentos foram acondicionadas à temperatura de 17&deg;C e foram avaliadas nos intervalos 0 (90 min pós-diluição), 24, 48 e 72 horas para os seguintes parâmetros: características da motilidade (CASA), integridade das membranas plasmática e acrossomal, estabilidade da membrana plasmática e peroxidação das membranas espermáticas (citometria de fluxo). Os tratamentos foram submetidos à análise de variância (PROC GLM), empregando-se o programa SAS (1998). Quando o principal efeito foi significativo, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey-kramer ao nível de 5% de significância. Os resultados do presente estudo mostram que a ausência do plasma seminal foi deletéria para algumas características de motilidade, o mesmo ocorreu para a integridade das membranas plasmática e acrossomal uma vez que houve diminuição na percentagem de celulás espermáticas com membrana plasmatica integra e acrossomo integro no tratamento sem plasma seminal. A peroxidação lipídica das membranas e a manutenção da estabilidade da membrana plasmática não foram influenciadas pelo tratamento. Assim, conclui-se que a presença do plasma seminal em doses inseminantes refrigeradas por 72 h é importante para a manutenção das características de motilidade e para a integridade das membranas plasmáticas e acrossomal / The present study aimed to evaluate the effects of seminal plasma, from the rich fraction of the ejaculate, on kinetics, plasma and acrosome membrane integrity, lipid peroxidation and capacitation of extended liquid boar semen stored under refrigeration at 17&deg; C for 72 hours. For this purpose, four ejaculates from each of six boars were used. Shortly after collection and raw semen evaluation, ejaculates were extended in BTS medium and then assigned to one of three treatments, as follows: non-washed seminal plasma (NWSP), washed-seminal plasma (WSP) centrifuged with own seminal plasma suspended (CWSSP). All treatments were evaluated for sperm motility parameters by the sperm class analyzer (SCA). Plasma and acrosome membrane integrity, lipid peroxidation and sperm capacitation were evaluated by flow cytometry at 0, 24, 48 and 72 hours post dilution. The mean percentage of sperm motility (total and progressive) were lower (p&lt;0.05) in the WSP treatment. There was an increase (p&lt;0.05) in the percentage of sperm with damaged acrosome and damage plasma membrane in the WSP treatment. Membrane lipid peroxidation did not differ (p&gt;0.05) irrespective of treatment nor did sperm capacitation, which was similar (p&gt;0.05) among treatments. Our results show that seminal plasma from the sperm rich fraction is important to maintain adequate structural and functional characteristics of extended liquid boar and should be present in seminal doses throughout the period of store

Estudou-se o perfil de proteínas de plasma seminal de touros das raças Nelore (Bos taurus primigerus indicus) e Simental (Bos taurus primigerus taurus), criados a campo, em regime de acasalamento múltiplo e manejo extensivo, na região de Dourados/MS, a fim de analisar a relação entre estas proteínas e características ligadas ao desempenho reprodutivo de touros. Coletaram-se amostras de sêmen no período de inverno (Julho/2001) e verão (Fevereiro/2002), realizando-se inicialmente o exame andrológico nos animais, e em seguida a análise padrão do sêmen. O plasma seminal foi, então, submetido à dosagem de proteínas totais, à dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), para avaliação da ocorrência de lipoperoxidação, e à eletroforese bidimensional de proteínas. Para análise do perfil proteico de plasma seminal da cada raça, foram utilizados os seguintes parâmetros: comparação entre os períodos de inverno e verão; comparação de grupos de amostras separados de acordo com a quantificação de características ligadas ao desempenho reprodutivo (morfologia espermática, dosagem de proteína total e dosagem de TBARS); e comparação de grupos de amostras separados de acordo com classificações para avaliação da capacidade reprodutiva, previamente descritas na literatura (Breeding Soundness Evaluations – BSEs). Os touros da raça Simental demonstraram menor adaptação às condições ambientais tropicais, com valores mais altos de defeitos espermáticos maiores, proteína total e dosagem de TBARS no período de verão. Observou-se grande variabilidade no perfil proteico entre as raças Nelore e Simental e, dentro de cada raça, encontrou-se expressiva variação individual. O perfil de proteínas de plasma seminal de touros Nelore apresentou 155 spots, entre os quais 04 se destacaram como possíveis marcadores de características ligadas ao desempenho reprodutivo. Já na raça Simental foram identificados 248 spots, com destaque para 04 spots, que demonstraram maior potencial como marcadores de características de interesse para a reprodução. Os resultados mostram que o perfil de proteínas de plasma seminal está relacionado ao desempenho reprodutivo de touros, fazendo-se necessários maiores estudos sobre as proteínas que se destacaram como marcadores, a fim de identificar as funções que elas exercem no trato reprodutivo e nos eventos ligados à fertilização. / Seminal plasma proteins profiles from Nelore (Bos taurus primigerus indicus) and Simmental (Bos taurus primigerus taurus) bulls, used for multiple-sire breeding under range conditions, at Dourados/MS region, were studied aiming to analyze the relation between these proteins and traits linked to bulls’ reproductive performance. Semen samples were collected in the winter (July/2001) and summer (February/2002). Initially, an andrological examination was performed, followed by standard semen analysis. Seminal plasma was subjected to total protein quantification, thiobarbituric acid reactive substances quantification (TBARS, to evaluate lipid peroxidation), and two-dimensional protein electrophoresis. To analyze seminal plasma protein profile of each breed, the following parameters were used: comparison between winter and summer, comparison among groups of samples divided by quantification of traits linked to reproductive performance (sperm morphology, total protein quantification, TBARS quantification) and comparison among groups of samples divided by breeding soundness evaluations (BSEs), previously reported in literature. Simmental bulls showed lower adaptability to tropical environment conditions, with higher values of major sperm defects, total protein and TBARS in the summer. A great variability was observed in the protein profile between Nelore and Simmental breeds, and, for each breed it was found great individual variability too. Nelore seminal plasma protein profile presented 155 spots, 04 of which were considered potential markers for traits linked to reproductive performance. For Simmental breed, 248 spots were identified, with special interest for 04 spots, which showed higher potential as markers to reproductive characteristics. Results show that seminal plasma protein profile is related to bulls’ reproductive performance. Further studies about those proteins which are potential markers are needed, to determine their function at bulls’ reproductive system and in the events related to fertilization.