La ubiquitinació és una modificació postraduccional de proteïnes empleada en la regulació de molts tipus diferents de senyalitzacions cel·lulars i processos biològics. Els enzims responsables d'aquesta modificació postraduccional són les E1 o enzims d'activació de ubiquitines, les E2 o enzims de conjugació de ubiquitines i les E3 o lligases de ubiquitines i poden conjugar una o més ubiquitines sobre la proteïna substrat.L'heterodimer format per UBC13-UEV te activitat de conjugació de ubiquitines mitjançant enllaços que utilitzen la lisina en posició 63 de la ubiquitina en contes de la lisina en posició 48. Aquesta modificació no es reconeguda pel proteasoma i per tant no implica una degradació de la proteïna que la porta. La cerca de proteïnes que interactuen amb UBC13 ens va permetre de identificar dues proteines: RNF8 i KIAA0675 que contenen un domini RING finger, pel qual interactuen amb UBC13. RNF8 te activitat autocatalítica de lligasa de ubiquitines, el que li permet elongar cadenes de poliubiquitines tant per lisina 48 com per lisina 63; aquesta darrera depèn de l'activitat catalítica de UBC13. A més, RNF8 co-localitza amb UBC13 en estructures nuclears.L'estructura en dominis d'RNF8 és la mateixa que la del regulador del checkpoint mitòtic CHFR, ambdues proteïnes tenen un domini RING finger de reclutament d'enzims de conjugació de ubiquitines, al extrem amino terminal i un domini FHA de reconeixement de fosfopèptids. RNF8 localitza en el nucli cel·lular i te un patró d'expressió depenent de cicle amb uns nivells proteics que augmenten progressivament de G1 a M, assolint un màxim en metafase seguit d'una brusca desaparició en anafase i una recuperació de l'expressió de la proteïna en fases més tardanes de la mitosi. La sobre-expressió de RNF8 causa una reducció de la població en G2-M i una acumulació de cèl·lules en G1. La depleció d'RNF8 mitjançant la tècnica de RNAi no causa cap efecte significatiu sobre el cicle cel·lular basal. En canvi, la depleció d'RNF8 causa un retard en la sortida de mitosi després d'un arrest induït per nocodazole, fet que s'associa amb una reducció del turnover de la ciclina B1, que és un substrat de l'APC/C. Recíprocament, la sobre-expressió de RNF8 impedeix a les cèl·lules d'acumular-se en G2-M en resposta a un tractament amb nocodazole. A més l'activació del Spindle Assembly Checkpoint (SAC), mitjançant un breu tractament amb nocodazole, en combinació amb la sobre-expressió d'RNF8 impedeix que la proteïna del checkpoint Mad2 es localitzi als quinetocors. Aquesta funció d'RNF8 depèn de l'activitat lligasa ja que un mutant d'RNF8 incapaç de conjugar ubiquitines produeix uns efectes significativament atenuats en comparació amb la proteïna salvatge. Aquestes observacions suggereixen que RNF8 és un regulador negatiu del SAC i permet la reactivació de l'APC/C en condicions d'estrès mitòtic.A més, RNF8 presenta activitat pro-apoptòtica. L'expressió ectòpica d'RNF8 en cèl·lules HeLa activa les caspases-3 i -8 i l'activitat pro-apoptòtica resultant es pot inhibir mitjançant la incubació amb els inhibidors de caspases ZVAD i ZDEVD. La mort cel·lular induïda per RNF8 es veu atenuada en gran mesura per la sobre-expressió del mutant d'RNF8 que no te activitat lligasa de ubiquitines. El tractament amb diferents agents genotòxics provoca una acumulació dosi-depenent de la proteïna RNF8 endògena que no es correlaciona amb un increment dels nivells de transcrit. Finalment, la depleció d'RNF8 permet a les cèl·lules HeLa de ser més resistents al tractament amb etopòsid, suggerint que RNF8 te un paper important regulant la mort cel·lular causada per aquesta droga. / Ubiquitylation is a post-translational protein modification, which regulates very different signaling pathways and biological processes. Ubiquitylation occurs thanks to the catalytic activity of ubiquitin activating enzymes or E1, ubiquitin conjugating enzymes or E2 and ubiquitin ligases or E3 and the substrate can be modified with one or more ubiquitin moieties that form polyubiquitin chains.The heterodimeric ubiquitin conjugating enzyme (E2) UBC13-UEV mediates polyubiquitylation through lysine 63 of ubiquitin (K63), rather than lysine 48 (K48). This modification does not target proteins for proteasome-dependent degradation. Searching for potential regulators of this variant polyubiquitylation we have identified two proteins, namely RNF8, KIA00675, that interact with UBC13 through their RING finger domains. These domains can recruit, in addition to UBC13, other E2's that mediate canonical (K48) polyubiquitylation. RNF8 has ubiquitin ligase autocatalytic activity that elongates chains through either K48 or K63 of ubiquitin, and UBC13 activity is required to elongate the latter chains. RNF8 and UBC13 co-localize in the nucleus.RNF8 is a ubiquitin ligase that bears a FHA domain near its amino end, and a RING finger domain at its carboxy terminus, through which it can recruit several ubiquitin-conjugating enzymes. In metazoans, only the mitotic checkpoint regulator CHFR shares this domain architecture. RNF8 follows a cell-cycle-dependent turnover, with levels increasing from G1 to M, reaching a maximum at metaphase, followed by an abrupt decline at anaphase, and recovery of protein levels at the end of mitosis. Overexpression of RNF8 caused a reduction of the G2-M population and an accumulation of cells in G1, while siRNA depletion did not significantly alter the basal cell cycle. Depletion of RNF8 caused a delay in the exit from nocodazole-induced arrest, which was associated with a reduced turnover of the APC/C substrate cyclin B1. Conversely, cells overexpressing RNF8 failed to arrest at G2-M upon treatment with nocodazole. In addition, activation of the spindle assembly checkpoint with a brief exposure to nocodazole in combination with RNF8 overexpression prevented the localization of Mad2 to kinetochores. These functions of RNF8 were dependent on its ubiquitin ligase activity, since a ligase-inactive mutant produced significantly attenuated effects as compared to the wild-type protein. Taken together, these observations suggest that RNF8 is a negative regulator of the spindle assembly checkpoint that reactivates the APC/C under conditions of mitotic stress.In addition,RNF8 functions as a proapoptotic protein. Ectopic expression of RNF8 in HeLa cells induced the activation of caspases 3 and 8, and the ensuing apoptosis was prevented by incubation with the caspase inhibitors ZVAD and ZDEVD. The apoptotic death induced by RNF8 was greatly attenuated by introduction of a point mutation in its RING finger domain that rendered it non-functional as a ubiquitin ligase, indicating that this function is essential for the proapoptotic activity of RNF8. Treatment with DNA-damaging agents causes a dose-dependent accumulation of endogenous RNF8 without increasing its mRNA levels. Finally, depletion of RNF8 with specific siRNA duplexes effectively prevented the apoptosis and caspase-3 up regulation induced by the topoisomerase II inhibitor etoposide, suggesting that RNF8 plays a major role in regulating apoptotic death caused by DNA damaging agent.

El treball que es presenta en aquesta tesi pretén contribuir al camp de la ciència de superfícies biològiques, amb el desenvolupament de superfícies adaptades amb cadenes lateral reactives per tal de unir covalentment biomolècul·les d'interès a la superfície.La polimerització assistida per plasma del recobriments actius és un mètode atractiu per tal d'obtenir cadenes laterals reactives, mitjançant pel·lícules nanomètriques amb densitats de grups funcionals adaptats. Sota control de les condicions experimentals, l'estructura del dipòsit polimèric es pot control i les estructures químiques obtingudes poden variar des de xarxes polimèriques altament funcionalitzades amb baixa reticulació fins a xarxes altament reticulades amb baix contingut funcional. La recerca descrita en aquesta tesi tracta de la modificació de superfície de diversos substrats per polimerització de plasma. La part essencial del treball es dirigeix cap al funcionalització amb grups èster de pentafluorofenil a la superfície, durant la polimerització per grafting i polimerització de plasma pulsat de pentafluofenil metacrilat. Aquesta classe de grup làbil és de gran interès per a la seva fàcil reactivitat amb molècules amb mines terminals, com pèptids. Altres monòmers comercials també s'han emprat al començament de l'estudi, com a primera aproximació a les tècniques de plasma. La caracterització d'aquestes superfícies s'ha fet a través de tècniques analítiques com FTIR, XPS, AFM o ToF - SIMS entre d'altres.A més, s'ha dut a terme un estudi per fer a mida el polímer de PFM per a millorar la retenció de la seva estructura, i així com un estudi profund de la seva reactivitat davant de molècules amb amines terminals diferents d'interès, afegint SPR o l'aplicació de sensors microcantiliver a les tècniques de caracterització per aconseguir una millor comprensió de la química i cinètica de la reacció.Sobre el propòsit d'aconseguir superfícies funcionalitzades útils, s'ha realitzat un patterning de les superfícies amb l'ús de màscares per a capa selectiva de les mostres per controlar les àrees modificades. Això s'ha fet per a l'aplicació d'aquesta pel·lícula a dispositius reals, així com a prova de la seva biocompatibilitat per cultiu cel·lular i per assaigs in vivo. / El trabajo que se presenta en esta tesis pretende contribuir al campo de la ciencia de superficies biológicas, con el desarrollo de superficies adaptadas con cadenas lateral reactivas con el fin de unir covalentemente biomoléculas de interés a la superficie.La polimerización asistida por plasma de recubrimientos activos es un método atractivo con el fin de obtener cadenas laterales reactivas, mediante películas nanométricas con densidades de grupos funcionales adaptados. Bajo control de las condiciones experimentales, la estructura del depósito polimérico se puede control y las estructuras químicas obtenidas pueden variar desde redes poliméricas altamente funcionalitzadas con baja reticulación hasta redes altamente reticuladas con bajo contenido funcional.La investigación descrita en esta tesis trata de la modificación de superficie de diversos sustratos por polimerización de plasma. La parte esencial del trabajo se dirige hacia el funcionalización con grupos éster de pentafluorofenilo en la superficie, durante la polimerización por grafting y polimerización de plasma pulsado de pentafluofenilmetacrilato. Esta clase de grupo lábil es de gran interés para su fácil reactividad con moléculas con minas terminales, como péptidos. Otros monómeros comerciales también se han servido al principio del estudio, como primera aproximación a las técnicas de plasma. La caracterización de estas superficies se ha hecho a través de técnicas analíticas como FTIR, XPS, AFM o ToF - SIMS entre otros. Además, se ha llevado a cabo un estudio para hacer a medida el polímero de PFM para mejorar la retención de su estructura, y así como un estudio profundo de su reactividad delante de moléculas con aminas terminales diferentes de interés, añadiendo SPR o la aplicación de sensores microcantiliver a las técnicas de caracterización para conseguir una mejor comprensión de la química y cinética de la reacción.Sobre el propósito de conseguir superficies funcionalizadas útiles, se ha realizado un patterning de las superficies con el uso de máscaras para capa selectiva de las muestras para controlar las áreas modificadas. Eso se ha hecho para la aplicación de esta película en dispositivos reales, así como a prueba de su biocompatibillidad por cultivo celular y para ensayos in vivo. / The work presented in this thesis has the main aim to contribute in the field of biological surface science, by developing tailored surfaces with reactive side chains in order to attach desired biomolecules to the surface by a covalent link. Plasma polymerization of surface active coatings is an attractive method to obtain reactive side chains, by making nanometer thick films of tailored functional group densities. By controlling the experimental conditions, the structure of the polymer deposit can be largely controlled and the chemical structures obtained can range from highly functional polymer networks of low cross link density to polymer networks of low functional group but high cross link densities. The research described in this thesis deals with the surface modification of various substrates by plasma polymerization. The major part of the work is directed towards the funtionalization with pentafluorophenyl ester groups on the surface, through the grafting polymerization and pulsed plasma polymerization of pentafluophenyl methacrylate. This kind of labile group is of high interest for its easy reactivity to amino terminated molecules, such as peptides. Other commercial monomers were also used at the beginning of the study, as a first approach to the plasma techniques. The characterization of these surfaces is done through several analytical techniques as FTIR, XPS, AFM or ToF-SIMS among others. Furthermore, a study for tailoring the PFM polymer for better structure retention and deep study of its reactivity in front of different amino terminated molecules of interest was performed, adding SPR or the implementation of microcantilever sensors to the characterization techniques to achieve a better understanding of the chemistry and kinetic of the reaction, in order to achieve the best peptide binding for reliable well characterized bioactive interface..On the aim of achieving useful functionalized surfaces, a patterning of the surfaces with the use of masks for selective coating of the samples has been performed to control the modified areas. This has been done for application of this film to real devices, as well as to test of its biocompatibility by cell culture and in vivo assays.