Abscission marks the last step of cytokinesis and gives rise to two physically separated daughter cells and a midbody remnant. This work studies abscission by examining the extent of the abscission failure in C. elegans septin and ESCRT mutants with the help of the ZF1-degradation technique. The ZF1 technique is also applied to discern a possible role for PI3K during abscission. Lastly, we test the role of proteins required for macroautophagy but not for LC3-associated phagocytosis (LAP) and show that after release into the extracellular space, the midbody is resolved via LAP. / Durch Abszission, den letzten Schritt der Zytokinese, entstehen zwei physisch voneinander getrennte Tochterzellen und ein Mittelkörper, auch Flemming-Körper oder Midbody genannt. In dieser Arbeit wird mittels ZF1-vermittelter Abbautechnik in C. elegans Septin- und ESCRT-Mutanten das Ausmaß eines Abszissionsdefekts untersucht. Die ZF1-Technik wird ebenso eingesetzt, um eine mögliche Rolle von PI3K in Abszission festzustellen. Schließlich wird die Rolle von Proteinen erforderlich für Makroautophagie aber nicht für LC3-assoziierte Phagozytose (LAP) getestet und gezeigt, dass der Midbody nach Freilassung in den extrazellulären Raum mittels LAP verarbeitet wird.

L’émergence de phénomènes de résistance au paclitaxel (Taxol®), un agent stabilisateur de microtubules (MTs), est un obstacle majeur au succès de cette molécule dans les chimiothérapies anticancéreuses et limite son utilisation. Au laboratoire, un nouveau mécanisme de résistance au Taxol® a été mis en évidence dans les cellules tumorales mammaires MDA-MB 231. Il est basé sur une restauration de la dynamique microtubulaire et implique i) deux modifications post-traductionnelles de la tubuline (MPTs), la détyrosination/retyrosination et la polyglutamylation et ii) la surexpression et la relocalisation du cytosquelette d’actine sur les MTs de plusieurs septines, des GTPases filamenteuses impliquées dans la cytocinèse et la compartimentation membranaire. Plus précisément, une boucle fonctionnelle entre le recrutement des septines et la polyglutamylation des MTs a été démontrée : la polyglutamylation de la tubuline stimule le recrutement des septines sur les MTs et les septines jouent un rôle de protéine d’échafaudage pour les enzymes responsables de la polyglutamylation, favorisant l’élongation des chaines latérales de glutamate. Toutes ces modifications résultent en un recrutement accru sur les MTs de deux +TIPs, la kinésine dépolymérisante MCAK et le facteur de sauvetage CLIP-170, permettant ainsi de maintenir une dynamique microtubulaire malgré la présence du paclitaxel.De plus, l’étude de la contribution relative de chacun de ces acteurs dans ce mécanisme de chimiorésistance a permis de montrer que la stimulation de la polyglutamylation associée à la surexpression d’un ensemble de septines incluant la SEPT9_i1 est indispensable et suffisante pour induire une relocalisation des septines des microfilaments d’actine vers les MTs, une augmentation de la liaison de CLIP-170 et de MCAK aux MTs et une résistance au paclitaxel, non seulement dans les MDA-MB 231 mais aussi dans un certain nombre de lignées cellulaires sensibles (RPE-1, HeLa et CHO). L’analyse de ce phénomène a par ailleurs permis de montrer qu’à l’état basal, dans des cellules chimiosensibles, les MTs jouent un rôle essentiel dans l’organisation subcellulaire des filaments de septines sur l’actine, qu’un transport dépendant de la kinésine-1 était impliqué. / Acquired resistance to the microtubule (MT)-stabilizing agent paclitaxel (Taxol®) is a major obstacle for successful chemotherapy and limits its use as an anticancer drug. We evidenced a new mechanism of Taxol® resistance acquired by MDA-MB 231 breast cancer cells which is based on the restoration of MTs dynamics and involves i) two tubulin post-translational modifications (PTMs); detyrosination/retyrosination and polyglutamylation, and ii) overexpression and relocalization from the actin microfilaments to the MT network of several septins, a family of filamentous GTPases implicated in cytokinesis and membrane compartmentalization. More precisely, a functional loop between septin recruitment to MTs and tubulin polyglutamylation has been uncovered: tubulin polyglutamylation stimulates septin association with MTs, and septins act as scaffold proteins for tubulin polyglutamylation enzymes, thus promoting the elongation of lateral polyglutamate chains. Altogether, these modifications enhance the recruitment to MTs of two +TIPs, the MT-depolymerizing kinesin MCAK and the rescue factor CLIP-170, which would in turn compensate for paclitaxel-mediated inhibition of MT dynamics.Studying the relative contribution of each of these actors in this new chemoresistance mechanism further showed that stimulation of tubulin polyglutamylation together with the overexpression of a panel of septins that comprised the SEPT9_i1 isoform were necessary and sufficient to relocate septin filaments from actin microfilaments to MTs, to increase the binding of CLIP-170 and MCAK to MTs and to induce Taxol®-resistance, not only in MDA-MB 231but also in several other Taxol®-sensitive cell lines (RPE-1, HeLa and CHO). The analysis of this phenomenon also showed that, in Taxol®-sensitive cells, MTs play an essential role in the assembly and subcellular localization of septin filaments to actin microfilaments, and that a kinesin1-dependent transport is involved.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) et le cholangiocarcinome (CCA) sont 2 types de cancer primitif du foie. Le CHC est le plus fréquent, cependant l’incidence du CCA augmente partout dans le monde avec un diagnostic difficile, un mauvais pronostic et des thérapies très limitées. Ce travail avait pour objectif d'identifier des cibles pour le diagnostic et la thérapeutique du CCA. Il est basé sur l'étude de la septine 9 et des phosphoinositides (PIs). La septine 9 appartient à une famille de GTPases qui participent à l’organisation des microtubules et du cytosquelette d’actine. Les septines sont impliquées dans la cytokinèse, le trafic vésiculaire et la polarité cellulaire, elles sont aussi des partenaires importantes des PIs. Pour déterminer le rôle de la septine 9 dans le CCA nous nous sommes intéressés à son interaction avec les PIs et avec l’inhibiteur de l’inducteur et activateur de la transcription 1 (PIAS1) qui a été décrite comme une protéine pouvant agir comme une SUMO ligase pour les septines. Nous avons étudié l’expression de la septine 9 et de PIAS1 dans le CCA et le CHC. Nous avons mis en évidence un mécanisme original par lequel, la production du PtdIns5P (Phosphatidylinositol -5-phosphate) permet un recrutement de la septine 9, la stabilisation des microtubules et le transport de PIAS1 du cytoplasme vers le noyau. Il démontre un rôle important des septines en association avec les PIs dans le trafic. De plus, nous avons montré que la septine 9 est un régulateur de la signalisation de l’interféron γ qui agit au niveau de la phosphorylation de STAT1 et l’entrée de PIAS1 dans le noyau. Ce travail peut constituer une nouvelle piste pour la recherche des thérapies ciblées en immunothérapie dans le traitement de ce cancer. / Hepatocellular carcinoma (HCC) and cholangiocarcinoma (CCA) are two types of primary liver cancer. HCC is the most frequent, however the incidence of CCA increases throughout the world with a difficult diagnosis, poor prognosis and very limited therapies. The objective of this work was to identify targets for the diagnosis and treatment of CCA. It is based on the study of septin 9 and phosphoinositides (PIs). Septin 9 belongs to a family of GTPases that participate in the organization of microtubules and the actin cytoskeleton. Septins are involved in cytokinesis, vesicular trafficking and cellular polarity and are also important partners of PIs. To determine the role of septin 9 in the CCA, we investigated its interaction with PIs and with Protein inhibitory of activated STAT1 (PIAS1), which has been described as a SUMO ligase for septins. We studied the expression of septin 9 and PIAS1 in CCA and CHC. We have demonstrated an original mechanism by which la production of PtdIns5P allows the recruitment of septin 9, the stabilization of microtubules and the transport of PIAS1 from the cytoplasm to the nucleus. It demonstrates an important role of the septins in association with the PIs in trafficking. Besides, we have shown that septin 9 is a regulator of interferon γ signaling which acts at the level of the phosphorylation of STAT1 and the entry of PIAS1 into the nucleus. This work can constitute a new avenue for the research of targeted immunotherapy for this cancer.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la tumeur maligne primitive du foie la plus fréquente (90 % des cas). Le CHC est le cinquième cancer par ordre de fréquence à l'échelon mondial, la troisième cause de décès par cancer dans le monde entier et son incidence est actuellement croissante. Parmi Les principaux facteurs prédictifs de survenue de CHC ; les altérations génétiques, l'alcool et les infections par les virus des hépatites B (VHB) et C (VHC). Les travaux de thèse en cotutelle menés entre l’Universités Paris Sud 11-France et l’Université Mohammed V- Rabat –MAROC ont porté essentiellement sur l’étude de deux facteurs de risque impliqués dans le développement du carcinome hépatocellulaire ; le polymorphisme génétique et l’infection par le virus de l’hépatite C. Dans un premier temps, ce travail de recherche s’est focalisée sur l’éventuelle relation pouvant liée les polymorphismes génétiques des gènes PCAF, P300 au carcinome hépatocellulaire. Sur le plan génétique nous avons constaté que les génotypes Val/Val de EP300 et Ser/Ser de PCAF apparaissent comme les plus associés à l’hépatocarcinome. Par ailleurs, ces derniers se trouvent associés d’une manière significative au carcinome hépatocellulaire. Par la suite, notre travail a consisté à mieux caractériser la variabilité génétique du HCV et l’épidémiologie des souches virales chez la population marocaine pour lesquelles peu de données étaient disponibles. Les analyses phylogénétiques des régions NS5B et E2 et les données épidémiologiques recueillies ont permis de répondre à ces questions. Enfin, La dernière partie des travaux de cette thèse vise à identifier des facteurs cellulaires essentiels à la réplication du VHC, dans l’objectif de définir de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des hépatites virales C. Nous avons pu identifier la septine 9 comme facteur cellulaire impliqué dans le cycle de vie virale du HCV, ainsi que les protéines PIAS1 et SUMO1 comme protéines régulatrices de la septine 9. De plus nous avons pu établir la relation entre ces protéines cellulaires dont la présence est nécessaire à la fois à la production des protéines virales ( CORE et E2) et à la réplication du virus dans la cellule hôte. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most common cause of cancer worldwide and the third most common cause of cancer mortality. HCC is one of the few cancers with welldefined major risk factors. Major causes of HCC include hepatitis B, hepatitis C, alcoholic liver disease, nonalcoholic, steatohepatitis, hereditary hemochromatosis, and geneticalteration. The multifactorial causes of HCC might explain its complex molecular pathogenesis. Detailed understanding of epidemiologic factors and molecular mechanisms associated with HCC ultimately could improve our current concepts for screening and treatment of this disease. With a view toward current concepts for screening of this disease, first, we analyzed a genetic susceptibility to hepatocellular carcinoma. The aim of the current study was to assess the impact of the Ile997Val in EP300 and Asn386Ser in PCAF polymorphisms on the risk of HCC. we found that the Val/Val of the EP300 at codon 997 and Ser/Ser of the PCAF at codon 386 were associated with an increased risk of HCC in the Moroccan population. A higher risk of HCC was observed in HCV-negative subjects. We also found that male with Ser/Ser in thePCAF gene and women with Val/Val genotype of the EP300 had a higher risk to develop HCC. It appears that variants of the transcriptional coactivator genes (EP300 and PCAF) may influence HCC risk in populations with low mutations or hromosomal instability rates. Additional surveys are warranted to confirm this first report. The incidence of HCC is increasing in Western countries, mostly because of the high prevalence of hepatitis C virus (HCV) infection. In this sense, we have tried to identify new host factors involved in replication of HCV. Hepatitis C virus (HCV) replicates in the liver,and chronic infection often leads to cirrhosis, steatosis, and hepatocellular carcinoma. There is no vaccine to protect against HCV infection. Major improvement has been recently achieved regarding treatment of HCV infection however there is already evidence for emergence of resistance due to the high genetic variability of the HCV RNA genome. Thus it should be important, to design therapies which avoid genotypic resistance by targeting cellular proteins. Understanding the mechanisms that allow proper assembly and intracellular trafficking of HCV proteins may have a profound impact on the treatment efficacy. An important hallmark of chronic HCV infection is liver steatosis associated with the accumulation of lipid droplets (LDs). The LDs accumulated in the HCV infected cells and the HCV core protein induces the redistribution of LDs, through the clustering of these organelles in the perinuclear area, providing a platform for virus assembly and in the production of infectious particles. Several host proteins have been proposed to facilitate the replication of HCV however much is needed to elucidate the implicated mechanisms. Here we report that HCV infection increases expression and formation of septin 9 filament surrounding HCV core. Data of our study revealed the highest expression of septin 9 in samples from hepatocellular carcinoma (HCC) from patients with chronic HCV infection. Indeed, we brought newperception of septin 9 function regarding both microtubule and lipid structure organization. We proposed that HCV infection conducts to assembly of septin 9 in filaments through PIAS1. This may provide scaffolds to organize the microtubules network and LDs redistribution required for HCV assembly and replication. This study illuminates a new function of septin 9 in HCV life cycle through its association with lipids and microtubules. These events might depend on septin 9 SUMO1 modification by PIAS1. These findings also provide a step forwards in understanding the relationship between HCV and its host and open new therapeutic directions.

La cytokinèse est un processus fondamental prenant place à la fin de la mitose et permettant la séparation des deux cellules filles. Un défaut de cytokinèse peut mener à une ségrégation anormale des chromosomes et engendrer des phénomènes de cancer. Dans beaucoup d'organismes eucaryotes, la cytokinèse nécessite l'assemblage et la contraction d'un anneau d'actomyosine permettant la formation d'un sillon et la réorganisation de la membrane cellulaire au site de clivage. Dans la plupart de ces organismes, des protéines du cytosquelette appelées septines participent à la cytokinèse. Chez la levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae, cinq septines sont exprimées durant la mitose (Cdc3, Cdc10, Cdc11, Cdc12 et Shs1). Ces protéines ont la capacité de s'assembler en un anneau au niveau du site de bourgeonnement, lieu de séparation entre la cellule mère et la cellule fille. Cet anneau de septines permet la fixation et le recrutement de nombreuses protéines intervenant dans la cytokinèse. La dynamique des septines change durant le cycle cellulaire, ce qui a une importance dans la régulation de la cytokinèse. La stabilisation de cet anneau est accompagnée d'un changement du niveau de phosphorylation des septines, mais les kinases responsables de ces modifications restent inconnues. Les travaux de l'équipe de Simonetta Piatti ont mis en évidence un nouveau rôle de la GTPase Rho1 et de sa cible, la protéine kinase C (Pkc1), dans la régulation de la dynamique des septines. Le but de ce travail de thèse était de déterminer les voies moléculaires par lesquelles la protéine Pkc1 intervient dans le recrutement et la stabilisation de l'anneau de septines. Pour se faire nous avons purifié le complexe de septines chez la levure bourgeonnante en présence ou en absence de la protéine Pkc1 et nous l'avons analysé par spectrométrie de masse. Cette analyse nous a permis d'observer que le niveau de phosphorylation d'un cluster (îlot) de 5 sérines était diminué sur Shs1. L'alignement de séquence nous a permis de constater que ce domaine était conservé dans la septine Cdc11. Par ailleurs ces deux protéines sont connues pour jouer un rôle dans l'assemblage des filaments et la formation de l'anneau de septines. Il a déjà été observé qu'un mutant phosphomimétique du cluster de sérine de la septine Shs1 empêche la formation des filaments in-vitro. Nous avons voulu caractériser le rôle de ce cluster dans la protéine Cdc11 en créant un mutant non-phosphorylable (CDC11-9A) et un mutant phosphomimétique (CDC11-9D). De manière très évidente, le mutant phosphomimétique provoque des problèmes de cytokinèse dans les cellules dont le gène codant la protéine Shs1 a été supprimé. A l'inverse le mutant non-phosphorylable améliore le phénotype des cellules ne comportant pas Shs1. Ces résultats sont en parfait accord avec l'observation selon laquelle les protéines Shs1 et Cdc11 pourraient avoir des fonctions très similaires, et mettent en avant le rôle important du cluster de sérines phosphorylées de Cdc11 lors de la cytokinèse. Nous avons constaté que Pkc1 ne phosphoryle pas directement les septines, mais agit par l'intermédiaire de kinases et de phosphatases impliquées dans la régulation des septines. Nous avons pu montrer que Pkc1 régule l'interaction de Gin4 avec les septines, cette kinase étant connue pour sa capacité à phosphoryler Shs1. De plus, nous avons observé que Pkc1 impacte sur le niveau de phosphorylation des deux autres kinases de la même famille, Hsl1 et Kcc4. Par ailleurs, la délétion de PKC1 diminue drastiquement la quantité de protéines Kcc4 dans la cellule.L'absence de Pkc1 augmente également l'interaction entre les septines et Bni4, une sous-unité régulatrice de la phosphatase PP1. Nous avons également observé que Bni4-PP1 peut déphosphoryler Cdc11, expliquant la diminution de son niveau de phosphorylation en cas d'absence de la protéine Pkc1.Ces travaux mettent en évidence que Pkc1 est un nouveau régulateur majeur des septines dans la levure. / Cytokinesis is the last step of mitosis and is the fundamental process leading to the physical separation of two daughter cells. Defects in cytokinesis generate polyploid cells that are prone to chromosome missegregation and cancer development. In animal cells and fungi, cytokinesis requires the formation and contraction of an actomyosin ring that drives ingression of the cleavage furrow. Additional cytoskeletal proteins called septins contribute to cytokinesis. In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, five different septins are expressed during the mitotic cell cycle (Cdc3, Cdc10, Cdc11, Cdc12 and Shs1). All septins, except for Shs1, are essential for cell viability. Yeast septins form filaments that in turn organize into a ring at the bud neck, which is the constriction between the mother and the future daughter cell where cytokinesis takes place. The septin ring then expands into a rigid septin collar that acts as scaffold for cytokinesis by recruiting most cytokinetic proteins to the bud neck. Cell cycle-regulated changes in septin ring dynamics are thought to be important for its cytokinetic functions and formation of the rigid septin collar is accompanied by septin phosphorylation. However, the kinases responsible for these modifications have not been fully characterized. Unpublished data from our laboratory indicate that the Rho1 GTPase, which is essential for actomyosin ring formation and contraction, and its target protein kinase C (Pkc1) contribute to deposition and stabilization of the septin ring. Here, we have addressed how Pkc1 regulates septin ring deposition and/or stability. To this end, septin complexes were purified from yeast and analyzed by mass spectrometry, comparing wild type and pkc1Δ mutant cells. This mass spectrometry analysis clearly showed that phosphorylation of a cluster of residues in Shs1 decreased in the absence of Pkc1. Interestingly, we found that this cluster is conserved in the septin Cdc11, which together with Shs1 is known to play an important role in the assembly of high-order structures like filaments and rings. Phosphomimetic mutations of the phosphorylatable cluster in Shs1 have been previously shown to disrupt filament formation in-vitro. We therefore proceeded to mutagenise the same cluster in Cdc11, generating a phosphomimetic (CDC11-9D) and in a non-phosphorylatable mutant (CDC11-9A). Strikingly, the phosphomimetic CDC11-9D caused cytokinesis defects in cells lacking Shs1, whereas the non-phosphorylatable CDC11-9A allele partially rescued the sickness of shs1∆ mutant cells. These observations are in agreement with the notion that Cdc11 and Shs1 share overlapping functions and highlight an important role of the phosphorylatable cluster of Cdc11 for cytokinesis. We also found that Pkc1 does not phosphorylate septins directly, but rather regulates the activity of septin kinases and phosphatases. Consistently, we show that Pkc1 affects the interaction between septins and the bud neck kinase Gin4, which is known to interact with septins and to phosphorylate them. In addition, Pkc1 impacts on the phosphorylation of two additional bud neck kinases, Hsl1 and Kcc4, which are part of the same family of Nim1-related kinases as Gin4. In addition, PKC1 deletion leads to a dramatic decrease in the levels of Kcc4 , so that it is barely detected at the bud neck.Deletion of PKC1 affects also the interaction between septins and the Bni4 protein, which is a regulatory subunit for the PP1 phosphatase at the bud neck. In turn, we found that Bni4-PP1 modulates Cdc11 phosphorylation, thereby explaining how the latter is decreased in the absence of Pkc1. Altogether, our data strongly suggest that Pkc1 is a novel major regulator of septins in yeast.

Les septines sont une famille de protéines GTPases qui peuvent former des structures d'ordre supérieur, comme les filaments et les anneaux, et capables de se lier avec les membranes cellulaires par leur interaction avec les phosphoinositides (PIs) via un domaine polybasique en N-terminal de leur domaine de liaison au GTP. Nous avons montré par une analyse transcriptomique réalisée en utilisant les données GSE14323 que la septine 9 est significativement surexprimée dans la cirrhose induite par le virus de l'hepatite C (VHC). Nos résultats montrent, ainsi, que la septine 9 induit l’augmentation en taille des gouttelettes lipidiques (GLs) par un mécanisme dépendant le phosphatidylinositol-5-phosphate et des microtubules. Nous avons montré, également, que cette voie de régulation des GLs est exploité par le VHC. De plus, nous avons montré que la septine 9 est impliquée dans la régulation de la morphologie de l’appareil Golgi et la mise en place de la polarité cellulaire par son interaction avec les phosphoinositides via deux domaines polybasiques. Ces résultats apportent une nouvelle compréhension du mécanisme moléculaire de l’interaction des septines avec les phosphoinositides et montrent pour la première fois l’importance de cette interaction dans des fonctions cellulaires de la septine 9. / Septins are a GTPases proteins family that can form high order structures such as filaments and rings, and able to bind cell membranes by interacting with phosphoinositides via a polybasic domain located at the N-terminal of their GTP binding domain. Here, We show by the transcriptomic analysis performed using the GSE14323 dataset that septin 9 is significantly upregulated in hepatitis C virus induced cirrhosis. Our findings show that septin 9 induce the lipid droplet growth by a phosphatidylinositol-5-phosphate and microtubule-dependent mechanism hijacked by HCV. In addition, we have shown that the septin 9 is involved in Golgi apparatus morphology regulation and cell polarity installation by interacting with phosphoinositides via two polybasic domains. These results provide new understanding of the molecular mechanism of septins interaction with the phosphoinositides and show its importance in septin 9 cellular functions shown for the first time.

Les septines sont des GTPases conservées dérégulées dans le cancer et les maladies neurodégénératives. Elles servent de protéines d’échafaudage et forment une barrière de diffusion à la membrane plasmique et au corps central lors de la cytokinèse. Elles interagissent avec l’actine et s’organisent en complexes qui polymérisent et forment des structures hautement organisées (anneaux et filaments). Leur dynamique d’assemblage et leur rôle dans la cellule restent à être élucidés. La Drosophile est un modèle simple pour l’étude des septines puisqu’on n’y retrouve que 5 gènes (sep1, sep2, sep4, sep5, peanut) comparativement aux 13 gènes chez l’humain. À l’aide d’un anticorps contre Pnut, nous avons identifié des structures tubulaires dans 30% des cellules S2 de Drosophile. Mon projet a comme but de caractériser ces tubes en élucidant leurs constituants, leur comportement et leurs propriétés pour mieux clarifier le mécanisme par lequel les septines forment des structures hautement organisées et interagissent avec le cytosquelette d’actine. Par immunofluorescence, j’ai pu démontrer que ces tubes sont cytoplasmiques, en mitose ou interphase, ce qui suggère qu’ils ne sont pas régulés par le cycle cellulaire. Pour investiguer la composition et les propriétés dynamiques de ces tubes, j’ai généré une lignée cellulaire exprimant Sep2-GFP qui se localise aux tubes et des ARNi contre les cinq septines. Trois septines sont importantes pour la formation de ces tubes et anneaux notamment Sep1, Sep2 et Pnut. La déplétion de Sep1 cause la dispersion du signal GFP en flocons, tandis que la déplétion de Sep2 ou de Pnut mène à la dispersion du signal GFP uniformément dans la cellule. Des expériences de FRAP sur la lignée Sep2-GFP révèlent un signal de retour très lent, ce qui indique que ces structures sont très stables. J’ai aussi démontré une relation entre l’actine et les septines. Le traitement avec la Latrunculin A (un inhibiteur de la polymérisation de l’actine) ou la Jasplakinolide (un stabilisateur des filaments d’actine) mène à la dépolymérisation rapide (< 30 min) des tubes en anneaux flottants dans le cytoplasme, même si ces tubes ne sont pas reconnus suite à un marquage de la F-actine. L’Actin05C-mCherry se localise aux tubes, tandis que le mutant déficient de la polymérisation, Actin05C-R62D-mCherry perd cette localisation. On observe aussi que la déplétion de la Cofiline et de l’AIP1 (ce qui déstabilise l’actine) mène au même phénotype que le traitement avec la Latrunculine A ou la Jasplakinolide. Alors on peut conclure qu’un cytosquelette d’actine dynamique est nécessaire pour la formation et le maintien des tubes de septines. Les futures études auront comme but de mieux comprendre l’organisation des septines en structures hautement organisées et leur relation avec l’actine. Ceci sera utile pour l’élaboration du réseau d’interactions des septines qui pourra servir à expliquer leur dérégulation dans le cancer et les maladies neurodégénératives. / Septins are highly conserved GTP-binding proteins deregulated in diseases such as cancer and neurodegenerative diseases. Septins scaffold other proteins and act as diffusion barriers at the plasma membrane and midbody during cytokinesis. They interact with the actin cytoskeleton and have been observed to form ordered complexes that can polymerize into higher-order structures such as filaments and rings. The principles of assembly and disassembly of such filaments and rings and their cellular roles are yet to be elucidated. Drosophila offers a simple system, as there are only 5 septin genes: peanut, sep1, sep2, sep4, and sep5 in contrast to 13 found in humans. We have previously found that Drosophila S2 cells contain unusual tubular structures that label with Peanut antibody. The goal of my Master’s project has been to characterise these structures, by defining their constituents, behaviours and properties, in the hope that this will shed light on the mechanisms by which septins can form higher-ordered structures and how they interact with other cytoskeletal elements such as actin. Using fluorescence microscopy, I show that these tubes are cytoplasmic and present in 30% of cells, both during mitosis and interphase, suggesting they are not cell cycle regulated. To investigate their composition and dynamic properties, I generated S2 cell lines stably expressing Sep2-GFP, which localizes to septin tubes and double stranded RNAs against all septins. The products of three septin genes were found to be essential for the assembly of septin tubes: Sep1, Sep2, and Pnut. The depletion of Sep1 led to the dispersal of the GFP signal into cytoplasmic clumps, whereas the depletion of Sep2 and Pnut led to its uniform distribution through the cell. FRAP analysis of Sep2-GFP revealed only slow recovery after many hours, indicating that the structures are very stable. I also discovered an unusual relationship between septin tubes and the actin cytoskeleton. Although the tubes did not label with conventional F-actin probes (Phalloidin, LifeAct), treatment with inhibitors of F-actin assembly (Latrunculin A) or disassembly (Jasplakinolide) led to their rapid (<30 min) dispersal into scattered rings. Furthermore, overexpressed Actin05C-mCherry localised to the septin tubes, while a polymerization-deficient mutant Actin05C-R62D-mCherry did not. Depletion of the actin severing protein Cofilin and the actin capping protein AIP1 also disrupted septin tubes dispersing them into cytoplasmic rings. A dynamic actin cytoskeleton is thus required for the formation and/or maintenance of higher ordered structures such as rings and tubes. Conclusion and Relevance: Ongoing studies aim to further elucidate how septins organize into such ordered structures and how actin regulates the process. This will clarify the septin network of interactions and facilitate the comprehension of their implication in cancer and neurodegenerative diseases. Key words: actin, septin, tube, ring, higher-order, hexamer, cofilin, AIP1

Les septines sont des protéines conservées de la levure à l’homme qui sont impliquées dans divers processus cellulaires tels que la cytokinèse, le transport vésiculaire et l’organisation du cortex cellulaire. Il existe 13 gènes de septines retrouvés en plusieurs isoformes chez l’humain, et seulement cinq chez Drosophila melanogaster, Sep1, Sep2, Pnut, Sep4 et Sep5, ce qui en fait un modèle idéal vu son génome simple. Les septines sont composées d’un domaine de liaison au GTP très conservé entre les espèces, dont le rôle reste à ce jour ambiguë, ainsi que de régions N et C-terminales variables. Les septines s’assemblent entre elles pour former un hexamère, composé de Sep1, Sep2 et Pnut chez Drosophila melanogaster, via l’interface N-C et G des septines. Ces hexamères s’assemblent bout à bout afin de former les filaments de septines. Ces filaments peuvent ensuite se regrouper et s’assembler en structures hautement ordonnées telles que des anneaux, des tubes, des faisceaux de filaments, des cages et elles sont retrouvées au sillon de clivage durant la cytokinèse. Le but était de déchiffrer les mécanismes d’assemblage des filaments de septines qui mènent à la formation des différentes structures, afin de mieux comprendre les mécanismes d’interaction entre les septines. Au sein des cellules S2 de Drosophila melanogaster, les septines sont retrouvées à trois structures hautement ordonnées et dépendantes de Pnut endogène : des tubes cytoplasmiques, des anneaux cytoplasmiques et le sillon de clivage durant la cytokinèse. Notre hypothèse est qu’il existe plusieurs mécanismes qui régissent la formation des structures hautement ordonnées et que ceux-ci sont dépendants des régions N et C terminales variables des septines qui sont impliquées dans plusieurs interactions. Divers mutants de Sep1, Sep2 et Pnut tronqués en N et en C-terminal ont été fusionnés à une protéine fluorescente et caractérisés par microscopie confocale. La localisation de ces mutants a été répertoriée et analysée en présence des septines endogènes ou lors de la déplétion de celles-ci. Nos résultats suggèrent que le domaine de liaison au GTP est suffisant pour le recrutement des septines au sillon de clivage durant la cytokinèse, mais que la région N-terminale est requise la formation des tubes et des anneaux cytoplasmiques dépendants de Pnut. / Septins are conserved from yeast to humans and are implicated in diverse cellular processes such as cytokinesis, vesicular transport and cellular cortical organization. There are 13 known genes that encode for human septins, which also have many isoforms, while there are only five septin genes in Drosophila melanogaster: Sep1, Sep2, Pnut, Sep4 and Sep5, which makes it an ideal model system. Septins have a conserved GTP binding domain, whose role is still not fully understood, and variable N-C-termini. Septins assemble together, via N-C and G interfaces, to form a hexamer, that is composed of Sep1, Sep2 and Pnut in Drosophila melanogaster, which assemble end-to-end to form non polar filaments. These filaments can subsequently assemble together to form higher-ordered structures, such as rings, tubes, bundles, and gauzes. Furthermore, septins are recruited to the cleavage furrow during cytokinesis although their organization there is unclear. The aim of this project is to define septin assembly mechanisms that can lead to the formation of different higher ordered structures. In Drosophila melanogaster S2 cells, septins are recruited to three, readily observable septin dependent structures: cytoplasmic rings, cytoplasmic tubes, and the cleavage furrow during cytokinesis. Our hypothesis is that multiple mechanisms govern septin incorporation into these structures and that these mechanisms differentially depend on septin N-C variable termini. A panel of mutants of Sep1, Sep2 and Pnut truncated in N-C-termini were fused to fluorescent proteins and their localization in S2 cells monitored by confocal microscopy, with or without depletion of endogenous septins. My results suggest that the GTP binding domain is sufficient for septin recruitment to the cleavage furrow during cytokinesis, but that the septin N-termini are required for recruitment to the cytoplasmic tubes and rings.