Thesis (doctoral)--München, 1979.

Background: Integrase strand transfer inhibitors (INSTIs) are the latest addition to the array of antiretroviral compounds used to treat an infection with Human Immunodeficiency Virus (HIV). Due to their high efficacy and increased tolerability, INSTIs have become an integral part of first-line therapy in most high-income countries over the past years. However, little is known about HIV-1’s genetic inter- and intra-subtype diversity on the Integrase (IN)-gene and its impact on the emergence of INSTI-resistance. In the absence of a functional cure, long-term efficacy of first-line compounds remains paramount for reducing virological failure and curbing on-going HIV transmissions. South Africa, harbouring more than 20% of the global HIV burden (7.7 / 37.9 million people), requires international attention in order to globally pursue UNAIDS’ (Joint United Nations Programme on HIV/AIDS) 90-90-90 goals and the road to ending the HIV/AIDS (Acquired immunodeficiency syndrome) pandemic by 2030. Methods: In this study, the prevalence of INSTI-resistance associated mutations (RAM) was investigated in a cohort of 169 archived drug-naïve blood samples from multiple collection sites around Cape Town, South Africa. Viral RNA was isolated from plasma samples, the integrase fragment amplified by RT-PCR and subsequently sequenced by Sanger-sequencing. Additionally, all publicly available drug-naïve, South African IN sequences, isolated before the availability of the first INSTIs in 2007, were retrieved from the Los Alamos HIV sequence database (n=284). All sequences were analysed for RAMs using the Stanford HIV Drug resistance database. The identification of polymorphism in the South African subtype C IN consensus sequence allowed for comparative analyses with global subtype B, as well as subtype C sequences, from countries other than South Africa. Results: The IN gene could be amplified and sequenced in 95/169 samples (56%). Phylogenetic inference revealed close homology between three sequence-pairs, warranting the exclusion of 3/95 sequences from further analyses. Of the 92 samples used for mutational analyses, 86/92 (93.5%) belonged to subtype C, 5/92 (5.4%) to subtype B and 1/92 (1.1%) to subtype A. The prevalence of major and accessory INSTI RAMs was 0/92 (0%) and 1/91 (1.1%), respectively, similar to the observed rates of 8/284 (2.8%) and 8/284 (2.8%) in the database sequences (p = 0.2076 and p = 0.6944, Fisher’s exact test). Compared to subtype B IN sequences, 15 polymorphisms were significantly enriched in South African subtype C sequences (corrected p<0.0015. Fisher’s exact test, Bonferroni post-hoc procedure). Compared to subtype C IN sequences isolated outside South Africa, four polymorphisms were significantly enriched in this study cohort (corrected p<0.0014, Fisher’s exact test, Bonferroni post-hoc procedure). The highest prevalence margin was observed for the polymorphism Met50Ile being present in 60.1% of South African subtype C sequences, compared to 37% in non-South African subtype C sequences. Conclusions: The low prevalence of major and minor RAMs in all South African Integrase sequences predicts a high susceptibility to INSTIs, however, the presence of natural polymorphisms, in particular Met50Ile, in the majority of sequences warrants further monitoring under therapeutic pressure, as their role in mutational pathways leading to INSTI- resistance is yet to be determined. Additionally, this study revealed the presence of substantial inter- and intra-subtype diversity within the HIV-1 Subtype C IN-gene. These results implicate the need for more research on a regional, potentially patient-specific level, as mutational insights from other diverse backgrounds may not accurately represent the South African context. The implementation of a national pre-treatment INSTI-resistance screening program may provide necessary insights into the development of mutational pathways leading to INSTI-resistance under therapeutic pressure for the South African context and thereby bring South Africa one step closer to achieving UNAIDS 90-90-90 goals and ending the AIDS epidemic by 2030. / Hintergrund: Integrase Strang-Transfer Inhibitoren (INSTIs) sind die neuste medikamentöse Ergänzung in der Therapie einer HIV-Infektion. Auf Grund ihrer starken Wirksamkeit und eines guten Nebenwirkungsprofils sind INSTIs in den letzten Jahren ein integraler Bestandteil von Erstlinien-Therapieregimen in den meisten wirtschaftlich starken Ländern geworden. Allerdings ist wenig bekannt über die genetische Variabilität des IN-gens und über ihren Einfluss auf die Entwicklung von INSTI-Resistenzen. Mit einem Anteil von über 20% der globalen HIV-Last (7,7 / 37,9 Millionen Menschen) benötigt Südafrika einen internationalen Fokus, um die von UNAIDS formulierten 90-90-90 Ziele und das mögliche Ende der HIV/AIDS Pandemie bis 2030 auf globaler Ebene zu verfolgen. Methoden: In dieser Arbeit wurde die Prävalenz von INSTI RAMs in einer Kohorte von 169 archivierten, therapie-naiven Blutproben von mehreren Sammelstellen um Kapstadt, Südafrika, untersucht. Virale RNA wurde aus Plasmaproben isoliert, das Integrase-Fragment mittels RT-PCR amplifiziert und anschließend Sanger-sequenziert. Zusätzlich wurden alle in der Los Alamos HIV Sequenz Datenbank verfügbaren, therapie-naive, südafrikanische IN Sequenzen, die vor der Verfügbarkeit von INSTIs im Jahr 2007 isoliert wurden, der Analyse dieser Arbeit hinzugefügt (n=284). Die Interpretation der gefundenen Mutationen erfolgte mittels der HIV Therapie-Resistenz Datenbank der Stanford Universität. Durch Generierung eines südafrikanischen IN Subtyp C Consensus-Stranges und nachfolgendem Vergleich mit öffentlich verfügbaren Subtyp B und Subtyp C Sequenzen, die außerhalb Südafrikas isoliert wurden, erfolgte die Analyse von natürlich vorkommenden Polymorphismen. Ergebnisse: Das IN-Fragment konnte in 95/169 Plasmaproben (56%) erfolgreich amplifiziert und sequenziert werden. Phylogenetische Analysen zeigten eine enge Homologie zwischen drei Sequenz-Paaren, woraufhin 3/95 Sequenzen von weiteren Analysen ausgeschlossen wurden. Von den übrigen 92 Sequenzen gehörten 86/92 (93,5%) zu dem Subtyp C, 5/92 (5,4%) zu dem Subtyp B und 1/91 (1,1%) zu dem Subtyp A. Die Prävalenz von Haupt- und Nebenresistenz-Mutationen lag bei jeweils 0/92 (0%) und 1/92 (1,1%). Ähnliche Raten hierfür von 8/284 (2,8%) und 8/284 (2,8%) konnten in den Datenbank-Sequenzen beobachtet werden (p = 0,2076 und p = 0,6944, Fisher’s exact test). Im Vergleich zu Subtyp B IN Sequenzen waren 15 Polymorphismen signifikant erhöht in südafrikanischen Subtype C IN Sequenzen (korrigiertes p<0,0015, Fisher’s exact test, Bonferroni post-hoc Korrektur). Im Vergleich zu nicht-südafrikanischen Subtyp C Sequenzen zeigten sich vier Polymorphismen signifikant erhöht (korrigiertes p<0,0014, Fisher’s exact test, Bonferroni post-hoc Korrektur). Der größte Prävalenzunterschied konnte für den Polymorphismus Met50Ile beobachtet werden. Dieser war vorhanden in 217/361 (60,1%) der südafrikanischen Subtyp C Sequenzen, verglichen zu 203/548 (37.0%) der nicht-südafrikanischen Subtyp C Sequenzen. Schlussfolgerung: Die niedrige Prävalenz von Haupt- und Neben-RAMs in südafrikanischen IN-Sequenzen verspricht ein gutes Ansprechen von INSTIs in diesem Kontext. Allerdings bedingt das Vorhandensein von natürlichen Polymorphismen, insbesondere der Polymorphismus Met50Ile das weitere Beobachten dieser Mutationen unter dem Einfluss von therapeutischem Druck, da deren Bedeutung in der Entwicklung von INSTI-Resistenzen noch nicht abschließend geklärt werden konnte. Zudem impliziert die in dieser Arbeit gezeigte inter- und intra-subtyp Diversität auf dem IN-Gen, die Notwendigkeit von weiterer Forschung auf regionaler Ebene, da Beobachtungen, die auf verschiedenen polymorphistischen Kontexten beruhen, nicht notwendigerweise auf den südafrikanischen Kontext übertragen werden können. Mit der Einführung eines nationalen, prä-therapeutischen Screening- Programms für das Vorhandensein von INSTI-Resistenzen könnte Südafrika wichtige Einblicke in die Entwicklung von INSTI-Resistenzen gewinnen und somit den 90-90-90 Zielen und der Möglichkeit die AIDS-Pandemie bis zum Jahr 2030 zu beenden, einen Schritt näher sein.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Universiẗat, Diss., 2003--Bremen.

Parodontitis ist eine Erkrankung des Zahnhalteapparates, die durch einen komplexen bakteriellen Biofilm unterhalten wird. Neben Mikroorganismen wie A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, T. denticola und T. forsythensis werden Keime unbekannter Spezies in parodontalen Taschen ausfindig gemacht. Durch die Entschlüsselung von 16S rRNA-Gensequenzen konnte die orale Flora nahezu vollständig katalogisiert werden. Allerdings fehlen bei vielen Phylotypen die entsprechenden Typstämme für weitergehende phänotypische Analysen. Grundlage dieser Arbeit bildeten 59 Patientenisolate der Parodontitis-Stammsammlung des Instituts für Hygiene und Mikrobiologie bei denen partielle 16S rRNA Sequenzen keine Spezieszuordnung ermöglichten. Nahezu vollständige 16S rRNA-Sequenzen wurden erstellt und mit Datenbankeinträgen verglichen. Bei mehr als der Hälfte der Stämme konnte keine taxonomische Zuordnung auf Sequenzierebene getroffen werden. 43 Isolate wuchsen unter aerober Atmosphäre, 16 benötigten eine anaerobe Umgebung. Alle Kulturmorphologien und nach Gram gefärbten mikroskopischen Präparate wurden fotografisch dokumentiert und katalogisiert. Die hier untersuchten Stämme, die zufällig auf der Basis taxonomischer Fragestellungen ausgewählt wurden, waren zum überwiegenden Teil auf Amoxicillin und Metronidazol empfindlich. Diese Antibiotika finden alle ihre Verwendung bei der Parodontitistherapie. Ciprofloxacin, das wegen seiner intrazellulären Wirkung ein interessantes Agens ist, wies v.a. bei Actinomyceten und Streptokokken Wirkungslücken auf. Es bleibt zu diskutieren, ob dieser Umstand nachteilig ist, da auf der einen Seite diese Genera ein orales Reservoir für Gyrasehemmer-Resistenzen ausbilden können, auf der anderen Seite diese grampositiven Keime möglicherweise parodontalprotektiv wirken könnten. In dieser Studie konnte eine Stammsammlung charakterisiert werden, die zukünftig insbesondere angesichts der zu erwartenden Entschlüsselung des oralen Metagenoms für weitere funktionelle Untersuchungen von Interesse sein dürfte. / The aim of this study was the characterisation of the subgingival periodontal microbiota by cultural and molecular methods. Periodontitis is a bacterial disease, which is caused by different periodontal pathogens like Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola and Tannerella forsythensis. Furthermore there exist some species in the complex subgingival biofilm that are not cultured yet. They may participate in the progression or persistence of periodontal destruction. In this paper 59 Plaque samples were obtained from a previous study of the Institute for Hygiene and Microbiology from the University of Würzburg where the comparison of subgingival microorganisms with public databases didn´t allow a species identification. Almost complete 16S rRNA sequences were provided and compared with database entries. More than half of the bacterial isolates didn’t permit a taxonomic allocation. Macroscopic and microscopic features, the susceptibility against amoxicillin, ciprofloxacin and metronidazole are described here. 43 isolates grew under aerobic conditions, 16 needed anaerobic atmosphere. The morphology of the culture and the colouring according to Gram were documented photographically and listed. Most tested microorganisms were susceptible to amoxicillin and metronidazole. Except for Actinomyces and Streptococcus ciprofloxacin exhibits good results in the treatment of periodontal disease. In this study a collection of subgingival bacteria could be characterized, which might be of interest for further investigations in view of the decoding of the oral metagenome.

Univ., Diss.--Regensburg, 1999.

München, Techn. Univ., Diss., 2001.

University, Diss., 2002--Mannheim.

Universiẗat, Diss., 2004--Bielefeld.

Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2007