Thesis (Ph.D.) -- University of Adelaide, Dept. of Microbiology and Immunology, 1999. / Corrigenda pasted onto back end-papers. Bibliography: leaves 163-182.

Orientador: Ian Castro-Gamboa / Banca: Cíntia Duarte de Freitas Milagre / Banca: Flávia Talarico Saia / Resumo: O descobrimento de novas moléculas bioativas tem sido o grande al vo ao decorrer dos anos da química dos produtos naturais, particularmente, micro - organismos tem se evidenciado como uma importante fonte do descobrimento de novos fármacos. Uma ampla gama de compostos provenientes de organismos microbianos são relatados na literatura, porém, recentes pesquisas demonstram que tais micro - organismos podem sofrer indução por determinados agentes externos, químicos ou físicos, através de mecanismos de defesa ou até mesmo o mutualismo existente em determinado meio, produzindo nov as estruturas químicas, que até então, tinham sua rota b iosintética silenciada devido a metodologias padrões de cultivo isolado. Através de utilização de culturas mistas de bactérias, o presente trabalho proporciona o conhecimento da relação existente entr e Pseudoxanthomonas indica e Shigella sp., ambas provenientes da rizosfera de Senna spectabilis . Para isso, as bactérias foram cultivadas em meio de cultivo líquido czapek broth, sendo realizado o estudo do crescimento das bactérias e produção de metabolit os frente ao tempo, tendo em vista uma maximização de resultados e maior indução de compostos químicos. A utilização de ferramentas analíticas de análise rápida e eficiente como a cromatografia líquida de alta eficiência ( HPLC ) associada a espectrometria de massas de alta resolução do ( HRMS ) propiciaram a obtenção do perfil cromatográfico dos micro - organismos estudados em cultura mista e simples, sendo possível observar a existência de compostos químicos produzidos apenas em co - c ultura, evidenciado o potencial existente da abordagem utilizada. / Abstract: The discovery of new bioactive molecules has been the big target to over the ye ars the chemistry of natural products, particularly micro - organisms has been shown to be an important source of discovery of new drugs. A wide range of compounds from microbial organisms are reported in the literature, however, recent research shows that t hese micro - organisms can undergo induction by certain external, chemical or physical agents, through defense mechanisms or even the existing m utualism on a particular medium, producing new chemical structures, which until then had silenced their biosynthet ic route due to methodologies patterns of isolated farming. Through use of mixed cultures of bacteria, this study provides knowledge of the relationship between Pseudoxanthomonas indica and Shigella sp ., Both from the rhizosphere of Senna spectabilis . For this, bacteria were grown in liquid Czapek broth cultivation being conducted the study of the growth of bacteria and production of metabolites against time, with a view to maximizing results and greater induction of chemical compounds. The use of analytics quickly and efficiently analyzes such as high - performance liquid chromatograp hy tools (HPLC) associated with high resolution mass spectrometry (HRMS) enabled the obtaining of the chromatographic profile of microorganisms studied in mixed and single cultur e, and you can to observe the existence of chemical compounds produced only in co - culture demonstrated the potential of the approach used. / Mestre

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-08-27T11:49:12Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 676884 bytes, checksum: e1f9724ccc2f0d91eee10a5d92c70b8a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-27T11:49:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 676884 bytes, checksum: e1f9724ccc2f0d91eee10a5d92c70b8a (MD5) Previous issue date: 2017-02-22 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A bioconservação é uma das técnicas atuais utilizadas na conservação de alimentos, que se baseia na utilização de micro‐organismos e, ou de seus metabólitos, como por exemplo, bacteriocinas. Nisina é uma bacteriocina produzida por Lactococcus lactis subsp. lactis, usada na conservação de alimentos em mais de 50 países, incluindo o Brasil. Nisina é altamente ativa contra ampla gama de bactérias gram-positivas, mas bactérias gram-negativas, como Shigella, são naturalmente resistentes à sua ação. Esta resistência está relacionada à presença da membrana externa, que atua como barreira impedindo a difusão da bacteriocina até a membrana celular, seu local de ação. O uso de estratégias para desestabilizar a membrana externa, como o ultrassom (US), pode favorecer a ação da nisina contra bactérias gram-negativas. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da nisina associada ao US contra Shigella flexneri 2a em caldo infusão de cérebro e coração (BHI). Foi utilizado o delineamento composto central rotacional (DCCR) e a metodologia de superfície de resposta (MSR) com três variáveis independentes: tempo de sonicação (X 1 : 5 a 20 min), pH (X 2 : 4,0 a 7,0) e concentração de nisina (X 3 : 29,1 μM a 291,1 μM). A diferença entre o logaritmo do número de células viáveis (log UFC/mL) no início e ao final de cada tratamento foi utilizada para construção do modelo preditivo. Análise de variância (ANOVA) e oito condições adicionais foram usadas para validação do modelo. Foi avaliado a sobrevivência de S. flexneri após a sonicação na presença de nisina e estocagem sob refrigeração (7 oC) por 120 h. Para isso, duas condições foram estabelecidas (10 min de US, pH 6,0 e 175 μM de nisina e 20 min de US, pH 4,5 e 175 μM de nisina). O extravasamento de ATP também foi avaliado nestas duas condições. Para comparações dos dados foi utilizado o teste Tukey para verificar a existência de diferenças entre o tratamento combinado (nisina + US) e os grupos controles. O nível de significância adotado foi de 5%. Os resultados indicaram que o US é uma estratégia eficaz para sensibilizar S. flexneri à ação da nisina. A combinação de nisina com US resultou em sinergismo na inativação deste patógeno, sendo que a maior inativação foi observada em baixos valores de pH, concentrações altas de nisina e maior tempo de sonicação, com redução máxima de, aproximadamente, 5 ciclos logarítmicos. O modelo preditivo da combinação (nisina + US) apresentou coeficiente de determinação (R 2 ) de 0,942 e ajustado de 0,916 e o modelo foi validado. A estocagem sob-refrigeração após a sonicação na presença de nisina resultou no declínio da população de S. flexneri ao final do tempo de armazenamento que reduziu de 5,42 para 1,64 ciclo logarítmico em pH 6,0 após tratamento por 10 min de sonicação e 5,69 para 0,80 ciclo logarítmico em pH 4,5 quando tratada por 20 min de sonicação. O tratamento de nisina com US provocou o maior extravasamento de ATP intracelular em ambas as condições testadas. Estes resultados demonstram o potencial uso da nisina combinada ao US como estratégia de sanitização e conservação de alimentos. / Bioconservation is one of the current techniques used in food preservation, which is based on the use of microorganisms and their metabolites such as bacteriocins. Nisin is a bacteriocin produced by Lactococcus lactis subsp. lactis, used as a food preservative in more than 50 countries, including Brazil. Nisin is highly active against a wide range of gram-positive bacteria, but gram-negative bacteria, such as Shigella, are naturally resistant to its action. This resistance is related to the presence of the outer membrane, that acts as barrier preventing the diffusion of the bacteriocin to its site of action. The use of strategies to destabilize the outer membrane, such as ultrasound (US), can favor the action of nisin against gram-negative bacteria. This study aimed to evaluate the effect of nisin associated with US against Shigella flexneri 2a in brain and heart infusion broth (BHI). A Central Composite Rotated Design (CCRD) and response surface methodology (RSM) was performed with three parameters: sonication time (X 1 : 5 to 20 min), pH (X 2 : 4.0 to 7.0) and nisin concentration (X 3 : 29.1 μM to 291.1 μM). The difference among the logarithm of the viable cell number (log CFU/mL) at the beginning of the experiment and at the end of each treatment was used for the construction of predictive model. Analysis of variance (ANOVA) and eight additional conditions were used for model validation. The behavior of S. flexneri after sonication in the presence of nisin and storage on refrigeration (7 oC) for 120 h was evaluated. For this, two conditions were established (10 min of US, pH 6.0 and 175 μM nisin and 20 min of US, pH 4.5 and 175 μM nisin). The leakage of ATP was also evaluated in these two conditions. For comparisons of the data, the teste Tukey was used to verify the existence of differences between the combined treatment (nisin + US) and the control groups. The level of significance was set at 5%. The results indicated that US is an efficient strategy for sensitize S. flexneri to the action of nisin. The combination of nisin with US resulted in synergism in the inactivation of this pathogen being that the higher inactivation observed was low pH, high nisin concentrations and longer sonication time, with a maximum reduction of approximately 5 logarithms cycles. The predictive model of the combination (nisin + US) showed coefficient of determination (R 2 ) of 0.942 and adjusted of 0.916, and the model was validated. Refrigerated storage after sonication in the presence of nisin resulted in the decline of the S. flexneri population at the end of storage time decreasing from 5.42 to 1.64 logarithm cycle at pH 6.0 treated with 10 min of sonication and 5.69 to 0.80 logarithm cycle at pH 4.5 when treated for 20 min sonication. The treatment of nisin with US caused the highest leakage of intracellular ATP, combined with US in both conditions tested. These results demonstrate the potential use of nisin combined to US as strategy for sanitation and food preservation.

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T03:48:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Penatti_MarioPauloAmante_D.pdf: 3721430 bytes, checksum: 2233dee3467177800c9c87d56e40c34c (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Bactérias do ¿gênero¿ Shigella spp. apresentam-se como bacilos gram-negativos, anaeróbios facultativos, imóveis, não formam esporos e pertencem à família Enterobacteriaceae. De acordo com testes de aglutinação com anti-soros específicos, estas bactérias são classificadas em quatro sorogrupos: Sorogrupo A (Shigella dysenteriae), Sorogrupo B (Shigella flexneri), Sorogrupo C (Shigella boydii) e Sorogrupo D (Shigella sonnei). Estas bactérias são responsáveis pela Shiguelose ou Disenteria Bacilar enfermidade endêmica que anualmente acomete milhões de pessoas em todo o mundo, sendo que mais de 70% de todos os casos ocorrem em crianças de 1 até 5 anos de idade, possuindo grande importância epidemiológica devido à alta morbi-mortalidade. Os principais determinantes de patogenicidade neste grupo bacteriano são: o plasmídio de alto peso molecular, que determina o fenótipo invasivo desta espécie; genes cromossômicos, que regulam a expressão dos genes de virulência no plasmídio e a produção de uma exotoxina que atua destruindo a barreira de células epiteliais. No Brasil, até então, não foram encontrados trabalhos publicados que comparem as diferentes amostras bacterianas de Shigella spp. isoladas de casos de Shiguelose, relacionando suas características biológicas e estrutura clonal. Sendo assim, neste trabalho, estudamos as características biológicas (sorotipagem, perfil de resistência a antimicrobianos, adesão e invasão, análise do perfil de DNA plasmidial) de diferentes amostras de Shigella spp. relacionando-as através de técnicas de Biologia Molecular (ERIC-PCR, REPPCR e DRE-PCR) permitindo, assim, determinar a clonalidade epidemiológica destas. As amostras de Shigella spp. foram isoladas de diferentes surtos, de diversas cidades das regiões de Campinas e de São João da Boa Vista, e pertencem à coleção do Instituto Adolfo Lutz de Campinas / Abstract: Shigella spp are gram-negative, anaerobic facultative, non-motile, and non-sporulated bacilli of the Enterobacteriaceae family, responsible for ¿Shigellosis¿ or the Bacillary Dysentery (BD) disease, an important cause of worldwide morbidity and mortality. The pathogenic determinants of Shigella spp include high molecular weight plasmids responsible for the bacterial invasive capacity, as well as chromosomal genes encoding for different pathogenic, factors such as exotoxins that destroy epithelial host cells. Little is known about the antibiotic resistance profiles and the population structure of Shigella species isolated from humans in Brazil. In this work, we have studied the antibiotic resistance profiles and the clonal structure of Shigella strains isolated from humans in different cities located in the region of Campinas, a city in the state of São Paulo, Brazil. We have also related the antibiotic resistance of these strains with the bacterial clonal groups determined by the molecular techniques ERIC, REP, and DRE-PCR. Our data indicate that many strains of S. flexneri and S. sonnei are multiresistant, and our results also support the circulation of specific clones among the cities. These data indicate that the human sanitary conditions in the cities analyzed herein should be improved. / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Memoria para optar el título de Bioquímico / La shigelosis es una infección intestinal aguda causada por bacterias del género Shigella, cuyos síntomas varían desde diarrea acuosa hasta disentería bacilar inflamatoria grave. Shigella es un patógeno cuyo único hospedero es el humano, presenta una muy baja dosis infectiva (solo 10 organismos viables pueden producir enfermedad) y se contagia principalmente por vía fecal-oral. Esta bacteria permanece dentro de las cuatro principales causas de diarrea moderada-grave en niños menores de 5 años en países en vías de desarrollo, predominando el serogrupo S. flexneri, a diferencia de nuestro país donde predomina el serogrupo S. sonnei. Con el transcurso del tiempo, Shigella ha sido capaz de adquirir rápidamente diversos mecanismos de resistencia a los antibióticos utilizados en su tratamiento, lo que genera la necesidad de conocer el patrón de susceptibilidad que presenta este patógeno antes de comenzar la terapia. Uno de los antibióticos utilizados en su tratamiento es el trimetoprim (Tmp), el cual inhibe la actividad de la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR). La resistencia a este antibiótico se genera principalmente por la adquisición de genes dfr que codifican para una enzima DHFR resistente a Tmp. En nuestro país, la resistencia a Tmp en cepas de S. sonnei aisladas entre los años 1995 y 1997 se atribuye principalmente a la presencia de los genes dfrA1 y dfrA8, pero en un brote de S. sonnei surgido en los años 2008 y 2009, esta resistencia se debe a otro mecanismo no identificado. Además, la mayoría de las cepas de S. sonnei aisladas después del brote, presentan resistencia a Tmp pero su mecanismo de resistencia no ha sido estudiado. Debido a esto, en el presente trabajo se propuso determinar el mecanismo de resistencia a trimetoprim y evaluar su distribución en cepas de S. sonnei aisladas en nuestro país entre los años 1995 y 2013. Este mecanismo de resistencia se identificó mediante el uso de una genoteca construida con el ADN de una cepa de S. sonnei resistente a Tmp, revelando mediante secuenciación, un cassette genético que incluye al gen dfrA14 como responsable de la resistencia a este antibiótico. Posteriormente, se determinó la distribución del gen dfrA14 y de los genes previamente descritos dfrA1 y dfrA8 mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en las cepas aisladas entre los años 1995 y 2013. De esta forma, se obtuvo que entre los años 1995-1997 y 2004- 2006 predominó dfrA8, en tanto que el 100% de las cepas aisladas durante el brote 2008-2009 presentaron dfrA14. Posteriormente, en los años 2010-2011 se detectó la presencia de dfrA1 y dfrA14 en proporciones similares y luego en el 2012-2013 reapareció además dfrA8. Adicionalmente, se determinó que la totalidad de las cepas que presentan dfrA14, lo hacen en el contexto genético de un plásmido de 6779 pb, capaz de otorgar resistencia a cotrimoxazol (mezcla de Tmp y sulfonamidas), denominado pABC-3. Este plásmido es prácticamente idéntico a un plásmido de E. coli denominado pCERC1, salvo por la ausencia de una repetición de 11 pb en su secuencia. También es similar a otros plásmidos presentes en Shigella, cuya principal diferencia es la ausencia de dfrA14. Esto sugiere dos posibles orígenes del pABC-3: uno es la adquisición del plásmido desde una E. coli y el otro es la inserción del cassette que contiene dfrA14 en los plásmidos presentes en Shigella. En conclusión, en el presente trabajo se describe que la resistencia a Tmp en cepas de S. sonnei aisladas en nuestro país se debe mayoritariamente a la presencia de los genes dfrA1, dfrA8 y dfrA14 y que este último se encuentra en el contexto genético del plásmido pABC-3, confiriendo resistencia a Tmp a la mayoría de las cepas de S. sonnei aisladas en nuestro país desde el año 2004 hasta 2013 / Shigellosis is an acute intestinal infection caused by bacterial genus Shigella. Its symptoms vary from watery diarrhea to severe inflammatory bacillary dysentery. Shigella, a strictly human-pathogen, has a very low infectious dose (10 bacterial cells can produce illness) and is transmitted via faecal-oral. This pathogen affects mainly children under 5 years in developing countries, where S. flexneri is the most important serogroup, while in Chile S. sonnei is the prevalent serogroup. The use of antibiotics against Shigella is the first line therapy, however lately the acquisition of resistance mechanisms has increased. Therefore, antimicrobial susceptibility profiles are required before starting any treatment. Trimethoprim (Tmp), one of selected antibiotics against this pathogen, inhibits the activity of the dihydrofolate reductase enzyme (DHFR). Tmpresistant (TmpR) bacteria are mainly due to acquisition of dfr genes, coding for DHFR enzymes. S. sonnei strains isolated in Chile between 1995 and 1997 showed the presence of dfrA1 and dfrA8 genes, but the mechanism of Tmp-resistance in a later outbreak (2008-2009) is unknown. The majority of S. sonnei strains isolated after the outbreak are TmpR, but their resistance mechanism has not been studied yet. The general aim of this study was to identify the genetic marker responsible of the Tmp resistance mechanism in S. sonnei strains isolated between 1995 and 2013. A DNA library was obtained from a representative TmpR S. sonnei strain from the outbreak and a recombinant E. coli TmpR was isolated. Further, the sequenced clone was identified as harbouring the dfrA14 gene. We evaluated the distribution of the dfrA14 gene and the previously described genes, dfrA1 and dfrA8 in a laboratory collection of S. sonnei from 1995 – 2013. The results show that within periods 1995- 1997 and 2004-2006 the dfrA8 gene was the most prevalent, while 100% of the isolated strains during the 2008-2009 outbreak present the dfrA14 gene. Later, between 2010 and 2011 dfrA1 and dfrA14 were detected in similar proportions, and then, between 2012 and 2013 dfrA8 reappeared. In addition, it was determined that the dfrA14 gene is harboured in a 6779 bp plasmid, named pABC-3, which confers cotrimoxazole resistance. This plasmid is nearly identical to the pCERC1 plasmid isolated from E. coli, except for an 11 bp sequence missing in pABC-3, and similar to other Shigella plasmids, without the insertion of the dfrA14 gene cassette. This suggests two possible origins for the pABC-3 plasmid. One of them is the acquisition of the whole plasmid from E. coli and the other is the insertion of the dfrA14 gene cassette into a Shigella dfrA14 -less plasmid. In conclusion, the present study showed that Tmp resistance in S. sonnei strains isolated in Chile is mainly due to the presence of the dfrA1, dfrA8 and dfrA14 genes. This last gene is found inside the pABC-3 plasmid conferring Tmp resistance to the majority of S. sonnei strains isolated between years 2004 and 2013 in our country / Fondecyt

Shigella spp. are Gram-negative, non-motile bacterial pathogens that are the causative agent of bacillary dysentery in humans. During infection, Shigella utilize a complex type three secretion system (T3SS) to inject effector proteins and take over host cell functions. With the rise of multi-antibiotic resistant Shigella strains, the T3SS is a promising alternative therapeutic target. While the needle and syringe-like apparatus of the T3SS has been extensively studied in Shigella, several components and mechanisms of this system remain unclear. The research presented here addresses two major knowledge gaps in the current understanding of the T3SS ATPase, Spa47, and the initial host-pathogen interaction at the tip of the apparatus. In this work, high resolution crystal structures of Spa47 guided the creation of an oligomer model which suggested ATP hydrolysis may be supported by specific side chain contributions from adjacent protomers within the complex. Mutagenesis experiments targeting predicted active site residues and the oligomerization domain revealed that active site residues alone are not responsible for Spa47 oligomerization while protein oligomerization is crucial for ATPase activity. Together with in vivo experiments, we show that ATP hydrolysis and proper Spa47 oligomer formation is critical for T3SS apparatus formation, effector secretion, and overall Shigella virulence. Additionally, we have combined the Langmuir Blodgett technique with fluorescent microscopy to visualize the interaction between key T3SS tip proteins with defined artificial phospholipid membranes. These membranes were generated using Langmuir Blodgett which provided control over lipid phase and composition. Lipid phase and protein localization were monitored using lipophilic dyes and selective fluorescent protein labeling. These experiments suggest a differential interaction between the tip protein IpaB with the membrane components cholesterol and sphingomyelin based on IpaB oligomerization. IpaC, another T3SS tip protein, was found to destabilize membranes when alone, but was stabilized in the presence of IpaB. These experiments suggest that IpaB confers IpaC stability within membranes and that tip protein localization is dependent on lipid phase and composition. Overall, these new insights into the T3SS ATPase and tip proteins provide a more complete understanding of Shigella virulence that will aid in future endeavors to identify alternative therapeutic targets for treatment.

No description available.

published_or_final_version / Microbiology / Doctoral / Doctor of Philosophy

Escherichia coli enteroinvasora (EIEC) possuem características bioquímicas e genéticas semelhantes às de Shigella, porém para que ocorra um processo infeccioso são necessárias 102 células de Shigella em relação a 106 células de EIEC. A patogenicidade de Shigella e EIEC se dá pela presença de um plasmídio de virulência denominado pInv, que contêm os genes necessários para a invasão e disseminação bacteriana nas células do hospedeiro. Estudos anteriores relataram que os genes ipaA, ipaB, ipaC e ipaD de EIEC e Shigella não possuem diferenças genéticas que possam explicar sua diferença de patogenicidade. No presente trabalho, foram avaliados os níveis transcricionais dos genes envolvidos na invasão e disseminação dessas bactérias. Pela técnica de RT-PCR semi-quantitativo, pode-se observar diferenças nos níveis de transcrição para a maioria dos genes de virulência selecionados, quando as bactérias estavam em contato com os macrófagos. Porém, sem o contato com estas células, o nível de transcrição dos genes foi o mesmo entre as espécies, com exceção do gene ipaD. Foi verificada que a transcrição deste gene em contato com macrófago é praticamente a mesma entre as bactérias, enquanto que na ausência de macrófagos, o nível de transcrição é bem menor em EIEC, quando comparado no mesmo intervalo de tempo. Após estes resultados foram selecionados os principais genes para estudo por PCR em tempo real. Foi possível observar que o nível de transcrição de EIEC é menor, em relação a Shigella. Mais ainda, a análise dos genes dentro do mesmo operon mostrou uma cinética de transcrição distinta do icsB em relação a outros genes do operon das ipas. Os resultados obtidos sugerem que esta diferença de transcrição possa estar relacionada com a virulência mais branda em EIEC. Ainda mais, Os genes pertencentes ao operon icsB-ipaCB parecem ser regulados de forma distinta. Além disso, a transcrição de ipaD em EIEC, provavelmente, depende de uma via de sinalização distinta de Shigella flexneri. Diante desses resultados, novos estudos estão sendo propostos em nosso laboratório para melhor compreensão do mecanismo de virulência desse enteropatógeno. / Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) serotypes described so far share antigenic, biochemical, genetic and pathogenetic properties with Shigella sp. However, in order for an infectious process to occur, an inoculum of 102 Shigella cells is needed in contrast to as much as 106 EIEC cells. The characteristic ability of S. flexneri and EIEC to enter epithelial cells, multiply intracellularly and spread from cell to cell is uniquely encoded by their 220-kb virulence plasmid. Previous studies realized in our laboratory showed that the genes ipaA, ipaB, ipaC and ipaD do not possess molecular alterations in the nucleotides sequences that can explain the difference in the pathogenicity between EIEC and Shigella spp. In the present work, the transcription levels of the bacterial genes involved in the invasion and escape from host cells were evaluated. Through reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis, differences in the transcription levels for the majority selected virulence genes could be observed when bacteria were in contact with the macrophages. However, without the contact with those cells, the transcription levels of the genes were the same between both bacteria species, with the exception of ipaD. When the bacteria is in contact with macrophages, the transcription of ipaD is the same in both species whereas in the absence of macrophages, the transcription level is lower in EIEC than Shigella, when compared in the same period of time. Those results provided the selection of the genes for the real time PCR analysis. In general, the EIEC transcription levels genes are lower than Shigella. More still, the icsB showed a distinct kinetic of transcription from the others genes in the same operon. All results suggest that the lower pathogenicity due to EIEC can partially have to the differences of the virulence genes transcription. Still more, the genes-encoded by operon icsB-ipaCB seem to be regulated of a distinct form. Therefore, transcription of the ipaD in EIEC probably depends on distinct signaling way of S. flexneri. New studies shows to be necessary for the better understanding of the pathogenic mechanism of EIEC.

As infecções causadas por patógenos intestinais gram-negativos são importantes fontes de prejuízos na criação de animais domésticos como bovinos, ovinos, suínos e aves. Em muitos casos, opta-se pela administração de antibióticos de amplo espectro para prevenção destas infecções e atenuação das perdas. No entanto, esta prática apresenta risco para a saúde humana, bem como contribui para seleção de cepas resistentes. Nos últimos anos, muito tem se discutido a respeito de novas alternativas para atenuar os prejuízos mencionados sem apresentar o mesmo risco. Uma destas alternativas é a utilização de micro-organismos que apresentam propriedades probióticas que sintetizam substâncias inibitórias sobre espécies de patógenos intestinais. Esta abordagem praticamente elimina o risco de desenvolvimento de resistência aos antibióticos de uso clínico, além de evitar a presença de resíduos nos produtos de origem animal. O termo \"probiótico\" é utilizado atualmente para definir micro-organismos que, administrados em doses e frequências adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro. Nos últimos anos, diversos estudos têm sido desenvolvidos envolvendo quatro cepas de Lactobacillus (L. acidophilus ATCC 4356, L. casei ATCC 7469, L. fermentum ATCC 9338 e L. plantarum ATCC 8014) com resultados promissores no tocante às suas características probióticas. Desta forma, a proposta deste estudo foi avaliar a capacidade destas cepas em relação à produção de substâncias que apresentam atividade inibitória sobre espécies patogênicas, intestinais gram-negativas, especificamente Escherichia coli 0112, Escherichia coli 0124, Escherichia coli 0127, Shigella sonnei ATCC 25931, Shigella dysenteriae ATCC 13313, Salmonella enteritidis ATCC 13076. Para tanto, foi avaliada a atividade inibitória de substâncias presentes no sobrenadante livre de células de cada cepa. Adicionalmente, foi realizada a caracterização presuntiva das substâncias responsáveis pela inibição do crescimento microbiano quando os respectivos sobrenadantes foram submetidos a diferentes tratamentos (catalase, enzimas proteolíticas, tratamento térmico e neutralização do pH). A estratégia adotada consistiu na avaliação do crescimento, determinado por turbidimetria, das cepas patogênicas na presença do sobrenadante in natura e tratado. Os valores de absorbância foram analisados estatisticamente pelos testes de ANOVA e Tukey e os resultados mostraram que os sobrenadantes in natura de L. acidophilus ATCC 4356 L. casei ATCC 7469 e L. plantarum ATCC 8014 foram capazes de inibir 5 das 6 cepas dos patógenos intestinais estudadas em níveis de inibição variando de 23% a 53%, sendo que a cepa S. dysenteriae ATCC 13313 não teve seu crescimento inibido pelas cepas de Lactobacillus avaliadas. Demonstrou-se também que apenas o sobrenadante in natura de L. fermentumATCC 9338 apresentou atividade inibitória sobre esta cepa, cujo percentual de inibição variou entre 20% e 35% e entre 36% e 65% para as demais cepas patogênicas. A avaliação dos resultados relativos ao crescimento das cepas patogênicas na presença dos sobrenadantes in natura e tratados revelou que o efeito de inibição observado foi devido a presença de ácidos orgânicos que provocou o abaixamento do pH. Demonstrou-se ainda a ausência de substâncias peptídicas e termolábeis ativas contra as cepas patogênicas avaliadas, bem como peróxido de hidrogênio nos respectivos sobrenadantes. / Infectious diseases caused by gram-negative pathogens are important sources of losses in livestock, especially bovine, ovine and poultry. In many cases, subclinical administration of broad-spectrum antibiotics is chosen as an approach for the prevention of these infections, consequently decreasing these losses. However, this practice presents an important risk to human health, as well as it contributes to the selection of bacterial strains which are resistant to antibiotics usually employed in clinical practice. Therefore, special attention has been given to finding alternative procedures to decrease those losses while eliminating that risk. One of these alternatives consists of using microorganism species which present probiotic properties such as synthesis of inhibitory compounds that act on intestinal pathogen species. This alternative virtually eliminates the risk of developing resistance to broad-spectrum antibiotics, as well as avoids the presence of antibiotic residues in animal products. The term \"probiotic\" is currently used to define microorganism species which promote several benefits to the host, once they are administered frequently and in adequate amounts. In the last few years, several works have been carried out using four Lactobacillus strains (L.acidophilus ATCC 4356, L.casei ATCC 7469, L. fermentum ATCC 9338 and L. plantarum ATCC 8014), and the results have been satisfactory regarding to their probiotic characteristics. Therefore, the aim of this study was to evaluate the ability of these strains to produce inhibitory compounds which are active on gram-negative intestinal pathogen species, specifically Escherichia coli 0112, Escherichia coli 0124, Escherichia coli 0127, Shigella sonnei ATCC 25931, Shigella dysenteriae ATCC 13313 and Salmonella enteritidis ATCC 13076. So, antimicrobial activity of the cell-free supernatant of each strain was evaluated. Additionally, presumptive characterization of these compounds was undertaken by submitting the supernatants to different treatments (catalase, proteolytic enzymes, thermic treatments, pH neutralizing). The strategy consisted of evaluating the growth, estimated by turbidimetry, of the mentioned pathogenic strains in the presence of the original supernatants, as well as in the presence of treated supernatants. Aborbance values were statistically analyzed by means of ANOVA and Tukey\'s test. The results showed that the original supernatants of L. acidophilus ATCC 4356 L. casei ATCC 7469 and L. plantarum ATCC 8014 were capable of inhibiting five of six strains of enteric pathogens at levels varying from 23% to 53%. S. dysenteriae ATCC 13313 was not inhibited by the Lactobacillus strains evaluated. It was also demonstrated that only the original supernatant of L. fermentum ATCC 9338 showed inhibitory activity upon this strain varing from 15% to 32%, and between 36% and 65% regarding to the other strains. Growth evaluation of the pathogenic strains in the presence of the treated and original supernatants revealed that the inhibition effect observed occurred due to the presence of organic acids, which lowered the pH of the supernatants. It was also demonstrated the absence of hydrogen peroxide, peptidic and thermolabile compounds in the supernatants.