Avec 800 000 morts par année, les maladies diarrhéiques sont la seconde cause de mortalité chez les enfants de moins de cinq ans. La shigellose, causée par des bactéries Gram négatif appelées Shigella, est l’une des quatre grandes maladies entériques touchant cette population. L’infection naturelle protège contre la réinfection et la composante polysaccharidique du lipopolysaccharide bactérien est la principale cible de l’immunité humorale. Chez S. sonnei, espèce prévalente dans les pays en développement et développés, ce polysaccharide spécifique, à caractère zwitterionique, a pour unité répétitive un disaccharide composé de deux hexosamines rares : l’acide 2-acétamido-2-désoxy-L-altruronique (A) et le 2-acétamido-4-amino-2,4,6-tridésoxy-D-galactose (B, aussi appelé AAT) associés par des liens glycosidiques 1,2-trans (I). ->4-a-L-AltpNAcA-(1->3)-b-D-FucpNAc4N-(1-> (I). Ces travaux s’intègrent dans un programme visant le développement d’un vaccin issu de sucres de synthèse à couverture large contre les infections par Shigella. Le premier objectif de la stratégie développée contre les infections par S. sonnei est l’identification des épitopes saccharidiques, cibles des anticorps protecteurs. Dans ce but, nous avons entrepris la synthèse d’une diversité de fragments du polysaccharide d’intérêt. Des synthèses multi-grammes de précurseurs orthogonalement protégés des monosaccharides A et B ont été mises au point afin d’accéder aux intermédiaires donneurs et accepteurs impliqués dans les étapes de glycosylation. En particulier, deux voies originales d’accès au précurseur B ont été développées. D’autre part, l’optimisation des conditions de glycosylation et d’oxydation a conduit à un bloc disaccharidique AB compatible avec la synthèse d’oligosaccharides d’ordres supérieurs. Les synthons mono- et disaccharidiques identifiés ont été validés à travers l’obtention de quatre disaccharides portant ou non des modifications de la répartition des charges, de deux trisaccharides ainsi que d’un tétrasaccharide. / 800,000 children die each year of diarrhoeal diseases, making it the second cause of death among children under five. Shigellosis, caused by a Gram negative bacterium, Shigella, is one of the four major forms of diarrhoeal diseases in this population. Natural infection protects against reinfection and the humoral response is primarily directed against the specific polysaccharide moiety of the bacterial lipopolysaccharide. S. sonnei, the prevalent species in developed and transitional countries, displays a zwitterionic polysaccharide, whose disaccharide repeating unit is made of two rare aminosugars: a 2-acetamido-2-deoxy-L-altruronic acid (A) and a 2-acetamido-4-amino-2,4,6-trideoxy-D-galactose (B, AAT) 1,2-trans linked to one another (I). ->4-a-L-AltpNAcA-(1->3)-b-D-FucpNAc4N-(1-> (I). This work is part of the program aimed at the development of a synthetic carbohydrate-based broad coverage vaccine against Shigella infections. In order to define the protective epitopes located on the O-specific polysaccharide of S. sonnei, we tackled the synthesis of fragments thereof. First, multigram-scale syntheses of orthogonally protected precursors to residues A and B were undertaken to access donor and acceptor intermediates in the glycosylation reactions. In particular, two original routes to precursors of residue B were developed. Careful optimisation of the glycosylation and oxidation reaction conditions gave the disaccharide building block AB equipped for the synthesis of chain extension at both ends. Selected mono- and disaccharide building blocks were validated by the synthesis of four disaccharides, bearing modification of the charge pattern or not, two trisaccharides and a tetrasaccharide.

Shigella, l’agent de la dysenterie bacillaire, envahit la muqueuse colique, causant une inflammation intense et destruction tissulaire. Afin de promouvoir l’infection, Shigella injecte des facteurs de virulence par l’intermédiaire d’un appareil de sécrétion de type III (T3SS) dans les cellules hôte, qui permettent la réorganisation du cytosquelette d’actine, régulent l’inflammation et l’intégrité du tissu. Parmi ces facteurs injectés par la bactérie, la protéine IpgD agit comme une phosphatidylinositol (PI) (4,5) bisphosphate phosphatase déphosphorylant le PIP2 en PI(5)P. L’hydrolyse du PI(4,5)P2 favorise la polymérisation de l’actine durant l’invasion des cellules épithéliales et régule négativement la migration des lymphocytes T. Il a également été démontré que le PI(5)P produit par IpgD active la voie de survie cellulaire dépendant de la PI(3) kinase et de la kinase AKT. Mon projet de thèse a pour but de caractériser le rôle d’IpgD dans les contrôles des réponses calciques durant l’invasion des cellules épithéliales par Shigella. Nous avons montré qu’IpgD limite le recrutement de récepteurs à l’inositol-triphosphate (InsP3) au site d’invasion. Des expériences d’imagerie calcique indiquent que durant les étapes précoces de l’invasion, IpgD favorise l’émission de réponses locales aux sites d’invasion de Shigella et limite celle de réponses globales. Des expériences de recouvrement de fluorescence après photo-blanchiment (FRAP) indiquent que les foyers d’invasion induits par le mutant ipgD montrent une diffusion moins restreinte que celle observée dans les foyers induits par la souche sauvage. Des études de modélisation supportent la notion qu’en limitant la production locale d’InsP3 et sa diffusion aux sites d’invasion, IpgD participe au confinement des réponses calciques locales en empêchant l’émission de réponses globales. Nous avons montré que lors de cinétiques d’infection prolongée, IpgD inhibe les réponses calciques globales dépendant de l’InsP3 induites par Shigella ou par des agonistes. L’inhibition de ces réponses conduit à un retard de l’activation de la calpaine, de la dégradation de la taline, une protéine des adhérences focales, ainsi que de la mort des cellules durant la réplication bactérienne intracellulaire. Nos résultats indiquent qu’IpgD est un effecteur critique de Shigella permettant de réguler la transition des réponses calciques locales vers des réponses globales et préservant les cellules infectées de la mort liée à une perte d’adhérence. / Shigella, the agent of bacillary dysentery, invades colonic epithelial cells where it disseminates causing an intense inflammation and tissue destruction. To efficiently promote infection, Shigella injects virulence effectors via a type III secretion system (T3SS) into host cell to divert processes involved in cytoskeletal rearrangements and processes regulating inflammatory signals or tissue integrity. Among the Shigella T3SS effectors, IpgD acts as a phosphatidylinositol (PI) (4, 5) bisphosphate phosphatase, which dephosphorylates PI (4,5) P2 to generate PI(5)P. IpgD-mediated hydrolysis of PI (4, 5) P2 favors actin polymerization during cell invasion and negatively regulates the migration of T cells. PI(5)P produced by IpgD was also shown to up-regulate the PI3K/AKT cell survival pathway and recycling of the Epidermal Growth Factor receptor. My project thesis focuses on the role of IpgD in the control of calcium responses during Shigella infection. We show that that IpgD is responsible for a decrease in the recruitment of inositol-triphosphate (InsP3) receptors at invasion sites. Ca2+-imaging experiments indicate that during the early stages of bacterial invasion, IpgD favors the elicitation of local Ca2+responses at Shigella invasion sites, and limits the induction of global Ca2+ responses. Fliuorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) experiments indicate that actin foci induced by the ipgD mutant show faster diffusion kinetics than those in foci induced by WT. Modeling studies support the notion that the local decrease in InsP3 levels and of its diffusion kinetics triggered by IpgD at entry sites accounted for the modulation of local to global Ca2+ responses during Shigella invasion. We show that over prolonged infection kinetics, IpgD inhibits InsP3-dependent global Ca2+ responses induced by Shigella or agonists. IpgD-mediated inhibition of Ca2+ signals delays the activation of calpain, the degradation of the focal adhesion protein talin, and cell death during bacterial intracellular replication. Our results provide evidence that IpgD is a critical T3SS effector of Shigella regulating the transition from local to global Ca2+ signals, and preserving cells from death linked to loss of adhesion.

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Shigella flexneri est une bactérie à Gram négatif responsable du décès d’environ un million d’individus par an dont la majorité est des enfants âgés de moins de 5 ans. A ce jour, aucun vaccin satisfaisant n’est disponible et la résistance aux antibiotiques ne cesse dangereusement d’augmenter. Pour éradiquer la shigellose il est impératif de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires associés à la pathogénie de Shigella.<p>Dans le cadre de notre projet de thèse, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de plusieurs gènes situés sur le plasmide de virulence de S. flexneri dont SfpgdA, Sfgtr4, virK et les gènes spa9, spa24 et spa29 localisés dans la région d’entrée spécifiant l’appareil de sécrétion de type 3 (AST3). Pour ce faire, nous avons dans un premier temps généré des souches de Shigella mutées (KO) de ces gènes et étudié ensuite leurs propriétés de virulence aussi bien in vitro, dans des modèles cellulaires, qu’in vivo, dans un modèle animal. Nos résultats montrent que le gène SfpgdA code pour une peptidoglycane (PG) déacétylase nécessaire à la survie de Shigella dans les polymorphonucleaire neutrophiles (PMNs). Nous avons également montré que le gène Sfgtr4 spécifie une lipopolysacharide (LPS) glycosyle transférase impliquée dans la résistance au lysozyme et dans la survie dans les PMNs. Des études antérieures avaient montré qu’une mutation à l’aide d’un transposon du gène virK abolissait la dissémination de Shigella entre les cellules épithéliales par un mécanisme restant inconnu. Afin d’investiguer ce mécanisme, nous avons construit un mutant non-polaire du gène virK et étudié son phénotype. A notre grand étonnement, nous avons démontré que ce mutant présente les mêmes propriétés de virulence que la souche sauvage de Shigella. Par contre, comme pour les gènes SfpgdA et Sfgtr4, nous avons montré que le mutant virK est également affecté dans sa résistance au lysozyme et dans sa persistance dans les PMNs. De plus, nous avons montré que l’ensemble des gènes SfpgdA, Sfgtr4 et virK, est impliqué dans la résistance au système immunitaire grâce à la régulation de la sécrétion des cytokines proinflammatoires TNF-α et IL-6. L’existence d’homologie frappante entre les 3 gènes étudiés et des gènes impliqués dans la formation de biofilm chez plusieurs bactéries nous a incités à investiguer cette propriété pour Shigella. Nous avons ainsi montré, pour la première fois, que la souche sauvage de Shigella forme des biofilms in vitro. De plus, nous avons montré que cette formation est accélérée dans les mutants SfpgdA, Sfgtr4 et virK. Finalement, nous avons identifié un réseau d’interactions entre SfPgdA, SfGtr4, VirK et MsbB2, suggérant l’existence d’un complexe localisé à la surface bactérienne qui serait responsable des modifications engendrées au niveau du PG et ou LPS. <p>Dans une autre partie de notre travail nous nous sommes intéressés aux gènes spa9, spa24 et spa29. Nous avons montré que ces 3 gènes sont nécessaires à la sécrétion des protéines de virulence et à l’invasion cellulaire. De plus, nous avons montré qu’un domaine central de la protéine Spa24 (Spa24SD) est nécessaire à l’assemblage de l’AST3 grâce à ces interactions avec différents composants de ce système.<p>La dernière partie de notre travail a porté sur l’étude du gène orf182 et du gène ushA qui existe en 2 copies dans le génome bactérien (un plasmidique et un chromosomique). Les souches de Shigella KO de ces gènes, dans les tests effectués in vitro, présentent approximativement le phénotype sauvage et devraient faire l’objet d’étude plus avancées. <p>En conclusion, nos travaux feront l’objet de 4 publications et représentent une contribution importante à la compréhension des mécanismes moléculaires associés à la pathogénie de Shigella. De plus, nos travaux dépasseront le cadre de Shigella puisque les gènes étudiés ici sont conservés chez plusieurs bactéries pathogènes.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Shigella spp. es una bacteria Gram negativa que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, intracelular facultativa, responsable de la disentería bacilar en el ser humano. Al año ocurren más de un millón de muertes producto de infecciones por Shigella spp., donde la mayoría de los afectados son niños de países subdesarrollados ( Philpott et al, 2000). La patogénesis de Shigella radica en su capacidad de invadir el epitelio intestinal, gatillando una inflamación aguda con ulceración de la mucosa intestinal y la producción de abscesos ( Goldberg et al, 1993). La fase inicial del cuadro, en muchos pacientes, puede presentarse con una diarrea acuosa que puede o no continuar con disentería. Se han descrito dos factores de virulencia que serían responsables de esta diarrea acuosa: enterotoxinas de Shigella 1 y 2 ( ShET1 y ShET2) ( Vargas et al, 1999). El objetivo del presente trabajo es determinar la distribución de ShET1 y ShET2 en dos especies de Shigella: S. flexneri y S. sonnei aisladas de niños con cuadro diarreico ( en un período estival entre 1999-2002). Durante este período se recolectaron 170 muestras, de las cuales se analizaron 104 cepas (51 cepas de S. flexneri y 53 cepas de S. sonnei). Se determinó la presencia de los genes de las enterotoxinas mediante la técnica molecular de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) con partidores específicos. De las cepas estudiadas, 52 (50 %) presentaron 1 o ambos genes que codifican para dichas enterotoxinas, de las cuales 7 cepas (6,7 %) de S. flexneri poseían el gen de ShET1, 25 (23,9 %) el gen de ShET2, y 20 (19,2 %) presentaron ambos genes de las enterotoxinas. De las cepas de S. sonnei 16 (15,3 %) presentaron el gen de ShET2 / Proyecto DID ENL 02/21

OBJETIVO: Determinar la resistencia antibiótica de las cepas de Shigella aisladas en el Hospital Daniel A. Carrión MATERIALES Y METODOS: Se resembraron las 159 cepas de Shigella aisladas del 01 de Enero 1999 al 31 de Diciembre del 2001, siendo viables 111 de ellas con las que se desarrollo el estudio. RESULTADOS: De las 111 cepas, 89 provenían de muestras de heces (80%), 73 eran flexneri (67%), la resistencia a Ampicilina fue 81%, a Cloramfenicol 72%, a Cotrimoxazol 72%, a Amikacina 13%, a Gentamicina 9%, a Ácido Nalidíxico 14%, a Norfloxacina 1%, a Ciprofloxacina 2%; la resistencia múltiple más frecuente fue a 6 antibióticos con 36 cepas (32.4%), y el patrón de resistencia más frecuente fue Ampicilina, Sultamicilina, Cloramfenicol, Doxiciclina, Cotrimoxazol, Tetraciclina con 22 cepas (19.8%). CONCLUSIONES: Shigella flexneri se constituye en la cepa más frecuentemente aislada, se evidencia una leve disminución de la resistencia a Ampicilina y Cloramfenicol, y una progresión de la resistencia a Ácido Nalidíxico y Cotrimoxazol, sin cambios significativos en la resistencia a los Aminoglucósidos y las Quinolonas.

Anthony C.T. Liang. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 1993. / Includes bibliographical references (leaves 73-76). / Abstract --- p.1 / Chapter Chapter 1 --- General Introduction / Chapter 1.1 --- Introduction to antibiotics --- p.2 / Chapter 1.2 --- Use of antibiotics in antimicrobial chemotherapy --- p.3 / Chapter 1.3 --- Drug resistance in bacteria --- p.4 / Chapter 1.4 --- Genetic of infections drug resistance --- p.6 / Chapter 1.5 --- Clinical importance of drug resistance --- p.8 / Chapter 1.6 --- Resistance studies on a clinically- isolated Shigella Species --- p.9 / Chapter Chapter 2 --- Materials and Methods / Chapter 2.1 --- Culture media for bacteria growth --- p.10 / Chapter 2.2 --- Large scale plasmid preparation by CsCl density gradient centrifugation --- p.12 / Chapter 2.3 --- Minipreps of plasmid DNA by the alkaline lysis method --- p.14 / Chapter 2.4 --- Elution of DNA using the Geneclean Kit --- p.16 / Chapter 2.5 --- Transformation of plasmid DNA into E.coli DH5α --- p.17 / Chapter 2.6 --- Antibiotic sensitivity test and screening of resistance colonies --- p.19 / Chapter 2.7 --- Agarose electrophoresis of DNA --- p.20 / Chapter 2.8 --- Restriction and ligation --- p.21 / Chapter 2.9 --- Protocol for studying substrate profiles of aminoglycoside-modifying enzyme (AME) --- p.23 / Chapter 2.10 --- DNA sequencing using the T7 sequencing Kit from Pharmacia --- p.26 / Chapter Chapter 3 --- Antibiotic resistance studies on multiple resistant Shigella spp / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.34 / Chapter 3.2 --- Conjugation and transformation experiment --- p.35 / Chapter 3.3 --- Extraction of plasmid DNA from Shigella 2731and transconjugant 14R525(2731) --- p.37 / Chapter 3.4 --- Discussion --- p.39 / Chapter Chapter 4 --- Cloning and characterization of beta-lactamase gene of Shigella2731 / Chapter 4.1 --- Introduction --- p.40 / Chapter 4.2 --- Cloning of the beta-lactam gene in Shigella2731 --- p.42 / Chapter 4.3 --- "Resistance pattern of El, E2, and S1" --- p.43 / Chapter 4.4 --- "Plasmid DNA extraction of El, E2, and S1" --- p.44 / Chapter 4.5 --- Restriction mapping of the plasmid pSFlOO --- p.47 / Chapter 4.6 --- Discussion --- p.51 / Chapter Chapter 5 --- Cloning and characterization of the aminoglycoside resistance gene / Chapter 5.1 --- Introduction --- p.53 / Chapter 5.2 --- Cloning of the aminoglycoside resistance genes --- p.56 / Chapter 5.3 --- Substrate profile studies on aminoglycoside- modifying enzyme (AME) activity on transformant G and S --- p.57 / Chapter 5.4 --- Subcloning of plamsid DNA from transformant S --- p.60 / Chapter 5.5 --- "DNA sequencing of fragments A, B, and C" --- p.65 / Chapter 5.6 --- Discussion --- p.68 / Chapter Chapter 6 --- Conclusion --- p.79 / Chapter Chapter 7 --- Reference --- p.73

Abstract not available

Shigellae are pathogenic bacteria that cause the disease shigellosis. Two methods for studying secreted effectors encoded by this pathogen’s virulence plasmid are described. First, protein microarrays were used to identify substrates of an E3 ubiquitin ligase called IpaH7.8. Second, a deletion collection containing mutants for every gene on the virulence plasmid was used in two screens: one to identify mutants that elicit atypical levels of Interleukin-8 (IL-8) from U937 cells, and one to identify mutants that bind the dye Congo red abnormally. Although protein microarrays were an ineffective tool, the deletion collection proved valuable. Most mutants were less effective at sequestering Congo red than wild-type S. flexneri, although this ability was enhanced in several mutants. Four mutants, ?ospB, ?orf186, ?mxiH and ?mxiK, elicited higher levels of IL-8 from U937 cells than wild type S. flexneri. These results validate the use of the deletion collection as a tool for studying bacterial pathogenesis.

Thesis (Ph.D. (Tropical Medicine)) -- Mahidol University, 1999.