Auf der Suche nach physiologischen Substraten der MAPK-aktivierten Proteinkinasen (MAPKAP-Kinasen), 3pK und MAPKAP-K2 (MK2), wurden Mitglieder eines Säuger-Polycomb-Komplexes, HPH2 und das Protoonkoprotein Bmi1, als Interaktionspartner identifiziert. Proteine aus der Polycomb-Gruppe (PcG) sind dafür bekannt, multimere, Chromatin-assoziierte Proteinkomplexe zu bilden. Diese wirken als transkriptionelle Repressoren und spielen als solche eine wichtige Rolle sowohl in der Regulation von Entwicklungsprozessen als auch in der Kontrolle der zellulären Proliferation. HPH2 bindet im Hefe two-hybrid-System sowohl an 3pK als auch an MK2. Die Kinasen coimmunpräzipitieren auch mit den PcG-Proteinen. Weiterhin wurde festgestellt, daß nicht aktivierte und DNA-assoziierte 3pK, ähnlich wie Bmi1, in einem in vivo Repressionsassay als transkriptioneller Repressor wirkt. Dies unterstellt, daß 3pK, wie Bmi1, fähig sein muß, andere PcG-Proteine an das Zielgen zu rekrutieren, wo sich dann ein biologisch funktioneller Repressionskomplex rekonstituiert. Bmi1 ist ein Phosphoprotein und beide MAPKAP-Kinasen konnten in dieser Arbeit als in vitro Bmi1-Kinasen identifiziert werden. Da der Phosphorylierungsstatus von Bmi1 mit seiner Dissoziation und der anderer PcG-Proteine vom Chromatin korreliert, könnten die MAPKAP-Kinasen Regulatoren einer phosphorylierungs-abhängigen PcG-Komplex/Chromatin-Interaktion sein. 3pK und MK2 wurden hier als die ersten Kinasen identifiziert, die in Assoziation mit Proteinen von PcG-Komplexen vorliegen, was ein funktionelles Zusammenwirken von MAPK-Signaltransduktionsnetzwerk und der Regulation der PcG-Funktion nahe legt. Ein weiterer durch das two-hybrid-System und Coimmunpräzipitationsexperimente identifizierter Interaktionspartner beider hier analysierter MAPKAP-Kinasen ist der basische Helix-Loop-Helix- (bHLH) Transkriptionsfaktor E47. Dieses E2A-kodierte Protein bindet als Homo- bzw. Heterodimer mit gewebespezifischen bHLH-Proteinen an sogenannte E-Box-DNA-Motive und ist so in die Regulation gewebespezifischer Genexpression und Zelldifferenzierung involviert. In dieser Arbeit konnten 3pK und MK2 als in vitro Kinasen des in Zellen phosphoryliert vorliegenden Transkriptionsfaktors identifiziert werden. Weiterhin führte die transiente Expression jeder dieser Kinasen in einem Reportergenassay mit einem E-Box-Promotorkonstrukt zu einer Repression der transkriptionellen Aktivität von E47. Der bHLH-Transkriptionsfaktor E47 interagiert also mit beiden MAPKAP-Kinasen, 3pK und MK2, was die Kinasen als neu identifizierte Regulatoren der E47-abhängigen Genexpression präsentiert. Mit dieser Arbeit ist ein erster Aufschluß der physiologischen Aktivität der MAPKAP-Kinasen 3pK und MK2 als transkriptionelle Regulatoren gelungen. / SUMMARY In a search for physiological substrates for the MAPK-activated protein kinases (MAPKAP kinases), 3pK and MAPKAPK-2 (MK2), constituents of a mammalian polycomb complex, HPH2 and the proto-oncoprotein Bmi1 were identified as interaction partners. Polycomb group (PcG) proteins are characterised to form large multimeric, chromatin-associated protein complexes with repressive transcriptional function. PcG complexes have an important role in the regulation of developmental processes and in the control of cellular proliferation. HPH2 binds to either kinase in a yeast two-hybrid assay and both, 3pK and MK2 are shown here to coimmunoprecipitate with HPH2 and Bmi1 or Bmi1 from mammalian cell lysates, respectively. Further, non-activated and DNA-bound 3pK could be identified as a transcriptional repressor of a chromatin-embedded gene in an artificial repression assay similar to the function of Bmi1. This suggests, that non-activated and DNA-bound 3pK, like Bmi1, must be able to recruit other PcG proteins to the target gene to reconstitute a functional repressive complex. Bmi1 is a phosphoprotein and both, 3pK and MK2 were identified in this paper to be in vitro Bmi1-kinases. Since the Bmi1 phosphorylation status was shown to be correlated with its dissociation from chromatin, it is likely that the MAPKAP kinases might be regulators of phosphorylation-dependent PcG-complex/chromatin interaction. In summary, the MAPK-activated protein kinases 3pK and MK2 are the first kinases identified to be assembled with members of PcG-protein complexes, suggesting a link of the MAPK signalling network to the regulation of PcG complex function. Another new interaction partner of both MAPKAP kinases which was identified by means of the two-hybrid system and coimmunoprecipitation experiments is the basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factor E47. This E2A-encoded protein is known to be involved in the regulation of tissue-specific gene expression and cell differentiation. E47 is a phosphoprotein, and 3pK and MK2 were identified as E47-kinases in vitro. Further, expression of either kinase results in a repression of the transcriptional activity of overexpressed E47 in transient reporter gene assays with an E-box containing promoter construct. In summary, the MAPK-activated protein kinases 3pK and MK2 were identified to be assembled with the bHLH transcription factor E47 suggesting that these kinases are regulators of E47 activity and E47 dependent gene expression. These results provide first evidence for the physiological function of the MAPKAP kinases 3pK and MK2 as transcriptional regulators.

Die Stimulation primärer erythroider Vorläuferzellen (PEPs) mit Erythropoetin (Epo) führt zur Aktivierung der mitogenen Kinasen („extracellular signal-regulated kinases“ (Erks) und „mitogen-activated protein kinase/Erk-activating kinases“ (MEKs)). Der Mechanismus der Aktivierung war bisher unklar. Mehrere wissenschaftliche Gruppen haben zudem unerwartet herausgefunden, dass eine Verkürzung und Mutation des zytoplasmatischen Endes des Epo-Rezeptors (EpoR), welche zum Verlust der Bindungsmöglichkeiten für verschiedene Signalproteine führt, anscheinend nur einen geringen Effekt auf das EpoR-Signalsystem hat. Diese Ergebnisse werden durch Viabilität und normaler Erythrozytenzahl von mutierten Mäusen unterstützt. Ein neuer Signalweg, der in biochemischen Studien mit aus menschlichem Nabelschnurblut gewonnenen PEPs gefunden wurde, könnte diese überraschenden Ergebnisse erklären. Wir zeigen zum ersten mal, dass Ras und das Klasse 1b Enzym der Familie der Phosphatidylinositol-3-Kinasen (PI3K), PI3Kg, nach Stimulation mit einer physiologischen Konzentration von Epo aktiviert werden. Überraschenderweise kann in PEPs die Epo-induzierte Ras-, MEK- und Erk-Aktivierung durch drei strukturell unterschiedliche PI3K-Inhibitoren blockiert werden. Überdies ist die Erk-Aktivierung in PEPs unempfindlich gegenüber Inhibierung der Raf-Kinasen, wird aber durch Proteinkinase C (PKC)-Inhibitoren unterdrückt. Im Gegensatz dazu ist die durch Stammzellfaktor („stem cell factor“ (SCF)) induzierte Erk-Aktivierung empfindlich gegenüber Raf-Inhibierung, jedoch unempfindlich gegenüber PI3K- und PKC-Inhibitoren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aktivierung von MEKs und Erks in PEPs durch geringe Konzentrationen an Epo nicht durch die klassische Signalkaskade „Src homology 2 domain-containing transforming protein C“ (Shc), „growth factor receptor bound protein 2“ (Grb2), „son of sevenless“ (Sos), Ras, Raf, MEK und Erk erfolgt, sondern durch einen PI3K-abhängigen und Raf-unabhängigen Signalweg, welcher PKC-Aktivität benötigt, reguliert wird. / Stimulation of primary erythroid progenitors (PEPs) with erythropoietin (Epo) leads to the activation of the mitogenic kinases (extracellular signal-regulated kinases (Erks) and mitogen-activated protein kinase/Erk-activating kinases (MEKs)). So far, it has been unclear how this is mechanistically accomplished. Moreover, several research groups unexpectedly found that truncation and mutation of the cytoplasmic tail of the Epo receptor (EpoR), which prevents binding of numerous signal-transducing proteins, had apparently little effect on EpoR signalling. These results are supported by viability and normal erythrocyte counts of mutant mice. A novel pathway, now unraveled by biochemical studies in human cord blood-derived PEPs, might explain these puzzling findings. We show, for the first time, that Ras and the class Ib enzyme of the phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) family, PI3Kg, are activated in response to physiological Epo concentrations. Surprisingly, Ras, MEK and Erk activation by Epo in PEPs can be blocked by three structurally different PI3K inhibitors. Furthermore, Erk activation in PEPs is insensitive to the inhibition of Raf kinase but suppressed upon protein kinase C (PKC) inhibition. In contrast, Erk activation induced by stem cell factor (SCF), which activates c-Kit in the same cells, is sensitive to Raf inhibitors and insensitive to PI3K and PKC inhibitors. These results indicate that the activation of MEKs and Erks by minimal concentrations of Epo in PEPs does not occur through the classical cascade Src homology 2 domain-containing transforming protein C (Shc), growth factor receptor bound protein 2 (Grb2), son of sevenless (Sos), Ras, Raf, MEK and Erk. Instead, MEKs and Erks are activated via PI3K, through a Raf-independent signalling pathway which requires PKC activity.

Die molekularen Mechanismen der Wirt-Parasit-Interaktion bei der durch den Zestoden Echinococcus multilocularis ausgelösten Erkrankung der alveolären Echinokokkose sind bislang ungeklärt. Zudem liegen keine Daten über Entwicklungs- und Differenzierungsmechanismen dieses Parasiten vor, die für die Entwicklung neuer Antiparasitika genutzt werden könnten. Ein bei der Evolution der Metazoen bereits frühzeitig entstandener Signaltransduktionsmechanismus zur Steuerung von Entwicklungsvorgängen ist das TGFβ/BMP-System, das aus strukturell verwandten Zytokinen der TGFβ (transforming growth factor β) bzw. BMP (bone morphogenetic protein)-Familie, oberflächenständigen Rezeptoren der TGFβ-Rezeptorfamilie (Typ I und Typ II) und intrazellulären Signaltransduktoren der Smad-Familie besteht. Außer an Entwicklungsvorgängen tierischer Organismen könnte diesem System eine wichtige Rolle bei der Wirt-Helminth-Kommunikation während Infektionsprozessen zukommen, wie in vorherigen Studien am Nematoden Brugia malayi und am Trematoden Schistosoma mansoni gezeigt werden konnte. Erste, wichtige Schritte zur Charakterisierung von TGFβ und BMP-Signalsystemen in Zestoden wurden in der vorliegenden Arbeit getan. Aufbauend auf einem vorherigen Bericht zu einem Transmembranrezeptor (EmRSK1) und einem Smad-Homologen (EmSmadA) aus Echinococcus multilocularis wurde die Liste der TGFβ/BMP Signaltransduktionsfaktoren in E. multilocularis in dieser Arbeit deutlich erweitert und erstmals umfangreiche funktionelle Studien durchgeführt. Die hier charakterisierten Faktoren umfassen zwei weitere Serin/Threonin-Kinasen der TGFβ/BMP-Rezeptorfamilie (EmRSK2, EmRSK3) sowie intrazelluläre Transduktoren der R-Smad-Subfamilie (EmSmadB, EmSmadC) und ein Homologes zur MAP-kinase-kinase-kinase TAK1 (TGFβ activated kinase 1), genannt EmTAK1. Zudem konnte erstmals für einen parasitären Helminthen ein Zytokin der BMP-Subfamilie, EmBMP, auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Strukturelle und funktionelle Untersuchungen legen nahe, dass E. multilocularis sowohl ein TGFβ wie auch ein BMP-Signalsystem exprimiert. Ersteres wird sehr wahrscheinlich durch die Kinase EmRSK2 und den Smad-Faktor EmSmadC gebildet, letzteres durch EmRSK1 und EmSmadB. EmSmadA nimmt eine Sonderstellung ein, da es sowohl durch TGFβ- wie auch durch BMP-Rezeptoren aktiviert werden kann. Die genaue Rolle von EmRSK1 und EmTAK1 wäre durch weitere Untersuchungen zu klären. Signifikante funktionelle Homologien zwischen den TGFβ/BMP-Signalsystemen des Parasiten und Säugern konnten nachgewiesen werden, die sich u.a. darin äußern, dass die Echinococcus Smad-Proteine durch entsprechende Rezeptoren des Menschen aktiviert werden können. Darüber hinaus konnten jedoch auch einige deutliche Unterschiede zwischen den Systemen aus Parasit und Wirt nachgewiesen werden, die sich als Angriffspunkte zur Entwicklung von Chemotherapeutika eignen könnten. So fehlt den Smad-Faktoren EmSmadA und EmSmadC eine MH1-Domäne, die sonst unter allen R-Smads hoch konserviert ist. Zudem sind einige bislang noch nie beschriebene, strukturelle Besonderheiten der Echinococcus TGFβ/BMP-Rezeptoren zu verzeichnen. Auch die Regulation dieser Faktoren und die Kreuz-Interaktion mit weiteren intrazellulären Signalwegen (z.B. der MAP Kinase Kaskade) scheint in E. multilocularis anders zu verlaufen als bislang für Vertebraten, Insekten oder Nematoden beschrieben. Schließlich konnte, als sehr wichtiger Befund, auch nachgewiesen werden dass mindestens ein Rezeptor des Parasiten, EmRSK1, mit einem Zytokin des Wirts (BMP2) in vitro funktionell interagiert. Da BMP2 in Zellkultursystemen, die das Wachstum des Parasiten am befallenen Wirtsorgan nachstellen, einen deutlichen Effekt auf E. multilocularis ausübt, könnte die hier beschriebene EmRSK1/BMP2 – Interaktion von entscheidender Bedeutung für die Wirt-Parasit-Interaktion bei der alveolären Echinokokkose sein. / Up to now, the molecular mechanisms of the interactions between host and parasite in the disease of alveolar echinococcosis, caused by the cestode Echinococcus multilocularis, are not understood. Furthermore there are not data available about the mechanisms of development and differentiation in this parasite that could be used for the design of novel antiinfectives. One of the signaling systems which emerged very early in metazoan evolution and which presumably controls developmental processes in all animals is the TGFβ signal transduction system. This system consists of various factors: structurally related cytokines of the TGFβ (transforming growth factor β) and the BMP (bone morphogenetic protein) family, surface associated receptors of the TGFβ receptor family (type I and type II) and intracellular signal transduction factors of the Smad family. In addition to their crucial role in animal development, TGFβ/BMP systems could also play an important role in the communication between host and helminths during an infection, as has been shown previous studies on the nematode Brugia malayi and the trematode Schistosoma mansoni. In this study, the initial steps towards a characterization of TGFβ/BMP signaling in the third large group of parasitic helminths, the cestodes, have been made. Adding to a previous report on a transmembrane receptor (EmRSK1) and a Smad homologue (EmSmadA) from E. multilocularis, this work significantly extends the list of known TGFβ/BMP signaling factors from Echinococcus and provides, for the first time, functional studies on these systems. The newly characterized factors comprise two further serin/threonin kinases of the TGFβ/BMP receptor family (EmRSK2, EmRSK3), two further intracellular transducing factors belonging to the subfamiliy of R-smads (EmSmadB, EmSmadC) and one homologue of the MAP-kinase-kinase-kinase TAK1 (TGFβ activated kinase 1), which was designated EmTAK1. Furthermore, and for the first time in a parasitic helminth, a cytokine of the BMP subfamily was characterized on the molecular level. Structural and functional studies suggested that E. multilocularis expresses both a TGFβ and a BMP signaling system. The kinase EmRSK2 and the Smad factor EmSmadC are most probably components of the first, EmRSK1 and EmSmadB parts of the latter system. Surprisingly, EmSmadA seems to constitute an unusual Smad since it can be activated by both TGFβ and the BMP receptors upon expression in mammalian cells. The precise roles of EmRSK3 and EmTAK1 have to be determined in future studies. In the present work, significant structural and functional homologies between the TGFβ/BMP systems of E. multilocularis and its mammalian hosts have been detected. Upon expression in human cells, the Echinococcus Smad proteins were, for example, able to functionally interact with the corresponding receptors from Homo sapiens. On the other hand, the E. multilocularis TGFβ/BMP signaling factors also displayed several biochemical differences to those of the host, which could be exploited for the development of antiparasitic drugs. One of these differences is the lack of a usually conserved MH1 domain in EmSmadA and EmSmadC. Moreover, the Echinococcus TGFβ/BMP receptors display several structural features which have not yet been detected in other members of the protein superfamily. Likewise, the regulation of TGFβ/BMP pathways in Echinococcus as well as their cross-interaction with other signaling pathways (e.g. the MAP kinase cascade) seems to differ from the situation in vertebrates, insects and nematodes. Finally, this work also provides evidence that at least one host cytokine, BMP-2, can functionally interact with a receptor of the parasite, EmRSK1. This interaction could be highly relevant for host-parasite interaction mechanisms in alveolar echinococcosis since BMP-2 also exerts clear effects on Echinococcus growth and differentiation in an in vitro cultivation system that mimicks the situation at the affected organ during an infection.

Parasitic helminths share a large degree of common genetic heritage with their various hosts. This includes cell-cell-communication mechanisms mediated by small peptide cytokines and lipophilic/steroid hormones. These cytokines are candidate molecules for host-parasite cross-communication in helminth diseases. In this work the function of two evolutionary conserved signaling pathways in the model cestode Echinococcus multilocularis has been studied. First, signaling mechanisms mediated through fibroblast growth factors (FGF) and their cognate receptors (FGFR) which influence a multitude of biological functions, like homeostasis and differentiation, were studied. I herein investigated the role of EmFR which is the only FGFR homolog in E. multilocularis. Functional analyses using the Xenopus oocyte expression system clearly indicate that EmFR can sense both acidic and basic FGF of human origin, resulting in an activation of the EmFR tyrosine kinase domain. In vitro experiments demonstrate that mammalian FGF significantly stimulates proliferation and development of E. multilocularis metacestode vesicles and primary cells. Furthermore, DNA synthesis and the parasite’s Erk-like MAPK cascade module was stimulated in the presence of exogenously added mammalian FGF. By using the FGFR inhibitor BIBF1120 the activity of EmFR in the Xenopus oocyte system was effectively blocked. Addition of BIBF1120 to in vitro cultivated Echinococcus larval material led to detrimental effects concerning the generation of metacestode vesicles from parasite stem cells, the proliferation and survival of metacestode vesicles, and the dedifferentiation of protoscoleces towards the metacestode. In conclusion, these data demonstrate the presence of a functional EmFR-mediated signaling pathway in E. multilocularis that is able to interact with host-derived cytokines and that plays an important role in larval parasite development. Secondly, the role of nuclear hormone receptor (NHR) signaling was addressed. Lipophilic and steroid hormone signaling contributes to the regulation of metazoan development. By means of in silico analyses I demonstrate that E. multilocularis expresses a set of 17 NHRs that broadly overlaps with that of the related flatworms Schistosoma mansoni and S. japonicum, but also contains several NHR encoding genes that are unique to this parasite. One of these, EmNHR1, is homolog to the DAF-12/HR-96 subfamily of NHRs which regulate cholesterol homeostasis in metazoans. Modified yeast-two hybrid analyses revealed that host serum contains a ligand which induces homodimerization of the EmNHR1 ligand-binding domain. Also, a HNF4-like homolog, EmHNF4, was characterized. Human HNF4 plays an important role in liver development. RT-PCR experiments showed that both isoforms of the EmHNF4 encoding gene are expressed stage-dependently suggesting distinct functions of the two isoforms in the parasite. Moreover, specific regulatory mechanisms on the convergence of NHR signaling and TGF-β/BMP signaling pathways in E. multilocularis have been identified. On the one hand, EmNHR1 directly interacted with the EmSmadC and on the other hand EmHNF4b interacted with EmSmadD, EmSmadE which are all downstream signaling components of the TGF-β/BMP signaling pathway. This suggests cross-communication in order to regulate target gene expression. With these results, further studies on the role of NHR signaling in the cestode will be facilitated. Also, the first serum-free in vitro cultivation system for E. multilocularis was established using PanserinTM401 as medium. Serum-free co-cultivation with RH-feeder cells and an axenic cultivation method have been established. With the help of this serum-free cultivation system investigations on the role of specific peptide hormones, like FGFs, or lipophilic/steroid hormones, like cholesterol, for the development of helminths will be much easier. / Parasitäre Würmer weisen eine große genetische Verwandtschaft mit ihren Wirten auf. Diese schließt auch Zell-Zell-Kommunikationsmechanismen ein, die sowohl durch Peptidhormone als auch durch lipophile/steroidale Hormone vermittelt werden. Man vermutet, dass diese Stoffe eine wichtige Rolle bei der Wirt-Parasiten-Kreuzkommunikation spielen. Deshalb untersuchte diese Arbeit die Funktion von zwei konservierten Signalwegen im Modellorganismus Echinococcus multilocularis. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit den Fibroblast Growth Factors (FGF). Diese steuern durch die Bindung an spezifische FGF-Rezeptoren (FGFR) eine Vielzahl von biologischen Funktionen, wie beispielsweise Homöostase- und Differenzierungsprozesse. Zunächst wurde EmFR, das einzige FGFR-Homolog im Fuchsbandwurm in Xenopus Oozyten heterolog exprimiert. Dabei wurde nachgewiesen, dass der Rezeptor sowohl acidic als auch basic FGF erkennen kann und dies zur Aktivierung der Tyrosinkinasedomäne führt. Außerdem förderte im in vitro Experiment die exogene Zugabe dieser Wirtsfaktoren die Proliferation und Entwicklung von Metacestodenvesikeln und Primärzellen. Darüber hinaus wurden die DNA-Synthese und die Erk-MAPK-Kaskade des Parasiten stimuliert. Im Gegensatz dazu konnte durch die Hinzugabe des FGFR-Inhibitor BIBF1120 die Aktivität des Rezeptors im Xenopus Oozytensystem erfolgreich blockieret werden. Durch den Inhibitor wurde die Regeneration von Metacestodenvesikeln aus Stammzellen, die Proliferation und das Überleben von Metacestodenvesikeln verhindert und eine Dedifferenzierung von Protoskolizes verursacht. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass E. multilocularis einen funktionellen durch EmFR-vermittelten Signalweg besitzt, welcher in der Lage ist, mit Wirtszytokinen zu interagieren und eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Echinococcus Larvenstadien spielt. Außerdem wurde die Bedeutung der Nukleären Hormon Rezeptoren (NHR) für den Parasiten untersucht. Lipophile und steroidale Hormone regulieren viele Entwicklungsprozesse in Metazoen. Mittels in silico Analyse konnten 17 Rezeptoren der NHR-Familie in E. multilocularis identifiziert werden, die größtenteils mit dem NHR Repertoire von Schistosoma mansoni und S. japonicum übereinstimmen. Allerdings wurden auch Rezeptoren identifiziert, die einzigartig für E. multilocularis sind. Einer dieser Rezeptoren, EmNHR1, ist homolog zur DAF-12/HR-96 Familie, die den Cholesterinstoffwechsel in Metazoen reguliert. Yeast-Two Hybrid Experimente zeigten, dass Wirtsserum den putativen Liganden von EmNHR1 enthält, da dessen Zugabe zur Homodimerisierung der EmNHR1-Liganden-bindungsdomäne führte. Außerdem wurde mit EmHNF4 ein weiterer Rezeptor charakterisiert, dessen humanes Homolog die Entwicklung der Leber beeinflusst. RT-PCR-Experimente zeigten, dass die zwei entdeckten Isoformen von EmHNF4 stadienspezifisch exprimiert werden, was auf mögliche Funktionsunterschiede deutet. Darüber hinaus wurde sowohl für EmNHR1, als auch für EmHNF4 beobachtet, dass die DNA-Bindungsdomänen mit Komponenten des TGF-β/BMP-Signalwegs direkte Proteininteraktionen eingehen. Während EmNHR1 mit EmSmadC interagiert, zeigte EmHNF4b eine Reaktion mit EmSmadD und EmSmadE, was auf eine Kreuzkommunikation zwischen beiden Signalwegen deutet. Diese Ergebnisse werden zukünftige Studien bezüglich der Funktion von NHR-Signalwegen in Zestoden deutlich erleichtern. Weiterhin wurde in dieser Arbeit das erste serum-freie in vitro Kultivierungssystem für E. multilocularis etabliert. PanserinTM401 diente als Medium sowohl für die Kultur mit Fütterzellen als auch für eine axenische Kulturmethode. Mit Hilfe dieses Systems können in Zukunft Untersuchungen über die Rolle von Peptidhormonen wie FGF, oder lipophilen bzw. steroidalen Substanzen, wie Cholesterin, bei der Parasitenentwicklung besser untersucht werden.

Die vorliegende Arbeit behandelt TRAIL-induzierte Apoptose und Nekroptose in verschiedenen Zelllinien. Im Speziellen wurden die verschiedenen Funktionen des TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) untersucht. Hierzu wurde ein transienter Knockdown etabliert und dessen Wirkung auf die Suszeptibilität der Zellen gegenüber dem Zytokin TRAIL untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein Knockdown von TRAF2 nicht nur zur Sensitivierung für Apoptose führt, sondern auch in Nekroptose-kompetenten Zellen zu einer Verstärkung der durch Caspaseinhibition mittels zVAD-fmk nach TRAIL-Stimulation induzierten Nekroptose führt. Mittels des Zytokins Fc-TWEAK wurde Fn14-vermittelt TRAF2 aus dem Zytosol in ein Triton X100-unlösliches Kompartiment rekrutiert und dadurch physiologisch depletiert. Dies führte zwar kaum zu gesteigerter TRAIL-abhängiger Apoptose, sensitivierte jedoch analog zum TRAF2-Knockdown RIP3-exprimierende Zellen für Nekroptose. Durch Vergleich RIP3-negativer (HeLa-Leervektor) mit RIP3-exprimierenden Zellen (HeLa RIP3, HT29, HaCaT) konnte die Essentialität von RIP3 für die Nekroptose herausgestellt werden und Einsatz des RIP1-Kinase-Inhibitors Necrostatin-1 sowie des MLKL-Inhibitors Necrosulfonamide belegte die Beteiligung der Nekroptosomkomponenten RIP1 und MLKL. Antagonismus putativen autokrinen TNFs bewies, dass es sich bei dem durch Fc-TWEAK verstärkten Zelltod um einen direkten TRAIL-Effekt handelte und Inhibition kanonischen NFkBs durch IKK2-Inhibitor TPCA-1, dass die TRAF2-Knockdown-vermittelte Sensitivierung gegenüber TRAIL nicht auf verändertes NFkB-Signalling zurückzuführen ist. Einsatz des SMAC-Mimetikums BV6 rekapitulierte zudem stark das im TRAF2-Knockdown Gesehene und unterstrich die Bedeutung der cIAPs. Immunpräzipitation von Caspase 8 unter nekroptotischen Bedingungen zeigte bei TRAF2-Knockdown eine Depletion von TRAF2 und cIAP1/2 sowie RIP1 und RIP3 aus dem Komplex mit Caspase 8. Insgesamt wird deutlich, dass TRAF2 einerseits antiapoptotisch wirkt als K48-Ubiquitinligase, die die Halbwertszeit aktiver Caspase 8-Komplexe determiniert und andererseits eine antinekroptotische Funktion hat, da es durch Rekrutierung von cIAP1/2 an RIP1 die TRAIL-induzierte Nekroptose verhindert, wenn die Caspasen inhibiert sind. / This study focussed on TRAIL-induced apoptosis and necroptosis in a number of different cell lines. In detail, the different functions of TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) were examined. Establishment of a transient TRAF2 knockdown discovered not only sensitization for apoptosis upon treatment with the cytokine TRAIL but also enhanced necroptosis in cells competent for this alternative programmed cell death mode. Physiological recruitment of TRAF2 into a triton x100- insoluble compartment using Fn14 ligand Fc-TWEAK revealed no stronger apoptosis after TRAIL treatment, but featured enhanced necroptosis. Comparing RIP3-negative cells (HeLa) with RIP3-expressing cells (HeLa RIP3, HT29, HaCaT) confirmed necroptosis and the necessity of RIP3 for necroptosis. Using RIP1 kinase inhibitor necrostatin 1 and MLKL inhibitor necrosufonamide fortified the involvement of the necroptosome components RIP1 and MLKL in TRAIL-induced necroptosis. Antagonizing putative autocrine TNF verified the thesis that the enhanced cell death phenotype observed upon Fc-TWEAK pre-treatment was indeed a genuine TRAIL signalling effect. Inhibition of classical NFB via TPCA-1 ruled out possibly altered NFB signalling due to TRAF2 knockdown. SMAC mimetics with BV6 strongly recapitulated the TRAF2 knockdown-induced phenotype in TRAIL-derived apoptosis and necroptosis and emphasizes cIAP1/2 relevance. Under necroptotic conditions, immunoprecipitation of caspase 8 complexes revealed depletion of TRAF2, cIAP1/2, RIP1 and RIP3 upon TRAF2 knockdown. Summarizing, by determining the shelf life of activated caspase 8, TRAF2 directly acts antiapoptotically. Moreover, by recruiting cIAP1/2 to RIP1, TRAF2 inhibits TRAIL-induced necroptosis, under conditions where caspases are inhibited.

Die essenzielle, Ubiquitin-selektive ATPase p97 reguliert eine Vielzahl unterschiedlicher Prozesse in Eukaryoten. Dazu zählen Proteinqualitätskontrolle, DNA-Reparatur, Signaltransduktion, Zellzykluskontrolle, Autophagie sowie das endolysosomale System. Diese unterschiedlichen Funktionen von p97 werden durch die Bindung von Kofaktoren engmaschig gesteuert und kontrolliert. Die größte und am besten untersuchte Gruppe von p97-Kofaktoren sind die Proteine der UBX Familie. Diese zeichnen sich durch den Besitz einer UBX-Domäne aus, welche die Bindung an p97 vermittelt. Das in höheren Eukaryoten konservierte Familienmitglied UBXD1 besitzt darüber hinaus mit einer PUB-Domäne und einem VIM-Motiv noch mindestens zwei weitere p97-Bindemodule. UBXD1 kann an Vesikel des endolysosomalen Degradationssytems lokalisieren, seine genauen zellulären Funktionen sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung von humanem UBXD1. Dafür wurden Kandidaten eines zuvor durchgeführten Yeast-Two-Hybrid-Screens auf ihre Two Hybrid-Interaktion mit unterschiedlichen UBXD1-Varianten getestet. Darüber hinaus wurde durch Immunpräzipitationsexperimente untersucht, ob die Kandidatenproteine auch in Säugerzellen mit UBXD1 interagieren. Als vielversprechende neue Bindungspartner von UBXD1 wurden so die Ubiquitin-Ligase TRIAD3A und das Ubiquitin-editierende Protein A20 identifiziert. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen UBXD1 und A20 von einer funktionellen PUB Domäne und dem siebten Zinkfinger Motiv von A20 abhängig ist. Da sowohl TRIAD3A als auch A20 negative Regulatoren des NF B Signalweges sind, wurde daraufhin untersucht, ob auch UBXD1 eine Funktion in diesem Signalweg besitzt. Tatsächlich war in UBXD1-depletierten HeLa 57A-Zellen die NF B-abhängige Expression eines Reportgens nach Aktivierung des Signalweges durch TNF, IL-1, Doxorubicin und H2O2 stark reduziert. Dabei spricht die verringerte Aktivierung nach unterschiedlichen Stimuli für eine generelle Rolle von UBXD1 im NF B Signalweg. Durch quantitative Echtzeit-PCR konnte gezeigt werden, dass in HeLa- und HEK293T-Zellen nach UBXD1-Depletion auch die Expression endogener NF B Zielgene verringert ist. Da in UBXD1-depletierten Zellen nach Stimulation mit TNF oder IL-1 bereits die Kerntranslokation des NF B-Transkriptionsfaktor p65 reduziert ist, ist davon auszugehen, dass UBXD1 an einer früheren Phase der Aktivierung des Signalweges beteiligt ist. Möglicherweise ist dies darauf zurückzuführen, dass UBXD1 bekannte Funktionen von A20 reguliert und etwa die Bindung von A20 an Vesikel des endolysosomalen Systems oder an lineare Ubiquitinketten beeinflusst. Diese Arbeit beschreibt somit eine neue Funktion des p97-Kofaktors UBXD1 im NF B-Signalweg. / The essential, ubiquitin-selective ATPase p97 regulates a variety of cellular processes in eukaryotes. Among others, these include protein quality control, DNA repair, signal-transduction, cell cycle control, autophagy and the endolysosomal system. The distinct functions of p97 are tightly controlled by regulatory cofactors. UBX domain-containing proteins are the largest and best studied group of p97 cofactors . They are characterized by a UBX domain, which mediates binding to p97. The family-member UBXD1 is highly conserved in higher eukaryotes and possesses at least two additional p97 binding modules, a PUB domain and a VIM motif. While UBXD1 can localize to vesicles of the endolysosomal degradation system, its exact cellular function is still poorly understood. The aim of this study was the functional characterisation of human UBXD1. To that end, candidates of a previous yeast two-hybrid screen were tested for their two-hybrid interaction with different UBXD1 variants. Immunoprecipitation experiments were used to analyse if the candidates also interact with UBXD1 in mammalian cells. This led to the identification of the ubiquitin-ligase TRIAD3A and the ubiquitin-editing protein A20 as promising new binding partners of UBXD1. Moreover, it could be demonstrated that the interaction between UBXD1 and A20 depends on a functional PUB domain and the seventh zinc finger motif of A20. Because both TRIAD3A and A20 are negative regulators of the NF-B signaling pathway, it was subsequently tested if UBXD1 also has a function in NF-B signaling. Indeed, UBXD1-depleted HeLa 57A cells showed a strongly reduced NF B dependent expression of a reporter gene after activation of the signaling pathway by TNF, IL-1, Doxorubicin and H2O2. The reduced activity observed after various stimuli argues for a general role of UBXD1 in the NF-B signaling pathway. Quantitative real-time PCR demonstrated that the expression of endogenous NF-B target genes in HeLa and HEK293T cells was also reduced upon UBXD1-depletion. Since the nuclear translocation of the NF-B subunit p65 upon stimulation with TNF or IL-1was also reduced in UBXD1-depleted cells, UBXD1 is likely to participate in an earlier phase of NF-B activation. It is possible that UBXD1 regulates a known function of A20 and influences for example the binding of A20 to endocytic vesicles or to linear ubiquitin chains. In summary, this work describes a novel function of the p97 cofactor UBXD1 as a positive regulator of the NF-B signaling pathway.

Zugl.: Salzburg, Univ., Diss., 2005 / Hergestellt on demand

Zugl.: Leipzig, Universiẗat, Habil.-Schr., 2009.

Leipzig, Universität, Habilitation, 2002.

Frankfurt (Main), Universiẗat, Diss., 2007.