Tesis por compendio / [EN] Pelargonium line pattern virus (PLPV) is one of the most frequent viral agents in geranium. It's an icosahedral virus, with a monopartite, positive-sense, single-stranded RNA genome, lacking a cap structure at the 5' end and poly(A) tail at its 3' end. Its genomic RNA (gRNA) contains five genes that encode two proteins involved in replication, two proteins involved in movement, (MP1 and MP2), and a coat protein (CP) that also acts as viral suppressor of RNA silencing. The first two genes are translated from the gRNA whereas the remaining three are translated from the single subgenomic RNA (sgRNA) that the virus produces during infection. The PLPV belongs to the family Tombusviridae and presents unique characteristics such as: i) production of a sole sgRNA that is structural and functionally tricistronic, ii) presence of a non-AUG start codon (CUG or GUG) initiating the MP2 ORF, iii) absence of AUG codons in any frame between the AUG initiation codons of MP1 and CP genes, and iv) sequence-based phylogenetic clustering of all encoded proteins in separate clades from those of other family members. In this doctoral thesis we have tried, on the one hand, to further study the regulation of PLPV gene expression and, on the other hand, to obtain information on degradation processes to which its genome is subjected, particularly on those related to the mechanism of RNA silencing. The first objective in this work was to determine the mechanism and the viral RNA elements involved in the generation of the sgRNA of PLPV. An RNA-RNA interaction involving distant segments of the gRNA of plus polarity has been identified. Such long-range interaction seems to act in cis and specifically mediates the production of the negative strand of the sgRNA, a type of molecule easily detectable in infected tissue. These results together with the possibility of uncoupling the synthesis of negative and positive strands of the sgRNA and with the observation of sequence similarity between the 5' ends of the gRNA and the sgRNA (with promoter function in their complementary strands), suggest that PLPV follows a model of premature termination for the formation of its unique sgRNA. The second objective of this work was to identify the elements of the viral genome that are involved in its translation through a cap-independent mechanism. Transfection of N. benthamiana protoplasts with PLPV-based reporter constructs has allowed us to corroborate the functionality of the CITE in the context of both the gRNA and the sgRNA. Additionally, it has been shown that this element establishes a long-distance RNA-RNA interaction with the 5'-region of the corresponding RNA which is essential for its activity. Moreover, data that support the relevance of the CITE during the infectious cycle of the virus have been obtained. Finally, in order to gain information on the role of PLPV as inducer and target of RNA silencing that the plant triggers as a defense against the virus, we have characterized the viral small RNAs (vsRNAs) present in PLPV-infected N. benthamiana plants. High-throughput sequencing, computational analysis and molecular hybridization assays have shown that: i) vsRNAs of the PLPV accumulate in extraordinarily high proportions in infected tissue, ii) 21 and 22 nt vsRNAs are the most frequent ones, iii) the vsRNAs of positive and negative polarities are in similar proportions, and, iv) there is variability in the vsRNAs 5'-proximal nucleotide. These results have provided clues on the viral molecules that must act as substrates for the formation of the vsRNAs and, also, about the components of the silencing machinery of the host that are likely involved in the response against the virus. / [ES] El virus del arabesco del Pelargonium (PLPV) es uno de los agentes virales más frecuentes en geranio. Se trata de un virus icosaédrico, con un genoma monopartito de RNA de simple cadena y de polaridad positiva que carece de estructura cap en su extremo 5' y de cola poli(A) en su extremo 3'. Su RNA genómico (gRNA) contiene 5 genes que codifican dos proteínas implicadas en replicación, dos proteínas implicadas en movimiento, (MP1 y MP2), y una proteína de cubierta (CP) que funciona además como supresor del silenciamiento por RNA. Las dos primeras se traducen a partir del gRNA y las tres restantes lo hacen a partir de un único RNA subgenómico (sgRNA) que el virus produce en el curso de la infección. El PLPV pertenece a la familia Tombusviridae y presenta características peculiares como son: a) la generación de un solo sgRNA estructural y funcionalmente tricistrónico, b) la presencia de un codón de iniciación no canónico (CUG o GUG) en el gen de la MP2, c) la ausencia de codones AUG en cualquier pauta de lectura entre los codones de inicio AUG de los genes MP1 y CP, y d) la agrupación filogenética en un clado separado de otros miembros de la familia Tombusviridae. En esta tesis se ha pretendido, por una parte, profundizar en el estudio de las estrategias de regulación de la expresión génica del PLPV y, por otra, recabar información sobre los procesos de degradación a los que se encuentra sometido su genoma, particularmente sobre aquellos relacionados con el mecanismo de silenciamiento por RNA. El primer objetivo abordado en este trabajo ha sido determinar el mecanismo y los elementos del RNA viral implicados en la generación del sgRNA del PLPV. Se ha identificado una interacción entre segmentos alejados del gRNA de polaridad positiva, que actúa en cis y que media la producción de la cadena negativa del sgRNA, un tipo de molécula fácilmente detectable en tejido infectado. Estos resultados junto con la posibilidad de desacoplar la síntesis de cadenas negativas y positivas del sgRNA y con la observación de similitud de secuencia entre el extremo 5' del gRNA y del sgRNA (con una función promotora en las cadenas complementarias), sugieren que el PLPV sigue un modelo de terminación prematura para la formación de su único sgRNA. El segundo objetivo de este trabajo ha sido identificar los elementos del genoma viral que están implicados en su traducción a través de un mecanismo independiente de cap. Mediante trasfección de protoplastos de N. benthamiana con construcciones delatoras, se ha corroborado la presencia de un estimulador traduccional (CITE) tanto en el contexto del gRNA como del sgRNA. Adicionalmente, se ha constatado que este elemento establece una interacción RNA-RNA a larga distancia con la región 5' del RNA correspondiente que es esencial para su actividad. Asimismo, se han obtenido datos que apoyan la relevancia del CITE durante el ciclo infeccioso del virus. Por último, para intentar recabar información sobre el papel del PLPV como inductor y diana de mecanismos de silenciamiento por RNA disparados por la planta como defensa frente al virus, se han caracterizado los pequeños RNAs virales (vsRNAs) presentes en plantas de N. benthamiana infectadas. Mediante secuenciación masiva, análisis computacionales e hibridación molecular, se ha podido determinar que: a) los vsRNAs del PLPV se acumulan en proporciones extraordinariamente elevadas en tejido infectado, b) los vsRNAs de 21 y 22 nt son los mayoritarios, c) los vsRNAs de polaridad positiva y negativa están en proporciones similares, y d) existe variabilidad en el nucleótido 5'-proximal de los vsRNAs. Estos resultados han permitido obtener pistas acerca de las moléculas virales que deben actuar cómo sustratos para la formación de los vsRNAs y, también, acerca de los componentes de la maquinaria de silenciamiento del huésped que deben participar en la respuesta del mismo frente al virus. / [CA] El virus de l'arabesc del Pelargonium (PLPV) és un dels agents virals més freqüents en gerani. Es tracta d'un virus icosaèdric, amb un genoma monopartit de RNA de simple cadena i de polaritat positiva que manca d'estructura cap en el seu extrem 5', i de cua poli(A) en el seu extrem 3'. La seua RNA genòmic (gRNA) conté 5 gens que codifiquen dues proteïnes implicades en replicació, dues proteïnes implicades en moviment, (MP1 i MP2), i una proteïna de coberta (CP) que funciona a més com supresor del silenciamiento per RNA. Les dues primeres es tradueixen a partir del gRNA i les tres restants ho fan a partir d'un únic RNA subgenómico (sgRNA) que el virus produeix en el curs de la infecció. El PLPV pertany a la família Tombusviridae, i presenta característiques peculiars com són: a) la generació d'un sol sgRNA estructural i funcionalment tricistrònic, b) la presència d'un codó d'iniciació no canònic (CUG o GUG) en el gen de la MP2, c) l'absència de codons AUG en qualsevol pauta de lectura entre els codons d'inici AUG dels gens MP1 i CP, i d) l'agrupació filogenètica en un clade separat d'altres membres de la família Tombusviridae. En aquesta tesi s'ha pretès, d'una banda, aprofundir en l'estudi de les estratègies de regulació de l'expressió gènica del PLPV i, per una altra, recopilar informació sobre els processos de degradació als quals es troba sotmès el seu genoma, particularment sobre aquells relacionats amb el mecanisme de silenciament per RNA. El primer objectiu abordat en aquest treball ha sigut determinar el mecanisme i els elements del RNA viral implicats en la generació del sgRNA del PLPV. S'ha identificat una interacció entre segments allunyats del gRNA de polaritat positiva, que actua en cis i que intervé en la producció de la cadena negativa del sgRNA, un tipus de molècula fàcilment detectable en teixit infectat. Aquests resultats juntament amb la possibilitat de desacoblar la síntesi de cadenes negatives i positives del sgRNA i amb l'observació de similitud de seqüència entre l'extrem 5' del gRNA i del sgRNA (amb una funció promotora en les cadenes complementàries), suggereixen que el PLPV segueix un model de terminació prematura per a la formació del seu únic sgRNA. El segon objectiu d'aquest treball ha sigut identificar els elements del genoma viral que estan implicats en la seua traducció a través d'un mecanisme independent de cap. Mitjançant trasfección de protoplastos de N. benthamiana amb construccions delatores, s'ha corroborat la presència d'un estimulador traduccional (CITE) tant en el context del gRNA com del sgRNA. Addicionalment, s'ha constatat que aquest element estableix una interacció RNA-RNA a llarga distància amb la regió 5' del RNA corresponent que és essencial per a la seua activitat. Així mateix, s'han obtingut dades que recolzen la rellevància del CITE durant el cicle infecciós del virus. Finalment, per intentar recopilar informació sobre el paper del PLPV com inductor i diana de mecanismes de silenciament per RNA disparats per la planta com a defensa davant del virus, s'han caracteritzat els xicotets RNAs virals (vsRNAs) presents en plantes de N. benthamiana infectades. Mitjançant seqüenciació massiva, anàlisis computacionals i hibridació molecular, s'ha pogut determinar que: a) els vsRNAs del PLPV s'acumulen en proporcions extraordinàriament elevades en teixit infectat, b) els vsRNAs de 21 i 22 nt són els majoritaris, c) els vsRNAs de polaritat positiva i negativa estan en proporcions similars, i d) existeix variabilitat en el nucleòtid 5'-proximal dels vsRNAs. Aquests resultats han permès obtenir pistes sobre les molècules virals que han d'actuar com substrats per a la formació dels vsRNAs i, també, sobre els components de la maquinària de silenciament de l'hoste que han de participar en la resposta del mateix enfront del virus. / Blanco Pérez, M. (2016). Análisis de procesos de transcripción, traducción y degradación del virus del arabesco del Pelargonium [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/63452 / Compendio

Tesis por compendio / [ES] En plantas, el silenciamiento por RNA constituye un potente mecanismo de defensa frente a virus. Los RNA virales de doble cadena activan este tipo de procesos y son digeridos por las enzimas DCL (Dicer-like), cuya acción genera pequeños RNA (sRNA) de entre 20 y 24 nt. Estos sRNA promueven la degradación de RNA de secuencia complementaria a través de un complejo multiproteico conocido como RISC (RNA-induced silencing complex), cuya molécula efectora es una proteína Argonauta (AGO). Con el fin de evadir esta barrera defensiva del huésped, la mayoría de los virus de plantas codifican supresores del silenciamiento por RNA (VSR), cuyos mecanismos de acción son diversos y en muchos casos no se comprenden del todo. Aunque todas las etapas de la ruta de silenciamiento pueden ser inhibidas por los VSR, los sRNA y las proteínas AGO parecen ser las dianas más frecuentes. Se ha postulado que motivos GW/WG podrían ser fundamentales para la actividad de algunos VSR, al intervenir en la interacción con proteínas AGO. En este trabajo se ha pretendido seguir profundizando en el estudio de la respuesta antiviral en plantas y de los mecanismos de acción de los supresores de silenciamiento. El primer objetivo abordado ha sido identificar el VSR codificado por el virus del arabesco del Pelargonium (Pelargonium line pattern virus, PLPV), un miembro del género Pelarspovirus dentro de la amplia familia Tombusviridae. Los resultados han mostrado que la proteína de cubierta del virus (p37) es capaz de inhibir de manera eficiente el silenciamiento inducido por RNA. La generación de un batería de variantes capaces e incapaces de actuar como VSR y/o de empaquetar el RNA viral mediante mutagénesis dirigida de distintos motivos de la proteína, incluido un motivo GW que está conservado en ortólogos, nos han permitido conocer que: (i) tanto la función de supresión del silenciamiento como la función de encapsidación son esenciales para que el PLPV alcance una infección sistémica y (ii) p37, a pesar de contener un motivo GW funcional e interaccionar con distintas AGO, emplea el secuestro de sRNA como estrategia principal para inhibir el silenciamiento. A pesar de que ambas funciones conocidas de p37 deben ser llevadas a cabo esencialmente en el citoplasma, esta proteína se localiza en citoplasma y núcleo, con gran acumulación en nucleolo, por lo que nos planteamos como segundo objetivo en este trabajo profundizar acerca de la localización nucleolar de p37. Además de mapear la región de la proteína que contiene la señal de localización nucleolar (NoLS) en los primeros 45 aminoácidos de la molécula, también hemos observado que p37 interacciona con diferentes miembros de la familia de las importinas ¿, adaptadores moleculares del transporte nucleocitoplasmático, y que esta interacción es esencial para la localización nucleolar de la proteína. Adicionalmente, la anulación de la localización nucleolar de p37 mediante el silenciamiento de importinas ¿ ha correlacionado con una disminución de acumulación del virus, lo que sugiere que dicha localización es ventajosa para la infección viral. Por último, para intentar conocer más datos acerca de las actividades de la ruta de silenciamiento que están implicados en la defensa frente al PLPV, analizamos la infección viral en líneas transgénicas de N. benthamiana con la expresión o actividad distintos componentes de la ruta comprometida. Los resultados han mostrado que DCL4 y, en menor medida, DCL2 afectan a la infección viral y que ambas tienen un efecto aditivo, tal y como se ha descrito en diversas interacciones virus-planta. Adicionalmente, AGO2 se ha revelado como un factor clave en la respuesta frente al PLPV, ampliando el número de virus que están afectados por esta endonucleasa particular. En conjunto, los resultados obtenidos muestran que tanto el procesamiento de dsRNA mediado por enzimas DCL como el corte de RNA mediado AGO, contribuyen a la defen / [CA] En plantes, el silenciament per RNA constitueixen un potent mecanisme de defensa davant virus. Els RNA virals de doble cadena activen aquest tipus de processos, i són digerits per els enzims DCL (Dicer-like), donant lloc a xicotets RNA (sRNA) d'entre 20 i 24 nt. Estos sRNA promouen la degradació de RNA de seqüència complementària a través d'un complex multiproteic conegut com RISC (RNA-induced silencing complex), la molècula efectora del qual és una proteïna Argonauta (AGO). Per tal d'evadir aquesta barrera defensiva de l'hoste, la majoria dels virus de plantes codifiquen supressors del silenciament per RNA (VSR), els mecanismes d'acció dels quals són diversos i en molts casos no es comprenen del tot. Encara que totes les etapes de la ruta poden ser inhibides, els sRNA i les proteïnes AGO semblen ser les dianes més freqüents. S'ha postulat que els motius GW/WG podrien ser fonamentals per a l'activitat d'alguns VSR, en intervindre en la interacció amb proteïnes AGO. En aquest treball s'ha pretés continuar aprofundint en l'estudi de la resposta antiviral en plantes i dels mecanismes d'acció dels supressors de silenciament. El primer objectiu abordat ha sigut identificar l'VSR codificat pel virus de l'arabesc del Pelargonium (Pelargonium line pattern virus, PLPV), un membre del gènere Pelarspovirus dins de l'amplia família Tombusviridae. Els resultats han mostrat que la proteïna de coberta del virus (p37) és capaç d'inhibir de manera eficient el silenciament induït per RNA. La generació d'una bateria de variants capaces i incapaces d'actuar com VSR i/o d'empaquetar l'RNA viral mitjançant la mutagènesi dirigida de diferents motius de la proteïna, inclòs un motiu GW que està conservat en ortòlegs, ens ha permés conèixer que: (i) tant la funció de supressió del silenciament com la funció d'encapsidació són essencials per a que el PLPV aconseguisca una infecció sistèmica i (ii) p37, malgrat contindre un motiu GW funcional i interaccionar amb diferents AGO, empra el segrest de sRNA com a estratègia principal per a inhibir el silenciament. Malgrat que ambdues funcions conegudes de p37 han de ser dutes a terme essencialment en el citoplasma, esta proteïna localitza en citoplasma i nucli, amb gran acumulació en nuclèol, per la qual cosa ens hem plantejat com a segon objectiu en este treball aprofundir sobre la localització nucleolar de p37. Ademés de mapejar la senyal de localització nucleolar (NoLS) en els primers 45 aminoàcids de la molècula, també hem observat que p37 interacciona amb diferents membres de la família de les importines ¿, i que aquesta interacció és essencial per a la localització nucleolar de la proteïna. A més, l'anul¿lació de la localització nucleolar de p37 mitjançant el silenciament d'importines ¿ s'ha correlacionat amb una disminució d'acumulació del virus, la qual cosa suggereix que aquesta localització és avantatjosa per a la infecció viral. Finalment, per a intentar conéixer més dades sobre les activitats de la ruta de silenciament que estan implicats en la defensa front al PLPV, hem analitzat la infecció viral en línies transgèniques de N. benthamiana amb l'expressió o activitat diferents components de la ruta compromesa. Els resultats han mostrat que DCL4 i, en menor mesura, DCL2 afecten la infecció viral i que ambdues tenen un efecte additiu, tal com s'ha descrit en diverses interacciones virus-planta. Addicionalment, AGO2 s'ha revelat com un factor clau en la resposta front al PLPV, ampliant el nombre de virus que estan afectats per aquesta endonucleasa particular. En conjunt, els resultats obtinguts mostren que tant el processament de dsRNA mediat per enzims DCL com el tall d'RNA mediat AGO, contribueixen a la defensa de N. benthamiana front al PLPV. / [EN] n plants, RNA silencing functions as a potent antiviral mechanism. Viral-derived double-stranded RNAs trigger this type of processes, being digested by DCL (Dicer-like) enzymes into virus-derived small RNAs (vsRNAs) of 20-24 nt. These vsRNAs guide sequence-specific RNA degradation upon their incorporation into an RNA-induced silencing complex (RISC) that contains a slicer of the Argonaute (AGO) family. To counteract this host defence response, most plant viruses encode suppressors of RNA silencing (VSRs), whose mechanisms of action are diverse and often not well understood. Though virtually all stages of the antiviral silencing pathway can be blocked by VSRs, sRNAs and AGO proteins seem to be the most common targets. It has been postulated that GW/WG motifs could be fundamental for the activity of some VSRs by directing interaction with AGOs. In this work, we have pursued to get further insights into the antiviral silencing in plants and the mechanisms of action of silencing suppressors. The first objective has been to identify the VSR encoded by Pelargonium line pattern virus (PLPV), a member of the genus Pelarspovirus within family Tombusviridae. The results have shown that the viral coat protein (p37) is able to efficiently inhibit RNA silencing. Generation of suppressor-competent and incompetent molecules and uncoupling of the RSS and particle assembly capacities through site-directed mutagenesis of some p37 sequence traits, including a conserved GW motif, allowed us to know that: (i) the silencing suppression and encapsidation functions of p37 are both required for systemic PLPV infection and, (ii) p37, even though it has a functional GW motif and interacts with different AGOs, inhibits silencing most likely through vsRNA sequestration. Despite both p37 functions have to be executed essentially in the cytoplasm, this protein localizes in cytoplasm and nucleus, with high accumulation at the nucleolus, so the second objective of this work has been to gain further insights into the nucleolar localization of p37. Besides mapping the protein region containing the nucleolar localization signal (NoLS) in the first 45 amino acids of the molecule, we have found that p37 interacts with distinct members of the importin ¿ family, main cellular transporters for nucleo-cytoplasmic traffic of proteins, and that these interactions are crucial for nucleolar targeting of p37. In addition, impairment of p37 nucleolar localization through down-regulation of importin ¿ expression has been correlated with a reduction of viral accumulation, suggesting that sorting of the protein to the major subnuclear compartment is advantageous for the infection process. Finally, in order to obtain information on which activities of RNA silencing pathway are involved in the defense against PLPV, we analyzed the viral infection in N. benthamiana transgenic lines with the functions of distinct components of the pathway impaired. Results have shown that DCL4 and, to lesser extent, DCL2 contribute to restrict viral infection and that they have additive effects, in agreement with that observed in other plant-virus interactions. Additionally, AGO2 was found to be a key factor in the defense against PLPV, extending the number of viruses that are affected by this particular slicer. Altogether, the results supported that both dicing and slicing activities participate in the defense of N. benthamiana against PLPV. / Pérez Cañamás, M. (2019). Análisis de la interacción del virus del arabesco del Pelargonium con la ruta de silenciamiento por RNA del huésped [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/122297 / Compendio