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A study of the CDGSH protein family: biophysical and bioinformatic analysis of the [2FE-2S] cluster protein mitoneetBak, Daniel 18 March 2016 (has links)
Iron-sulfur clusters, an important class of redox active cofactors, are ligated by protein-based Cys ligands in a variety of nuclearities. Traditionally, these clusters serve as one-electron transfer units, though many clusters are capable of catalytic activity and sensing functions. Recently, a greater number of iron-sulfur clusters with non-Cys ligation have been identified, wherein one or more of the Cys ligands are replaced by an alternative amino acid residue such as His or Asp. In most cases the role of this ligand substitution is unknown. Some hypotheses are that non-Cys ligation may modify reduction potential, allow for proton-coupled electron transfer, or modulate cluster stability. The human mitoNEET protein contains a 1-His, 3-Cys ligated [2Fe-2S] cluster, identified by the presence of a CDGSH peptide motif. MitoNEET is a binding target for the type II-diabetes drug, pioglitazone, and is implicated in controlling mitochondrial iron levels. How exactly mitoNEET functions in the cell is unknown, as is the role its uniquely ligated FeS cluster may play. This thesis uses mitoNEET as a model for the study of non-Cys ligated FeS clusters and their biological function. Protein film voltammetry was used to examine the pH-dependent electrochemical properties of the mitoNEET cluster, indicating that multiple as yet unidentified protonations control redox potential and that drug binding impacts cluster reduction and protonation. Additionally, the effect of reduction and protonation on cluster and protein structure instability was examined through absorbance and circular dichroism measurements, suggesting an important role for cluster lability in protein function. The CDGSH-motif family of [2Fe-2S] cluster-binding proteins was examined using protein similarity networks. This technique highlights the evolutionary relationship among these proteins, and has led to further work examining the DUF1271 domain containing proteins E. coli YjdI and A. vinosum Alvin0680 (a CDGSH-DUF1271 fusion). This work furthers the scientific knowledge of non-Cys ligated Fe-S clusters by improving our understanding of how the mitoNEET His-ligand contributes to proton-coupled electron transfer and cluster instability, and how the broader class of CDGSH-motif proteins is organized.
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MICROBIAL GLYCOSIDE HYDROLASE MEDIATED MODIFICATION OF HOST CELL SURFACE GLYCANSPasupathi, Aarthi January 2023 (has links)
All cells and extracellular matrices of prokaryotes and eukaryotes are made up of glycans, the carbohydrate macromolecules that play a predominant role in cell-to-cell interaction, protection, stabilization, and barrier functions. Glycans are also central to human microbiome-host interactions where bacterial glycans are recognized by innate immune signaling pathways, and host mucins are a major nutrient source for various gut bacteria. Many microorganisms encode glycoside hydrolases (GHs) to utilize the available host cell surface glycans as a nutrient source and to modulate host protein function. The GHs are divided into families having conserved linkage specificity within each family and individual family members can be specific for dramatically divergent macromolecular substrates. In general, within a given GH family very few members have been biochemically characterized and the substrate specificity is poorly understood. GH genes are abundant in the human gut microbiome and culture-enriched metagenomics identified more than 10,000 distinct bacterial GH genes in an individual. The focus of this thesis is endo-β-N-acetylglucosaminidases (ENGases) encoded by GH18 and GH85 families. Bioinformatic analysis shows that the predicted proteins within each of these GH families fell into separate clusters in the Sequence Similarity Networks of each family. The hypothesis of this project is that human microbiome-encoded ENGases from the same GH family differ in their substrate specificities and within the SSN network of the same GH family, enzymes with similar substrate specificity may fall in the same cluster. In this work, I established conditions for overexpression of GH18 and GH85 proteins and investigated the activity of these enzymes on various substrates. / Thesis / Master of Science (MSc) / All the cell surfaces of animals, plants, and microbes are coated with sugars, also known as glycans. These sugars on the cell surface act as a barrier and protect them from the external environment. Glycans on the cells of both microbes and humans are essential for basic interactions between them. Many bacteria produce enzymes such as glycoside hydrolases to obtain nutrients from dietary sugars and alter the sugars on host proteins. There are various families of these enzymes, and they act on specific sugars and cleavage sites. The substrate specificities and characterization of these enzymes from most bacteria found in the human microbiome have not been studied in detail. My work focuses on developing standard enzyme assays for determining specific substrate specificities. This tool can be used to reshape glycans and understand their role in cell processes.
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Decomposition by complete minimum separators and applications / Décomposition par séparateurs minimaux complets et applicationsPogorelcnik, Romain 04 December 2012 (has links)
Nous avons utilisé la décomposition par séparateurs minimaux complets. Pour décomposer un graphe G, il est nécessaire de trouver les séparateurs minimaux dans le graphe triangulé H correspondant. Dans ce contexte, nos premiers efforts se sont tournés vers la détection de séparateurs minimaux dans un graphe triangulé. Nous avons défini une structure, que nous avons nommée 'atom tree'. Cette dernière est inspirée du 'clique tree' et permet d'obtenir et de représenter les atomes qui sont les produits de la décomposition. Lors de la manipulation de données à l'aide de treillis de Galois, nous avons remarqué que la décomposition par séparateurs minimaux permettait une approche de type `Diviser pour régner' pour les treillis de Galois. La détection des gènes fusionnés, qui est une étape importante pour la compréhension de l'évolution des espèces, nous a permis d'appliquer nos algorithmes de détection de séparateurs minimaux complets, qui nous a permis de détecter et regrouper de manière efficace les gènes fusionnés. Une autre application biologique fut la détection de familles de gènes d'intérêts à partir de données de niveaux d'expression de gènes. La structure de `l'atom tree' nous a permis d'avoir un bon outils de visualisation et de gérer des volumes de données importantes. / We worked on clique minimal separator decomposition. In order to compute this decomposition on a graph G we need to compute the minimal separators of its triangulation H. In this context, the first efforts were on finding a clique minimal separators in a chordal graph. We defined a structure called atom tree inspired from the clique tree to compute and represent the final products of the decomposition, called atoms. The purpose of this thesis was to apply this technique on biological data. While we were manipulating this data using Galois lattices, we noticed that the clique minimal separator decomposition allows a divide and conquer approach on Galois lattices. One biological application of this thesis was the detection of fused genes which are important evolutionary events. Using algorithms we produced in the course of along our work we implemented a program called MosaicFinder that allows an efficient detection of this fusion event and their pooling. Another biological application was the extraction of genes of interest using expression level data. The atom tree structure allowed us to have a good visualization of the data and to be able to compute large datasets.
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La génomique évolutive mitochondriale révèle des échanges génétiques et la ségrégation chez les GloméromycètesBeaudet, Denis 06 1900 (has links)
Les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) sont des organismes microscopiques du sol qui jouent un rôle crucial dans les écosystèmes naturels et que l’on retrouve dans tous les habitats de la planète. Ils vivent en relation symbiotique avec la vaste majorité des plantes terrestres. Ils sont des biotrophes obligatoires, c'est-à-dire qu'ils ne peuvent croître qu'en présence d'une plante hôte. Cette symbiose permet entre autres à la plante d'acquérir des nutriments supplémentaires, en particulier du phosphore et du nitrate. Malgré le fait que cette symbiose apporte des services importants aux écosystèmes, la richesse des espèces, la structure des communautés, ainsi que la diversité fonctionnelle des CMA sont mal connues et l'approfondissement des connaissances dans ces domaines dépend d’outils de diagnostic moléculaire. Cependant, la présence de polymorphisme nucléaire intra-isolat combiné à un manque de données génomiques dans différents groupes phylogénétique de ces champignons complique le développement de marqueurs moléculaires et la détermination de l'affiliation évolutive à hauts niveaux de résolution (c.a.d. entre espèces génétiquement similaires et/ou isolats de la même espèce).
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Pour ces raisons, il semble une bonne alternative d’utiliser un système génétique différent en ciblant le génome mitochondrial, qui a été démontré homogène au sein d'un même isolat de CMA. Cependant, étant donné le mode de vie particulier de ces organismes, une meilleure compréhension des processus évolutifs mitochondriaux est nécessaire afin de valoriser l'utilisation de tels marqueurs dans des études de diversité et en génétique des populations. En ce sens, mon projet de doctorat consistait à investiguerétudier: i) les vecteurs de divergences inter-isolats et -espèces génétiquement rapprochéesphylogénétiquement apparentées, ii) la plasticité des génomes mitochondriaux, iii) l'héritabilité mitochondriale et les mécanismes potentiels de ségrégation, ainsi que iv) la diversité mitochondriale intra-isolat in situ.
À l'aide de la génomique mitochondriale comparative, en utilisant le séquençage nouvelle génération, on a démontré la présence de variation génétique substantielle inter-isolats et -espèces, engendrées par l'invasion d'éléments mobiles dans les génomes mitochondriaux des CMA, donnant lieu à une évolution moléculaire rapide des régions intergéniques. Cette variation permettait de développer des marqueurs spécifiques à des isolats de la même espèce. Ensuite, à l'aide d'une approche analytique par réseaux de gènes sur des éléments mobiles, on a été en mesure de démontrer des évènements de recombinaisons homologues entre des haplotypes mitochondriaux distincts, menant à des réarrangements génomiques. Cela a permis d'ouvrir les perspectives sur la dynamique mitochondriale et l'hétéroplasmie dans un même isolatsuggère une coexistence de différents haplotypes mitochondriaux dans les populations naturelles et que les cultures monosporales pourraient induirent une sous-estimation de la diversité allélique mitochondriale. Cette apparente contradiction avec l'homogénéité mitochondriale intra-isolat généralement observée, a amené à investiguer étudier les échanges génétiques à l'aide de croisements d'isolats génétiquement distincts. Malgré l'observation de quelques spores filles hétéroplasmiques, l'homoplasmie était le statut par défaut dans toutes les cultures monosporales, avec un biais en faveur de l'un des haplotypes parentaux. Ces résultats suggèrent que la ségrégation opère durant la formation de la spore et/ou le développement de la coloniedu mycélium. De plus, ils supportent la présence d'une machinerie protéique de ségrégation mitochondriale chez les CMAAMF, où l'ensemble des gènes impliqués dans ce mécanisme ont été retrouvé et sont orthologues aux autres champignons. Finalement, on est revenue aux sources avecon a étudié le polymorphisme mitochondrial intra-isolat à l'aide d'une approche conventionnelle de PCR en utilisant une Taq polymérase de haute fidélité, suivie de clonage et de séquençage Sanger, sur deux isolats de R. irregularis. Cela a permis l'observation d'hétéroplasmie in situ, ainsi que la co-expression de variantes de variantes de protéines'ARNm dans une souche in vitro. Les résultats suggèrent que d'autres études basées sur le séquençage nouvelle génération aurait potentiellement ignorée cette variation, offrant ainsi plusieurs nouveaux arguments permettant de considérer les CMA comme des organismes possédant une population de génomes mitochondriaux et nucléaires distincts. / The association between arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and plant roots is one of the most widespread symbioses involving plants, and thus has an important role in terrestrial ecosystems. In exchange for carbohydrates, AMF improve plant fitness by enhancing mineral nutrient uptake, especially in particular phosphate and nitrate. Although this symbiosisDespite the fact that these symbioses contribute provides to important services toin ecosystems, the species richness, community structure and functional diversity of AMF is not well understood due to a lack of reliable molecular tools. The intra-isolate genetic polymorphism of nuclear DNA observed in AMF, combined with a lack of genomic data in a broad range of phylogenetic groups, has made it difficult to develop molecular markers and to determine evolutionary relatedness at high levels of resolution (i.e. between genetically-similar species and/or isolates).
For these reasons, it seems a good alternative to use a different genetic system by targeting the mitochondrial genome, which have been shown to be homogeneous within AMF isolates. However, given the peculiar lifestyle of these organisms, a better understanding of the mitochondrial evolutionary processes and dynamics were is necessary in order to validate the usefulness of such markers in diversity and population genetics studies. In that regard, the objectives of my PhD project were to investigate: i) the divergence between closely related species and isolates, ii) mitochondrial genomes plasticity, iii) mitochondrial heritability and potential segregation mechanisms and iv) in situ mitochondrial intra-isolate allelic diversity.
With Using comparative mitochondrial genomics using and next generation sequencing (NGS) sequencing, we found substantial sequence variation in intergenic regions caused by the invasion of mobile genetic elements. This variation gives risecontributes to rapid mitochondrial genome evolution among closely related isolates and species, which makes it possible to design reliable intra- and inter-specific markers. Also, an extensive gene similarity network-based approach allowed us to provide strong evidence of inter-haplotype recombination in AMF, leading to a reshuffled mitochondrial genome. These findings suggest the coexistence of distinct mtDNA haplotypes in natural populations and raise questions as to whether AMF single spore cultivations artificially underestimates mitochondrial genetic diversity in natural population.. This apparent contradiction with the intra-isolate mtDNA homogeneity usually observed in these fungi, led to the investigation of mitochondrial heritability in the spore progeny resulting from crossed-cultures. Although an heteroplasmic state was observed in some daughter spores, we found that homoplasmy was the dominant state in all monosporal cultures, with an apparent bias towards one of the parental haplotypes. These results strongly support the presence of a putative mitochondrial segregation proteic machinery in AMF, whose complete set of genes were orthologous with those found in other fungi. Our findings suggest that segregation takes place either during spore formation or colony mycelium development. Finally, we performed a conventional PCR based approach with a high fidelity Taq polymerase, followed by downstream cloning and Sanger sequencing using the model organism Rhizophagus irregularis. We found in situ heteroplasmy along with substantial intra-isolate allelic variation within the mtDNA that persists in the transcriptome. Our study also suggest that genetic variation in Glomeromycota is higher than meets the eye and might be critically underestimated in most NGS based-AMF studies both in nuclei and mitochondria.
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