A insuficiência cardíaca é uma síndrome clínica com débito cardíaco insuficiente, que configura uma das principais causas de morbidade e mortalidade. O sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) tem um papel importante na fisiopatologia da IC, e sua estimulação crônica afeta negativamente o coração por meio da vasoconstrição, retenção de água e sódio, remodelamento cardíaco e fibrose miocárdica. A angiotensina II é um componente ativo do SRAA e sua ação é relevante para a função e estrutura cardiovascular, sendo mediada pelo receptor AT1R. O AT1R é um receptor acoplado à proteína G que medeia a maior parte das ações biológicas do SRAA, no qual a ativação desse receptor capta sinais extracelulares e ativa as vias de transdução de sinal no interior da célula. O AT1R é expresso na maioria dos tecidos e sua ativação pode ocasionar vasoconstrição, retenção de água e a proliferação das células do músculo liso, assim como hipertrofia cardíaca. Estudos realizados em pacientes com IC para avaliar a associação do polimorfismo 1166A>C (rs5186) no gene do receptor tipo 1 da angiotensina II (AGTR1) na insuficiência cardíaca obtiveram resultados conflitantes. Dessa forma, o presente estudo avaliou o polimorfismo 1166A>C no gene do AGTR1 na suscetibilidade e progressão da insuficiência cardíaca em uma coorte de 312 pacientes com IC e em uma amostra de 153 indivíduos da população em geral (doadores de banco de sangue). Os desfechos analisados foram o número de hospitalizações decorrentes da IC e morte por todas as causas. O polimorfismo foi determinado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. As frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo 1166A>C nos pacientes com IC foram semelhantes àquelas dos doadores de banco de sangue. Quanto à progressão da IC, não se observou qualquer diferença estatisticamente significativa na incidência da mortalidade por todas as causas entre os portadores de diferentes genótipos do polimorfismo 1166A>C. Não houve diferença estatisticamente significativa também quanto ao número de hospitalizações nos diferentes genótipos. Assim sendo, os dados obtidos no presente estudo sugerem que o polimorfismo 1166A>C no gene AGTR1 não está associado com a IC ou com a sua progressão.

Resultados controversos têm sido obtidos em estudos experimentais e clínicos com a infusão de insulina e glicose na lesão isquemia-reperfusão, havendo muito á ser esclarecido sobre os mecanismos deste tratamento. No coração, a insulina tem efeitos sobre a utilização dos substratos, fluxo coronariano, atua como antiinflamatório e, propõem-se efeitos diretos na sobrevivência celular; estes efeitos devem-se a ativação da via fosfatidilinositol 3-cinase (PI3k)-Akt. As interações intracelulares entre os sistemas de sinalização da insulina e da angiotensina-II são muitas, salientando-se a possível importância do cross-talk angiotensina-II/insulina. Apesar da popularidade das preparações em corações isolados no estudo das lesões isquemia-reperfusão, diversos protocolos vêm sendo utilizados quanto a duração da isquemia, dificultanto a escolha do melhor período de isquemia para se testar os efeitos de fármacos sobre a recuperação da função cardíaca. Nesse trabalho objetivamos: determinar o melhor tempo de isquemia para investigar a recuperação funcional e a capacidade de resposta do sistema reninaangiotensina (SRA) tecidual em coração isolado e os efeitos da insulina associada a um inibidor do SRA sobre os mecanismos de cardioproteção à lesão isquemia-reperfusão. No estudo 1 investigamos a recuperação funcional e a capacidade de resposta do SRA tecidual em corações isolados e submetidos a diferentes períodos de isquemia. Os corações foram submetidos a diferentes períodos de isquemia global (20, 25 ou 30 min) e reperfundidos (30 min) com diferentes soluções: Krebs-Henseleit (KH) (grupo KH), KH + angiotensina-I (grupo Angio) ou KH + angiotensina-I + captopril (grupo AC). O índice de contratilidade ventricular (dP/dtmax) e o duplo produto foram reduzidos nos corações expostos à 25 min (~73%) e 30 min de isquemia (~80%) vs 20 min de isquemia. A pressão ventricular diastólica (PVD) e a pressão de perfusão (PP) aumentaram nos corações expostos à 25 min (5,5 e 1,08 vezes, respectivamente) e 30 min de isquemia (6 e 1,10 vezes, respectivamente) vs 20 min de isquemia. A angiotensina-I causou uma diminuição no dP/dtmax e no duplo produto (~85-94%) em todos os períodos isquêmicos, e um aumento na PVD e na PP (6,9 e 1,25 vezes, respectivamente) apenas aos 20 min isquemia. O captopril reverteu parcialmente ou totalmente os efeitos da angiotensina-I sobre a recuperação funcional, somente nos períodos 20 e 25 min de isquemia. Esses dados sugerem que a transição de dano pós-isquêmico leve/moderado para severo ocorre após 20 min de isquemia. Dessa forma, 20 min de isquemia é o melhor período de tempo para se estudar os efeitos de abordagens farmacológicas sobre a recuperação funcional. No estudo 2 investigamos os efeitos da insulina associada a um inibidor do SRA sobre os mecanismos de cardioproteção à lesão isquemia-reperfusão. Os corações foram submetidos a um período de isquemia global (20 min) e reperfundidos (30 min) com diferentes soluções: KH (grupo KH), KH + angiotensina-I (grupo Angio), KH + angiotensina-I + captopril (grupo AC), KH + insulina (grupo Insulina), KH + insulina + angiotensina-I (grupo IA) e KH + insulina + angiotensina-I + captopril (grupo IAC). Durante a recuperação, o grupo Angio apresentou uma redução de ~24% na pressão ventricular desenvolvida (PVDes) e de ~29% no dP/dtmáx vs período basal, e apresentou um aumento de ~2,7 vezes na PVD vs período basal, estes efeitos foram revertidos parcialmente ou totalmente pelos tratamentos AC, IA e IAC. O grupo Angio apresentou uma redução de ~24% no duplo produto vs período basal, este efeito foi revertido pelo tratamento IA, que também foi maior vs grupos KH e AC. Os grupos Angio e IA apresentaram um aumento de ~20% na PP vs período basal, e todos os grupos (exceto o insulina) foram maiores vs grupo KH; os grupos AC e IAC não diferiram dos grupos Angio e insulina. A Akt fosforilada foi maior nos grupos insulina e IA vs grupos KH (~47% e ~42%, respectivamente) e Angio (~60% e ~55%, respectivamente), os grupos AC e IAC não diferem dos demais. A AMPK fosforilada foi ~31% maior nos grupos insulina, IA e IAC vs grupos KH, Angio e AC. Os níveis de TBA-RS no grupo KH foram ~73% maior vs outros grupos; a quimiluminescência também foi maior (~2,2 vezes) no grupo KH vs outros grupos, e o grupo IA foi ~35% menor vs grupo Angio. A atividade da SOD não foi alterada pelos tratamentos, mas a atividade da catalase foi ~28% maior no grupo KH vs outros grupos (exceto o IA, P = 0,058) e a atividade da GST foi menor no grupo insulina vs grupos Angio e AC (~45% e ~50%, respectivamente). Os grupos Angio, AC e IAC apresentaram uma menor concentração da Cu/ZnSOD vs grupo KH (~40%, ~43% e ~27%, respectivamente), os grupos insulina e IA não diferem do grupo KH. Nenhum dos tratamentos alterou a concentração das enzimas GST e eNOS, os níveis de NOX ou a translocação do GLUT-4. Assim, a insulina ativa a via PI3k-Akt e parece exercer uma melhor regulação do estado redox celular, podendo ainda ativar a AMPK e ambas atuarem sinergicamente para um melhor perfil metabólico do miocárdio. Desse modo, a insulina administrada no inicio da reperfusão opõe-se aos efeitos deletérios da angiotensina-II e exerce um efeito cardioprotetor.

As plaquetas sangüíneas são fragmentos citoplasmáticos, oriundos da ruptura dos megacariócitos, cuja principal função está relacionada à manutenção da integridade vascular. Os nucleotídeos extracelulares, ATP e ADP, bem como a adenosina, têm sido implicados em um grande número de funções fisiológicas: o ADP é o principal fator recrutador de plaquetas, enquanto que o ATP é um inibidor competitivo da agregação induzida por ADP. A adenosina é uma molécula capaz de induzir vasodilatação e inibir a agregação plaquetária. Desta maneira, a manutenção da sinalização purinérgica normal tem se mostrado importante para o tratamento de doenças cardiovasculares. Os nucleosídeos di e trifosfatos circulantes podem ser hidrolisados por membros de várias famílias de ectonucleotidases de membrana e solúveis, incluindo as ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases) e ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPPs), que em conjunto com a ecto-5’-nucleotidase, levam à formação de adenosina. Na superfície das plaquetas, ambas enzimas, E-NTPDase e ecto-5’-nucleotidase, estão descritas. O sistema renina-angiotensina é o principal regulador da função renal e cardiovascular, desenvolvendo um papel fundamental na homeostasia da pressão arterial e do balanço eletrolítico. A angiotensina II (ANGII) induz fisiologicamente a ativação das plaquetas, possivelmente devido às suas propriedades vasoconstritoras. Os objetivos deste trabalho foram, portanto: 1) caracterizar cineticamente a enzima E-NPP em plaquetas de ratos, utilizando o substrato marcador p-Nph-5’TMP e 2) esclarecer, mesmo que em parte, os possíveis efeitos da ANGII sobre a hidrólise extracelular de nucleotídeos por plaquetas de ratos. No primeiro capítulo deste trabalho, descrevemos uma atividade enzimática em plaquetas de ratos que compartilha as principais características bioquímicas já descritas para as E-NPPs: pH ótimo alcalino; valores de KM e Vmax calculados de aproximadamente 106.22 ± 17.83 μM e 3.44 ± 0.18 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectivamente; e dependência de cátions divalentes. Além disso, o AMP inibiu somente a hidrólise do p-Nph-5’TMP. Por outro lado, a azida de sódio, em altas concentrações, a angiotensina II e o cloreto de gadolínio alteraram apenas as hidrólises de ATP ou ADP ou de ambos. No segundo capítulo, mostramos que a ANGII foi capaz de aumentar as hidrólises de ATP, ADP e AMP em plaquetas em todas as doses testadas (5, 50, 500 e 5000 picomóis). Entretanto, nenhuma alteração foi observada com relação à hidrólise do p-Nph-5'TMP. Em adição, observamos um aumento na hidrólise de AMP e uma diminuição na hidrólise de p-Nph-5'TMP em plaquetas de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) quando comparados a ratos Wistar normotensos. De maneira geral, esta dissertação traz a caracterização bioquímica da enzima E-NPP na superfície de plaquetas intactas de ratos como sendo parte de um complexo sistema para a hidrólise de nucleotídeos nestes fragmentos citoplasmáticos, podendo, assim, contribuir para o desenvolvimento de terapias antiplaquetárias e para o tratamento de doenças vasculares. Adicionalmente, apresentamos alguns resultados demonstrando interações entre os sistemas angiotensinérgico e adenosinérgico de plaquetas de ratos, o que poderá contribuir para o entendimento e o tratamento de doenças cardiovasculares como hipertensão e arteriosclerose. / Platelets are cytoplasmic fragments derived from bone marrow megakaryocytes rupture, whose major role is related to the vascular integrity maintenance. The extracellular nucleotides ATP and ADP as well as adenosine have been implicated in a great number of physiological functions: ADP is the major factor recruiting platelet, whereas ATP has been considered as a competitive inhibitor of ADP-induced platelet aggregation. Adenosine is a molecule able to induce vasodilatation and to inhibit platelet aggregation. Thus, the maintenance of normal purinergic signalling has been showed as an important issue for the treatment of cardiovascular diseases. The nucleoside di and triphosphate can be hydrolyzed by members of several families of membrane-bound or soluble ectonucleotidases, including ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) and ecto-nucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterases (E-NPPs), that together with an ecto-5’-nucleotidase lead to adenosine formation. On the platelets ecto-surface, both E-NTPDase and ecto-5’-nucleotidase are already described. The renin-angiotensin system is the most important regulator of renal and cardiovascular function developing a fundamental role in the arterial blood pressure homeostasis and in the electrolytic balance. Angiotensin II (ANGII) induces physiologically the platelet activation, probably due to its vasoconstrictors properties. The aims of this study were: 1) to kinetically characterize the enzyme E-NPP from rat blood platelet, using the artificial marker substrate p-Nph-5’TMP and 2) to clarify, even though in part, the effects of ANGII upon extracellular nucleotide hydrolysis by rat platelets ectoenzymes. In the first chapter, we describe an enzymatic activity that shares the major characteristics already described for E-NPPs: optimum alkaline pH; KM and Vmax calculated values of approximately 106.22 ± 17.83 μM and 3.44 ± 0.18 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectively; and divalent cation dependence. Besides, AMP inhibited only p-Nph-5’TMP hydrolysis. On the other hand, sodium azide, in high concentrations, ANGII and gadolinium chloride just changed ATP or ADP or both hydrolysis. In the second chapter, we show that ANGII was able to increase ATP, ADP and AMP hydrolysis in platelets from rats in all tested dosis (5, 50, 500 e 5000 picomoles). However, no modification was observed regarding p-Nph-5'TMP hydrolysis. Additionally, we verified an increase on AMP hydrolysis and a reduction on p-Nph-5'TMP hydrolysis in platelets from spontaneously hypertensive rats (SHR) when compared to Wistar normotensive rats. Finally, this work shows the kinetic and biochemistry characterization of an E-NPP enzyme on the intact platelet surface as being part of a complex system for nucleotide hydrolysis that could contribute for the antiplatelet therapies and vascular diseases treatment. In addition, we present some results showing interactions between rat platelet angiotensinergic and adenosinergic systems that could contribute to the understanding and treatment of cardiovascular diseases such as hypertension and atherosclerosis.

Resultados controversos têm sido obtidos em estudos experimentais e clínicos com a infusão de insulina e glicose na lesão isquemia-reperfusão, havendo muito á ser esclarecido sobre os mecanismos deste tratamento. No coração, a insulina tem efeitos sobre a utilização dos substratos, fluxo coronariano, atua como antiinflamatório e, propõem-se efeitos diretos na sobrevivência celular; estes efeitos devem-se a ativação da via fosfatidilinositol 3-cinase (PI3k)-Akt. As interações intracelulares entre os sistemas de sinalização da insulina e da angiotensina-II são muitas, salientando-se a possível importância do cross-talk angiotensina-II/insulina. Apesar da popularidade das preparações em corações isolados no estudo das lesões isquemia-reperfusão, diversos protocolos vêm sendo utilizados quanto a duração da isquemia, dificultanto a escolha do melhor período de isquemia para se testar os efeitos de fármacos sobre a recuperação da função cardíaca. Nesse trabalho objetivamos: determinar o melhor tempo de isquemia para investigar a recuperação funcional e a capacidade de resposta do sistema reninaangiotensina (SRA) tecidual em coração isolado e os efeitos da insulina associada a um inibidor do SRA sobre os mecanismos de cardioproteção à lesão isquemia-reperfusão. No estudo 1 investigamos a recuperação funcional e a capacidade de resposta do SRA tecidual em corações isolados e submetidos a diferentes períodos de isquemia. Os corações foram submetidos a diferentes períodos de isquemia global (20, 25 ou 30 min) e reperfundidos (30 min) com diferentes soluções: Krebs-Henseleit (KH) (grupo KH), KH + angiotensina-I (grupo Angio) ou KH + angiotensina-I + captopril (grupo AC). O índice de contratilidade ventricular (dP/dtmax) e o duplo produto foram reduzidos nos corações expostos à 25 min (~73%) e 30 min de isquemia (~80%) vs 20 min de isquemia. A pressão ventricular diastólica (PVD) e a pressão de perfusão (PP) aumentaram nos corações expostos à 25 min (5,5 e 1,08 vezes, respectivamente) e 30 min de isquemia (6 e 1,10 vezes, respectivamente) vs 20 min de isquemia. A angiotensina-I causou uma diminuição no dP/dtmax e no duplo produto (~85-94%) em todos os períodos isquêmicos, e um aumento na PVD e na PP (6,9 e 1,25 vezes, respectivamente) apenas aos 20 min isquemia. O captopril reverteu parcialmente ou totalmente os efeitos da angiotensina-I sobre a recuperação funcional, somente nos períodos 20 e 25 min de isquemia. Esses dados sugerem que a transição de dano pós-isquêmico leve/moderado para severo ocorre após 20 min de isquemia. Dessa forma, 20 min de isquemia é o melhor período de tempo para se estudar os efeitos de abordagens farmacológicas sobre a recuperação funcional. No estudo 2 investigamos os efeitos da insulina associada a um inibidor do SRA sobre os mecanismos de cardioproteção à lesão isquemia-reperfusão. Os corações foram submetidos a um período de isquemia global (20 min) e reperfundidos (30 min) com diferentes soluções: KH (grupo KH), KH + angiotensina-I (grupo Angio), KH + angiotensina-I + captopril (grupo AC), KH + insulina (grupo Insulina), KH + insulina + angiotensina-I (grupo IA) e KH + insulina + angiotensina-I + captopril (grupo IAC). Durante a recuperação, o grupo Angio apresentou uma redução de ~24% na pressão ventricular desenvolvida (PVDes) e de ~29% no dP/dtmáx vs período basal, e apresentou um aumento de ~2,7 vezes na PVD vs período basal, estes efeitos foram revertidos parcialmente ou totalmente pelos tratamentos AC, IA e IAC. O grupo Angio apresentou uma redução de ~24% no duplo produto vs período basal, este efeito foi revertido pelo tratamento IA, que também foi maior vs grupos KH e AC. Os grupos Angio e IA apresentaram um aumento de ~20% na PP vs período basal, e todos os grupos (exceto o insulina) foram maiores vs grupo KH; os grupos AC e IAC não diferiram dos grupos Angio e insulina. A Akt fosforilada foi maior nos grupos insulina e IA vs grupos KH (~47% e ~42%, respectivamente) e Angio (~60% e ~55%, respectivamente), os grupos AC e IAC não diferem dos demais. A AMPK fosforilada foi ~31% maior nos grupos insulina, IA e IAC vs grupos KH, Angio e AC. Os níveis de TBA-RS no grupo KH foram ~73% maior vs outros grupos; a quimiluminescência também foi maior (~2,2 vezes) no grupo KH vs outros grupos, e o grupo IA foi ~35% menor vs grupo Angio. A atividade da SOD não foi alterada pelos tratamentos, mas a atividade da catalase foi ~28% maior no grupo KH vs outros grupos (exceto o IA, P = 0,058) e a atividade da GST foi menor no grupo insulina vs grupos Angio e AC (~45% e ~50%, respectivamente). Os grupos Angio, AC e IAC apresentaram uma menor concentração da Cu/ZnSOD vs grupo KH (~40%, ~43% e ~27%, respectivamente), os grupos insulina e IA não diferem do grupo KH. Nenhum dos tratamentos alterou a concentração das enzimas GST e eNOS, os níveis de NOX ou a translocação do GLUT-4. Assim, a insulina ativa a via PI3k-Akt e parece exercer uma melhor regulação do estado redox celular, podendo ainda ativar a AMPK e ambas atuarem sinergicamente para um melhor perfil metabólico do miocárdio. Desse modo, a insulina administrada no inicio da reperfusão opõe-se aos efeitos deletérios da angiotensina-II e exerce um efeito cardioprotetor.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / O objetivo do presente estudo foi avaliar a participação do sistema renina angiotensina através de avaliações “ in vivo” e “in vitro” na disfunção cardíaca induzida pelo diabetes experimental por estreptozotocina. Foram utilizados ratos Wistar machos (250-300g) divididos em 4 grupos: Controle Saudável (n=9), Controle Enalapril, (n=7, 1m/Kg), Diabético (n=7, STZ, 50mg/Kg ev), e Diabético + Enalapril (n=7). Nos estudos “in vivo” foi avaliada a função ventricular de forma não invasiva pelo ecocardiograma e invasiva pela cateterização do ventrículo esquerdo (VE) no período basal e após sobrecarga de volume e a pressão arterial (PA) de forma direta nos animais acordados. As dosagens bioquímicas incluíram medida da enzima de conversão da angiotensina (ECA) no soro e coração dos ratos, e em cultura primária de fibroblastos cardíacos tratados com glicose no meio de cultura (25 mM). O diabetes induziu perda de peso corporal gradativa ao longo das 4 semanas e hiperglicemia, alterações que não foram atenuadas pelo tratamento com enalapril. Observou-se prejuízo em parâmetros morfométricos (aumento da cavidade do VE, diminuição da espessura do septo intraventricular e da parede posterior do VE) e de função contrátil (redução da fração de ejeção e da velocidade de encurtamento circunferencial; aumento da velocidade média do picoE, do tempo de desaceleração da onda E e do tempo de relaxamento isovolumétrico) no coração dos animais diabéticos (15 e 30 dias). O tratamento com enalapril atenuou tais prejuízos. Na análise funcional invasiva do VE em 30 dias, no período basal, o grupo diabético apresentou redução da pressão sistólica do VE (controle: 134 ± 13 vs diabético 113 ± 14 mmHg*) e da contratilidade do VE, avaliada pela +dP/dt (controle: 9229 ± 1225 vs diabético: 6565 ± 1610 mmHg/seg *) e pela - dP/dt (controle: - 6845± 1002 vs diabético: - 4745 ± 1557 mmHg/seg*), além de aumento da pressão diastólica final do VE (PDF) (controle: 4,98 ± 0,98 vs diabético: 7,36 ± 0,5 mmHg*) quando comparados ao grupo controle. O tratamento com enalapril não modificou esses parâmetros de função do VE no período basal. Além disto, as diferenças observadas entre o grupo controle e o grupo diabético foram mantidas após um protocolo de sobrecarga de volume. Entretanto, os animais diabéticos tratados com enalapril após a sobrecarga de volume apresentaram medidas de função diástólica do VE (PDF e –dP/dt) semelhantes aos valores do período basal, diferentemente do grupo diabético, no qual, ao final do protocolo de sobrecarga, observou-se valores dobrados de PDF em relação ao período basal. A análise direta dos sinais de PA (Windaq, 2KHz) nos animais acordados evidenciou hipotensão e bradicardia nos grupos diabéticos, tratados ou não com enalapril, em relação aos grupos controles. No soro dos animais diabéticos a atividade da ECA utilizando o substrato ZPhe-HHL aumentou em torno de 50% em relação aos animais controles, no entanto, o tratamento com enalapril não inibiu essa atividade. O oposto foi observado no tecido cardíaco: no grupo diabético a atividade da ECA reduziu em torno de 25%, enquanto, o controle tratado não teve inibição da ECA quando comparados ao controle. O grupo diabético tratado com enalapril obteve uma inibição da ECA em torno de 50%(substrato ZPhe-HHL) em relação aos controles tratados ou não. O mesmo perfil foi observado com o substrato HHL no soro e coração. Entretanto, observou-se uma ativação maior da ECA pelo substrato ZPhe, tanto no soro como no coração em relação ao substrato His Leu. Na análise da expressão proteica da ECA por “western blotting” no coração observou-se uma expressão protéica da ECA aumentada nos animais diabéticos e diabéticos tratados em relação aos controles com os dois anticorpos utilizados: alto peso molecular (136KDa) e de baixo peso (69KDa). Os resultados de expressão protéica aumentada da ECA, foram acompanhados de redução da atividade da enzima no tecido cardíaco. A atividade bioquímica da ECA analisada em cultura de fibroblastos cardíacos estava aumentada em torno de 85% após tratamento com glicose. Concluí-se que o diabetes experimental por estreptozotocina induziu prejuízo em parâmetros cardíacos morfométricos e de função sistólica e diastólica de forma semelhante ao que vem sendo documentado em humanos. Porém a intervenção terapêutica com enalapril tanto em 15 quanto em 30 dias de diabetes atenuou essas disfunções sem, no entanto, promover normlaização da PA e frequência cardíaca. O fato da prejuízo da função do VE observada nos animais diabéticos ter sido inibida pelo tratamento com enalapril sugere que a ativação do sistema renina angiotensina tem um papel importante nas disfunções cardiovasculares do diabetes. / The aim of the present study was to elucidate the role of renin angiotensin system, by “in vivo” and “in vitro” evaluation, on cardiac dysfunction induced by streptozotocin experimental diabetes. Male Wistar rats (250-300g) were divided in 4 groups: control (n=9), control + Enalapril, (n=7, 1mg/Kg), diabetic (n=7, STZ, 50mg/Kg ev), and diabetic + Enalapril (n=7). In vivo studies included: echocardiography as a non invasive tool for ventricular function evaluation and catheterization of left ventricle (LV) to evaluate invasively. The last one was performed in basal condition and after a volume overload protocol. Arterial pressure (AP) was measured directly in awake animals. Biochemistry dosage included angiotensin converting enzyme (ACE) activity in serum, heart and primary cardiac fibroblast culture treated with glucose (25 mM). Diabetes induced hyperglicemia and progressive body weight loss during the protocol. These alterations were not attenuated by enalapril treatment. There were impairment on morphometric (increased LV cavity, reduced intraventricular septum thickness and LV posterior wall thickness) and contractile function parameters (reduced ejection fraction and velocity of circumferential shortening; increased mean E peak velocity, E wave desacceleration time and isovolumetric relaxation time) in the diabetic animalshearts (15 and 30 days). Enalapril treatment attenuated these impairments. In the invasive LF evaluation (30 days), in the basal period, diabetic group presented diminished LV systolic pressure (control: 134 ± 13 vs diabetic 113 ± 14 mmHg*) and LV contractility, measured by +dP/dt (control: 9229 ± 1225 vs diabetic: 6565 ± 1610 mmHg/seg*) and by -dP/dt (control: - 6845± 1002 vs diabetic: - 4745 ± 1557 mmHg/seg*), and also enhanced LV end diastolic pressure (EDP) (control: 4,98 ± 0,98 vs diabetic: 7,36 ± 0,5 mmHg*) as compared to control group. Enalapril treatment did not modify these LV functional parameters in the basal period. Furthermore, the differences observed between control and diabetic groups were maintained after the volume overload protocol. However, enalapril treated diabetic animals presented LV diastolic function parameters (PDF e –dP/dt) after the volume overload similar to their resting values. Differently, the diabetic group showed twice PDF values after volume overload in comparison to it basal PDF values. Direct AP signals measurements (Windaq, 2KHz) in awake animals evidenced hypotension and bradycardia in diabetic groups, treated or not with enalapril, when compared to control groups. Diabetic animals’ serum ACE activity using ZPhe-HHL substrate was 50% increased when compared to control animals; however, enalapril treatment did not inhibit this activity. The opposite was observed in heart tissue: ACE activity reduced 25% in diabetic group and control treated group did not present ACE inhibition in relation to control group. Enalapril treated diabetic group showed ~50% ACE (substrate ZPhe-HHL) inhibition in comparison to treated or untreated control groups. Similar profile was evidenced with ACE substrate HHL in serum and heart. However, it was observed higher ACE substrate ZPhe activation, in both, serum and heart, in comparison to ACE substrate His Leu. Heart ACE protein expression by “western blotting” was increased in diabeticgroups (treated and untreated) in relation to control group with two antibodies: high molecular weight (136KDa) and low molecular weight (69KDa). The increased ACE protein expression was accompanied by heart reduced ACE activity. Glucose treatment increased ~85% ACE activity in primary cardiac fibroblast cultures. In conclusion, streptozotocin experimental diabetes induced impairment in morphometric cardiac parameters and in systolic and diastolic function. Similar condition has been reported in humans. Despite of enalapril therapeutic intervation, in 15 and 30 days, had attenuted these dysfunctions in diabetics, it did not induce AP or heart rate normalization. The inhibition of LV function impairments by enalapril treatment suggests that renin angiotensin system activation plays an important role in the diabetic cardiovascular dysfunctions . / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A insuficiência cardíaca é uma síndrome clínica com débito cardíaco insuficiente, que configura uma das principais causas de morbidade e mortalidade. O sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) tem um papel importante na fisiopatologia da IC, e sua estimulação crônica afeta negativamente o coração por meio da vasoconstrição, retenção de água e sódio, remodelamento cardíaco e fibrose miocárdica. A angiotensina II é um componente ativo do SRAA e sua ação é relevante para a função e estrutura cardiovascular, sendo mediada pelo receptor AT1R. O AT1R é um receptor acoplado à proteína G que medeia a maior parte das ações biológicas do SRAA, no qual a ativação desse receptor capta sinais extracelulares e ativa as vias de transdução de sinal no interior da célula. O AT1R é expresso na maioria dos tecidos e sua ativação pode ocasionar vasoconstrição, retenção de água e a proliferação das células do músculo liso, assim como hipertrofia cardíaca. Estudos realizados em pacientes com IC para avaliar a associação do polimorfismo 1166A>C (rs5186) no gene do receptor tipo 1 da angiotensina II (AGTR1) na insuficiência cardíaca obtiveram resultados conflitantes. Dessa forma, o presente estudo avaliou o polimorfismo 1166A>C no gene do AGTR1 na suscetibilidade e progressão da insuficiência cardíaca em uma coorte de 312 pacientes com IC e em uma amostra de 153 indivíduos da população em geral (doadores de banco de sangue). Os desfechos analisados foram o número de hospitalizações decorrentes da IC e morte por todas as causas. O polimorfismo foi determinado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. As frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo 1166A>C nos pacientes com IC foram semelhantes àquelas dos doadores de banco de sangue. Quanto à progressão da IC, não se observou qualquer diferença estatisticamente significativa na incidência da mortalidade por todas as causas entre os portadores de diferentes genótipos do polimorfismo 1166A>C. Não houve diferença estatisticamente significativa também quanto ao número de hospitalizações nos diferentes genótipos. Assim sendo, os dados obtidos no presente estudo sugerem que o polimorfismo 1166A>C no gene AGTR1 não está associado com a IC ou com a sua progressão.

Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-13T23:43:41Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_EfeitoAtividadeFísica.PDF: 16601664 bytes, checksum: ba849ae4c82fad200b288842f0af918b (MD5) / Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-18T18:24:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_EfeitoAtividadeFísica.PDF: 16601664 bytes, checksum: ba849ae4c82fad200b288842f0af918b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-18T18:24:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_EfeitoAtividadeFísica.PDF: 16601664 bytes, checksum: ba849ae4c82fad200b288842f0af918b (MD5) Previous issue date: 2008 / VII Na hipertensão arterial (HA) ocorre uma inabilidade dos neurônios do bulbo ventrolateral caudal (CVLM) em contrabalancear o aparente aumento da atividade dos neurônios do bulbo ventrolateral rostral (RVLM). Além disso, o aumento da atividade do sistema renina angiotensina (SRA) representa uma importante alteração hormonal que leva à hipertensão, por aumentar o tônus vasomotor simpático e prejudicar a função barorreflexa. A atividade física (AF) de baixa e moderada intensidade tem sido usada no tratamento não farmacológico ou coadjuvante da hipertensão, reduzindo ou restabelecendo as alterações provocadas pelos altos níveis de pressão arterial (PA). O Presente estudo teve como objetivo, avaliar o efeito da AF de natação com ou sem carga, sobre diferentes parâmetros cardiovasculares em ratos com hipertensão renovascular 2 rins 1 clipe (2R1C). Foram utilizados ratos Fischer machos (9 a 11 semanas), pesando entre 150 e 200g. Após quatro dias das cirurgias (SHAM ou 2R1C), sob anestesia com quetamine e xilazina, os ratos foram separados em três grupos experimentais: sedentários (SD), submetidos à atividade física sem carga (SAF 0%) e com carga (SAF 3%). A AF foi realizada em cinco semanas de natação (uma hora por dia, cinco dias por semana) e a pressão arterial média (PAM) foi mensurada semanalmente por pletismografia de cauda. Após 48 horas da última sessão de AF, a PAM e frequência cardíaca (FC) foram monitoradas continuamente (no sistema de aquisição de dados Powerlab) em ratos dos diferentes grupos, anestesiados com uretana. A PAM basal dos ratos 2R1C sedentários foi maior do que a PAM dos ratos SHAM SD e similar a dos ratos 2R1C SAF (0% e 3%). Entretanto, a PAM dos ratos 2R1C SAF 0% e 2R1C SAF 3% também foi semelhante a dos ratos SHAM SD. Reduções na FC basal foram observadas nos grupos 2R1C SAF 0% e 2R1C SAF 3% em relação aos ratos 2R1C SD. A sensibilidade do bradicardia reflexa foi determinada através de alterações na PA induzidas por injeções endovenosas, em bolus, de doses crescentes de fenilefrina. A bradicardia reflexa nos ratos 2R1C SD foi menor em relação aos ratos SHAM SD. No entanto, a AF restaurou a bradicardia reflexa nos ratos 2R1C SAF 0% e, não nos ratos 2R1C SAF 3%. A microinjeção de Ang-(1-7) na CVLM produziu efeito hipotensor similar entre os diferentes grupos SHAM e 2R1C (SD, SAF 0% e SAF 3%). Porém, o antagonista de Ang- (1-7), A-779, microinjetado na CVLM induziu um efeito hipotensivo maior no grupo 2R1C SD. O A-779 na CVLM produziu efeito similar ao da salina nos ratos 2R1C SAF 0% e 2R1C SAF 3% e nos ratos SHAM (SD, SAF 0% e SAF 3%). Além disso, a microinjeção do A-779 na CVLM aumentou a sensibilidade da bradicardia reflexa nos ratos 2R1C SD e 2R1C SAF 3%. A microinjeção do A-779 bloqueou o efeito da Ang-(1-7) por até 15 minutos em todos os grupos experimentais (SD, SAF 0% e SAF 3%) SHAM e 2R1C. A percentagem de redução do peso seco relativo dos rins dos animais 2R1C (SD, SAF 0% e SAF 3%) foi maior que a apresentada pelos ratos SHAM SD. No entanto, a percentagem de redução do peso seco relativo dos rins foi similar entre os animais 2R1C SD e 2R1C SAF 0% e menor nos animais 2R1C SAF 3% comparado à dos 2R1C SD. A análise morfológica cardíaca mostrou que os animais 2R1C SD apresentaram hipertrofia concêntrica, no entanto, nos animais 2R1C SAF 3%, a hipertrofia cardíaca foi excêntrica. A AF aboliu a hipertrofia nos ratos 2R1C SAF 0%. Os níveis séricos de uréia nos ratos SD (SHAM e 2R1C) foram similares, no entanto, a AF (0% e 3%) reduziu estes níveis em ambos os grupos SHAM e 2R1C. Não houve diferença nos níveis séricos de creatinina entre os animais (SD, SAF 0% e SAF 3%) SHAM ou 2R1C. Os animais 2R1C apresentaram cinética dos níveis de lactato diferente e prejudicada em relação aos animais SHAM. Os animais 2R1C SD apresentaram uma menor relação de produção/ remoção do lactato sanguíneo em relação aos animais SHAM (SD, SAF 0% e SAF 3%) e 2R1C (SAF 0% e SAF 3%). Estes dados sugerem que a AF com e sem carga reduzem a PAM e FC basais e restabelecem a reatividade neuronal ao A-779 na CVLM. No entanto, a AF sem carga restaura a sensibilidade da bradicardia reflexa e impede a hipertrofia cardíaca patológica em ratos com hipertensão 2R1C. ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: IX In hypertension, caudal ventrolateral medulla neurons (CVLM) are unable to counteract the increased intrinsic activity of rostral ventrolateral medulla neurons. Besides, the increased activity of renin angiotensin system (RAS) represents an important humoral change that promotes hypertension, raising the sympathetic vasomotor tonus and impairing the baroreflex sensibility. Physical activity of low and moderate intensity has been used associated to a pharmacological treatment as a non pharmacological treatment, reducing or restoring the alterations promoted by the high arterial pressure level (AP). The present study aimed to evaluate the contribution of swimming, with or without load, in different cardiovascular parameters in a rat model of hypertension 2 kidney 1 clip (2K1C). Male Fisher rats (9 to 11 weeks), weighing 150 to 200 g, were used. The surgeries (SHAM or 2K1C) were performed under anesthesia (mixture of ketamine and xilazine). Four days later, rats were separated in three experimental groups: sedentary (SD), submitted to physical activity without (SPA 0%) and with load (SPA 3%). Physical activity was performed during five weeks (one hour per day, five days per week) and the mean arterial pressure (MAP) was measured weekly by tail cuff method. 48 h after the last session of physical activity, the animals were anesthetized (uretana) and MAP and heart hate (HR) were continuously measured (Powerlab system) in different group of rats. Basal MAP levels of 2K1C SD rats were higher than SHAM SD and similar to 2K1C SPA (0% and 3%) rats. However, MAP of 2K1C SPA 0% and 2K1C SPA 3% rats were also similar to SHAM SD rats. Reductions in basal HR were observed in 2K1C SPA 0% and 2K1C SPA 3% groups in comparison to 2K1C SD rats. The bradicardia baroreflex sensibility was determined through alterations in blood pressure (BP) assessed trough i.v. bolus injection of phenylephrine. The baroreflex bradicardia in 2K1C SD was reduced compared to SHAM SD rats. However, physical activity restored the baroreflex bradicardia in 2K1C SPA 0%, but not in 2K1C SPA 3% rats. The hypotension effect produced by microinjection of Ang-(1-7) in the CVLM was similar among all groups SHAM and 2K1C (SD, SPA 0% and SPA 3%). However, the microinjection of a receptor antagonist of Ang-(1-7), A-779, in the CVLM produced a significant hypotensive effect in 2K1C group. A-779 injected in the CVLM produced similar effect on MAP compared to saline in 2K1C SPA 0% and 2K1C SPA 3% and in SHAM (SD, SPA 0% and SPA 3%) rats. Otherwise, the microinjection of A-779 in the CVLM increased the bradicardia baroreflex sensibility in 2K1C SD and 2K1C SPA 3% rats. The microinjection of A-779 blunted the Ang-(1-7) effect in all experimental groups (SD, SPA 0% and SPA 3%) SHAM and 2K1C, for up15 minutes. The percentage of reduction of the dry weight of the kidneys of the animals 2K1C (SD, SPA 0 % and SPA 3 %) was higher than the presented on SHAM SD rats. However, the percentage of reduction of the dry weight of the kidneys of the 2K1C (SD, SPA 0% and SPA 3%) was similar between the 2K1C SD and 2K1C SPA 0% and smaller in 2K1C SPA 3% compared to 2K1C SD animals. The morphological cardiac analysis showed that the 2K1C SD animals presented concentric hypertrophy, however, in the 2K1C SPA 3% animals, the cardiac hypertrophy was eccentric. However, physical activity abolished the hypertrophy in 2K1C SPA 0% rats. Plasma levels of urea in SD, SHAM and 2K1C rats were similar; however, physical activity (0% and 3%) reduced these levels in SHAM and 2K1C rats. There was no differences in plasma levels of creatinina. The 2K1C animals presented an impaired and different kinetic of the lactate in comparison to SHAM groups. The animals 2K1C SD presented a lower production/ removal ratio of blood lactate than SHAM (SD, SPA 0% and SPA 3%) and 2K1C (SPA 0% and SPA 3%) animals. These data suggest that physical activity with and without load reduce basal MAP and HR and restores the neuronal reactivity of the A-779 in the CVLM. However physical activity without load restores the sensibility of bradicardia baroreflex and prevents the cardiac pathological hypertrophy in 2K1C hypertensive rats.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by giuliana silveira (giulianagphoto@gmail.com) on 2016-05-03T19:50:27Z No. of bitstreams: 1 TESE_TratamentoHPβCDAng-(1-7)Reverte.pdf: 6345996 bytes, checksum: 6c9967497280cae13ca3f128df7972bf (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2016-05-04T14:26:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TESE_TratamentoHPβCDAng-(1-7)Reverte.pdf: 6345996 bytes, checksum: 6c9967497280cae13ca3f128df7972bf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-04T14:27:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE_TratamentoHPβCDAng-(1-7)Reverte.pdf: 6345996 bytes, checksum: 6c9967497280cae13ca3f128df7972bf (MD5) Previous issue date: 2015 / O objetivo do presente estudo foi avaliar o potencial terapêutico da formulação oral de Ang-(1-7), a HPβCD/Ang-(1-7), sobre o processo inflamatório do tecido adiposo branco visceral (TAV) e tecido adiposo marrom (TAM), sobre as vias de sinalização intracelular da insulina e sobre a termogênese adaptativa, na reversão de distúrbios metabólicos da síndrome metabólica (SM), induzidos pela dieta hiperlipídica. Ratos recém-desmamados com 4 semanas de idade, foram submetidas à dieta controle AIN-93 (dieta CT) ou à dieta hiperlipídica (dieta SM) por 7 semanas para indução da SM. Após este período, os grupos foram subdivididos em ratos tratados com HPβCD/Ang-(1-7) ou com ciclodextrina vazia (V) por mais 6 semanas. Ao final das 13 semanas de experimento foram realizadas avaliações biométricas, bioquímicas, Elisa e expressões gênicas por qRT-PCR. Os ratos SM-V apresentaram aumento da expressão de citocinas inflamatórias no TAV retroperitoneal e no TAM, redução da expressão do PPARγ2 no fígado, piora da via intracelular da insulina no fígado, no TAV retroperitoneal e no músculo gastrocnêmico, redução na expressão de PGC1-α, PGC1-β, UCP-2 e UCP-3 no gastrocnêmico e aumento da expressão de UCP-1 no TAM. Esses eventos ocorreram simultaneamente com a elevação da glicemia de jejum, da insulina, do HOMA-IR e do HOMA-ß e com o aumento do peso corporal, do índice de adiposidade, do colesterol total, do LDL e da alanina transferase (ALT). O tratamento com HPβCD/Ang-(1-7) reduziu a expressão das adipocinas pró-inflamatórias do TAV e TAM, normalizou a expressão de PPARγ2 no fígado, melhorou a via intracelular da insulina no fígado, no TAB retroperitoneal e no músculo gastrocnêmico e aumentou a expressão de UCP-3 no músculo gastrocnêmico e a expressão de UCP-1 no TAM, quando comparado ao grupo controle CT-V. Esses eventos impediram o aumento do peso corporal, reduziram o índice de adiposidade e os níveis de colesterol total, além de normalizar a glicemia de jejum, os níveis de insulina, o HOMA-IR, o HOMA-ß, e os níveis de ALT. Nossos dados demonstram a eficácia do tratamento com HPβCD-Ang-(1-7) ao mostrar que essa formulação reverte distúrbios metabólicos da SM em ratos, a partir de alterações benéficas teciduais. ___________________________________________________________________________________ / ABSTRACT : The aim of this study was to evaluate the therapeutic potential of the oral formulation of Ang-(1-7), the HPβCD/Ang-(1-7), on the inflammatory process of visceral white adipose tissue (WAT) and brown adipose tissue (BAT) and on intracellular signaling pathways of insulin and on the adaptive thermogenesis, in reversion of metabolic syndrome (MS) and related disorders induced by high-fat diet. Rats weaned at 4 weeks of age, were subjected to AIN-93 diet control (CT diet) or high fat diet (SM diet ) for 7 weeks for the induction of MS. After this period, the rats were divided into groups treated with HPβCD/Ang- (1-7) or empty cyclodextrin (V) for further six weeks. At the end of the experiment biometric, biochemical, Elisa and qRT-PCR assays were performed. SM-V rats showed increase in inflammatory cytokines expression in the retroperitoneal WAT and BAT, reduction in PPARγ2 expression in the liver, worsening in insulin signaling pathways in the liver, retroperitoneal WAT and gastrocnemius, reduction in PGC1- α, PGC1-β, UCP-2 and UCP-3 expression in gastrocnemius and an increase in UCP-1 expression in the TAM. These events occur simultaneously with the elevation of fasting glucose, insulin, HOMA-IR and HOMA-ß and with increasing the body weight, adiposity index, total cholesterol, LDL and alanine aminotransferase (ALT). Treatment with HPβCD/Ang-(1-7) reduced the inflammatory adipokines expression in retroperitoneal WAT and BAT, normalized PPARγ2 expression in the liver, improved the insulin signaling pathway in the liver, retroperitoneal WAT and gastrocnemius, increased UCP-3 expression in gastrocnemius and increased UCP-1 expression in TAM compared to CT-V group. These events prevented the increase in body weight, reduced adiposity index and total cholesterol, and normalized fasting plasma glucose, insulin, HOMA-IR, HOMA-ß, and ALT. Our data demonstrate the efficacy of HPβCD/Ang-(1-7) treatment and show that this formulation reverses MS and related disorders through of tissue beneficial changes.

Resultados controversos têm sido obtidos em estudos experimentais e clínicos com a infusão de insulina e glicose na lesão isquemia-reperfusão, havendo muito á ser esclarecido sobre os mecanismos deste tratamento. No coração, a insulina tem efeitos sobre a utilização dos substratos, fluxo coronariano, atua como antiinflamatório e, propõem-se efeitos diretos na sobrevivência celular; estes efeitos devem-se a ativação da via fosfatidilinositol 3-cinase (PI3k)-Akt. As interações intracelulares entre os sistemas de sinalização da insulina e da angiotensina-II são muitas, salientando-se a possível importância do cross-talk angiotensina-II/insulina. Apesar da popularidade das preparações em corações isolados no estudo das lesões isquemia-reperfusão, diversos protocolos vêm sendo utilizados quanto a duração da isquemia, dificultanto a escolha do melhor período de isquemia para se testar os efeitos de fármacos sobre a recuperação da função cardíaca. Nesse trabalho objetivamos: determinar o melhor tempo de isquemia para investigar a recuperação funcional e a capacidade de resposta do sistema reninaangiotensina (SRA) tecidual em coração isolado e os efeitos da insulina associada a um inibidor do SRA sobre os mecanismos de cardioproteção à lesão isquemia-reperfusão. No estudo 1 investigamos a recuperação funcional e a capacidade de resposta do SRA tecidual em corações isolados e submetidos a diferentes períodos de isquemia. Os corações foram submetidos a diferentes períodos de isquemia global (20, 25 ou 30 min) e reperfundidos (30 min) com diferentes soluções: Krebs-Henseleit (KH) (grupo KH), KH + angiotensina-I (grupo Angio) ou KH + angiotensina-I + captopril (grupo AC). O índice de contratilidade ventricular (dP/dtmax) e o duplo produto foram reduzidos nos corações expostos à 25 min (~73%) e 30 min de isquemia (~80%) vs 20 min de isquemia. A pressão ventricular diastólica (PVD) e a pressão de perfusão (PP) aumentaram nos corações expostos à 25 min (5,5 e 1,08 vezes, respectivamente) e 30 min de isquemia (6 e 1,10 vezes, respectivamente) vs 20 min de isquemia. A angiotensina-I causou uma diminuição no dP/dtmax e no duplo produto (~85-94%) em todos os períodos isquêmicos, e um aumento na PVD e na PP (6,9 e 1,25 vezes, respectivamente) apenas aos 20 min isquemia. O captopril reverteu parcialmente ou totalmente os efeitos da angiotensina-I sobre a recuperação funcional, somente nos períodos 20 e 25 min de isquemia. Esses dados sugerem que a transição de dano pós-isquêmico leve/moderado para severo ocorre após 20 min de isquemia. Dessa forma, 20 min de isquemia é o melhor período de tempo para se estudar os efeitos de abordagens farmacológicas sobre a recuperação funcional. No estudo 2 investigamos os efeitos da insulina associada a um inibidor do SRA sobre os mecanismos de cardioproteção à lesão isquemia-reperfusão. Os corações foram submetidos a um período de isquemia global (20 min) e reperfundidos (30 min) com diferentes soluções: KH (grupo KH), KH + angiotensina-I (grupo Angio), KH + angiotensina-I + captopril (grupo AC), KH + insulina (grupo Insulina), KH + insulina + angiotensina-I (grupo IA) e KH + insulina + angiotensina-I + captopril (grupo IAC). Durante a recuperação, o grupo Angio apresentou uma redução de ~24% na pressão ventricular desenvolvida (PVDes) e de ~29% no dP/dtmáx vs período basal, e apresentou um aumento de ~2,7 vezes na PVD vs período basal, estes efeitos foram revertidos parcialmente ou totalmente pelos tratamentos AC, IA e IAC. O grupo Angio apresentou uma redução de ~24% no duplo produto vs período basal, este efeito foi revertido pelo tratamento IA, que também foi maior vs grupos KH e AC. Os grupos Angio e IA apresentaram um aumento de ~20% na PP vs período basal, e todos os grupos (exceto o insulina) foram maiores vs grupo KH; os grupos AC e IAC não diferiram dos grupos Angio e insulina. A Akt fosforilada foi maior nos grupos insulina e IA vs grupos KH (~47% e ~42%, respectivamente) e Angio (~60% e ~55%, respectivamente), os grupos AC e IAC não diferem dos demais. A AMPK fosforilada foi ~31% maior nos grupos insulina, IA e IAC vs grupos KH, Angio e AC. Os níveis de TBA-RS no grupo KH foram ~73% maior vs outros grupos; a quimiluminescência também foi maior (~2,2 vezes) no grupo KH vs outros grupos, e o grupo IA foi ~35% menor vs grupo Angio. A atividade da SOD não foi alterada pelos tratamentos, mas a atividade da catalase foi ~28% maior no grupo KH vs outros grupos (exceto o IA, P = 0,058) e a atividade da GST foi menor no grupo insulina vs grupos Angio e AC (~45% e ~50%, respectivamente). Os grupos Angio, AC e IAC apresentaram uma menor concentração da Cu/ZnSOD vs grupo KH (~40%, ~43% e ~27%, respectivamente), os grupos insulina e IA não diferem do grupo KH. Nenhum dos tratamentos alterou a concentração das enzimas GST e eNOS, os níveis de NOX ou a translocação do GLUT-4. Assim, a insulina ativa a via PI3k-Akt e parece exercer uma melhor regulação do estado redox celular, podendo ainda ativar a AMPK e ambas atuarem sinergicamente para um melhor perfil metabólico do miocárdio. Desse modo, a insulina administrada no inicio da reperfusão opõe-se aos efeitos deletérios da angiotensina-II e exerce um efeito cardioprotetor.

As plaquetas sangüíneas são fragmentos citoplasmáticos, oriundos da ruptura dos megacariócitos, cuja principal função está relacionada à manutenção da integridade vascular. Os nucleotídeos extracelulares, ATP e ADP, bem como a adenosina, têm sido implicados em um grande número de funções fisiológicas: o ADP é o principal fator recrutador de plaquetas, enquanto que o ATP é um inibidor competitivo da agregação induzida por ADP. A adenosina é uma molécula capaz de induzir vasodilatação e inibir a agregação plaquetária. Desta maneira, a manutenção da sinalização purinérgica normal tem se mostrado importante para o tratamento de doenças cardiovasculares. Os nucleosídeos di e trifosfatos circulantes podem ser hidrolisados por membros de várias famílias de ectonucleotidases de membrana e solúveis, incluindo as ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases) e ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPPs), que em conjunto com a ecto-5’-nucleotidase, levam à formação de adenosina. Na superfície das plaquetas, ambas enzimas, E-NTPDase e ecto-5’-nucleotidase, estão descritas. O sistema renina-angiotensina é o principal regulador da função renal e cardiovascular, desenvolvendo um papel fundamental na homeostasia da pressão arterial e do balanço eletrolítico. A angiotensina II (ANGII) induz fisiologicamente a ativação das plaquetas, possivelmente devido às suas propriedades vasoconstritoras. Os objetivos deste trabalho foram, portanto: 1) caracterizar cineticamente a enzima E-NPP em plaquetas de ratos, utilizando o substrato marcador p-Nph-5’TMP e 2) esclarecer, mesmo que em parte, os possíveis efeitos da ANGII sobre a hidrólise extracelular de nucleotídeos por plaquetas de ratos. No primeiro capítulo deste trabalho, descrevemos uma atividade enzimática em plaquetas de ratos que compartilha as principais características bioquímicas já descritas para as E-NPPs: pH ótimo alcalino; valores de KM e Vmax calculados de aproximadamente 106.22 ± 17.83 μM e 3.44 ± 0.18 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectivamente; e dependência de cátions divalentes. Além disso, o AMP inibiu somente a hidrólise do p-Nph-5’TMP. Por outro lado, a azida de sódio, em altas concentrações, a angiotensina II e o cloreto de gadolínio alteraram apenas as hidrólises de ATP ou ADP ou de ambos. No segundo capítulo, mostramos que a ANGII foi capaz de aumentar as hidrólises de ATP, ADP e AMP em plaquetas em todas as doses testadas (5, 50, 500 e 5000 picomóis). Entretanto, nenhuma alteração foi observada com relação à hidrólise do p-Nph-5'TMP. Em adição, observamos um aumento na hidrólise de AMP e uma diminuição na hidrólise de p-Nph-5'TMP em plaquetas de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) quando comparados a ratos Wistar normotensos. De maneira geral, esta dissertação traz a caracterização bioquímica da enzima E-NPP na superfície de plaquetas intactas de ratos como sendo parte de um complexo sistema para a hidrólise de nucleotídeos nestes fragmentos citoplasmáticos, podendo, assim, contribuir para o desenvolvimento de terapias antiplaquetárias e para o tratamento de doenças vasculares. Adicionalmente, apresentamos alguns resultados demonstrando interações entre os sistemas angiotensinérgico e adenosinérgico de plaquetas de ratos, o que poderá contribuir para o entendimento e o tratamento de doenças cardiovasculares como hipertensão e arteriosclerose. / Platelets are cytoplasmic fragments derived from bone marrow megakaryocytes rupture, whose major role is related to the vascular integrity maintenance. The extracellular nucleotides ATP and ADP as well as adenosine have been implicated in a great number of physiological functions: ADP is the major factor recruiting platelet, whereas ATP has been considered as a competitive inhibitor of ADP-induced platelet aggregation. Adenosine is a molecule able to induce vasodilatation and to inhibit platelet aggregation. Thus, the maintenance of normal purinergic signalling has been showed as an important issue for the treatment of cardiovascular diseases. The nucleoside di and triphosphate can be hydrolyzed by members of several families of membrane-bound or soluble ectonucleotidases, including ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) and ecto-nucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterases (E-NPPs), that together with an ecto-5’-nucleotidase lead to adenosine formation. On the platelets ecto-surface, both E-NTPDase and ecto-5’-nucleotidase are already described. The renin-angiotensin system is the most important regulator of renal and cardiovascular function developing a fundamental role in the arterial blood pressure homeostasis and in the electrolytic balance. Angiotensin II (ANGII) induces physiologically the platelet activation, probably due to its vasoconstrictors properties. The aims of this study were: 1) to kinetically characterize the enzyme E-NPP from rat blood platelet, using the artificial marker substrate p-Nph-5’TMP and 2) to clarify, even though in part, the effects of ANGII upon extracellular nucleotide hydrolysis by rat platelets ectoenzymes. In the first chapter, we describe an enzymatic activity that shares the major characteristics already described for E-NPPs: optimum alkaline pH; KM and Vmax calculated values of approximately 106.22 ± 17.83 μM and 3.44 ± 0.18 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectively; and divalent cation dependence. Besides, AMP inhibited only p-Nph-5’TMP hydrolysis. On the other hand, sodium azide, in high concentrations, ANGII and gadolinium chloride just changed ATP or ADP or both hydrolysis. In the second chapter, we show that ANGII was able to increase ATP, ADP and AMP hydrolysis in platelets from rats in all tested dosis (5, 50, 500 e 5000 picomoles). However, no modification was observed regarding p-Nph-5'TMP hydrolysis. Additionally, we verified an increase on AMP hydrolysis and a reduction on p-Nph-5'TMP hydrolysis in platelets from spontaneously hypertensive rats (SHR) when compared to Wistar normotensive rats. Finally, this work shows the kinetic and biochemistry characterization of an E-NPP enzyme on the intact platelet surface as being part of a complex system for nucleotide hydrolysis that could contribute for the antiplatelet therapies and vascular diseases treatment. In addition, we present some results showing interactions between rat platelet angiotensinergic and adenosinergic systems that could contribute to the understanding and treatment of cardiovascular diseases such as hypertension and atherosclerosis.