La Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) (enfermedad de Crohn (EC) y Colitis Ulcerosa (CU)), es una enfermedad crónica, poligénica y compleja, de curso recurrente, que afecta al tracto gastrointestinal. Estudios recientes in vitro y modelos experimentales en animales sugieren que el Sistema Endocannabinoide (SE) y la Haptoglobina (Hp) pueden tener un papel protector en la EII. Estudio 1: Sistema Endocannabinoide y EII Se analizó, mediante Western-Blot e inmunohistoquímica, la presencia de los componentes del sistema endocannabinoide (receptores - CB1,CB2-, enzimas de síntesis -DAGL-α/β, NAPE-PLD-, y enzimas de degradación -FAAH y MAGL-) en mucosa de colon de individuos normales, y en pacientes con CU en fase activa, antes de iniciar el tratamiento, y en fase quiescente. Se identificó por primera vez la expresión de todos los componentes del SE en mucosa colónica normal. Como novedades destacan la localización de: CB1 en las células “goblet”; CB2 en las células de Paneth y en los plexos neuroentéricos; FAAH y MAGL en células plasmáticas y polimorfonucleares; enzimas de síntesis en las células epiteliales y en ambos plexos mientéricos. Además, se demostró la presencia de un tono endocannabinoide basal que se modifica en pacientes con CU, tanto en la fase activa como en la fase quiescente: - En pacientes con CU leve-moderada, en fase activa, existe un aumento de la expresión de CB2, cuyos niveles se recuperan en la fase quiescente. - En la fase activa existe una disminución de la expresión de NAPE-PLD, que se recupera en fase quiescente, y un aumento de DAGL-α y MAGL, que se mantienen en la fase quiescente. En conclusión, los componentes del SE se modifican durante la inflamación en la CU , fundamentalmente mediante un aumento de receptores CB2. Por lo tanto, el desarrollo de fármacos que aumenten el tono endocannabinoide durante la inflamación, podrían ser una nueva vía de investigación en la terapéutica de la EII. Estudio 2: Haptoglobina y EII. La Hp es una proteína con propiedades inmunomoduladoras. Existe un polimorfismo en el gen de la Hp, con 2 alelos: Hp1 y Hp2. El objetivo de este estudio fue investigar el papel genético y funcional de la Hp en la EII. Se genotiparon, utilizando PCR “touch-down", 1061 pacientes con EC , 755 con CU y 452 individuos sanos. La prevalencia de la Hp2 fue mayor en EC y en CU que en los controles. Estos resultados se confirmaron en tríos familiares de EII (464 con EC y 151 con CU), en los que el alelo Hp2 se transmite a los descendientes con mayor frecuencia. Se determinaron además los valores séricos de Hp en 62 individuos sanos. Se observaron valores inferiores en aquellos sujetos con genotipo 22. Se desarrollaron dos modelos murinos de colitis experimental (DSS y OXA) en los que demostró que los ratones KO para el gen de la Hp desarrollaban formas de colitis más graves. Además, en ratones KO para el gen de la Hp, los niveles de mRNA de IL-17, INF-γ, TNF e IL-6 en DSS-colitis y los de IL-13 en OXA-colitis se encontraban elevados. En la DSS-colitis, al añadir IL-23 en los ratones KO para el gen de la Hp, aumentaba significativamente la producción de IL-17. En resumen, el polimorfismo de la Hp está implicado en la susceptibilidad genética a padecer EII, lo que subraya la existencia de mecanismos patogénicos comunes con otras enfermedades de base inmunológica. Además, Hp desempeña un papel en la reducción de la severidad de la inflamación en la colitis experimental y modula la producción de IL-17, por lo que podría tener potenciales aplicaciones terapéuticas en la EII. / Inflammatory Bowel Disease (IBD) (Crohn’s disease (CD) and Ulcerative Colitis (CU)), is a chronic, poligenic, complex and relapsing disease of the gastrointestinal tract. Recent studies in vitro and experimental animal models have suggested a protective role of the Endocannabinoid System (ES) and Haptoglobin in IBD. Study 1: Endocannabinoid system and IBD We examined, using Western-Blotting and immunohistochemistry, the expression of all components of ES (receptors - CB1, CB2-, biosynthesis enzymes -DAGL-α/β, NAPE-PLD-, and degradating enzymes -FAAH y MAGL- in healthy human colonic tissue, and in active UC patients, without any previous treatment, and in quiescent phase. We identified for the first time, the presence of all components of ES in normal colonic tissue. As novelties we pointed out the expression of: CB1 in globlet cells; CB2 in Paneth cells and in neuroenteric plexi; FAAH and MAGL in plasmatic cells and in polymorphonuclear cells; byosynthesis enzymes in epithelial cells and in both mienteric plexi. Besides, we evidenced the presence of a basal endocannabinoid tone modified in UC patients, in active flares as in quiescent phases: - In UC patients with mild-moderate flares, there was an increase in CB2 expression, that returned to normality in the quiescent phase. - In the active phase there was a decrease in NAPE-PLD expression, that recovered in the quiescent phase, and an increase in DAGL-α and MAGL expression, that is maintained in the quiescent phase. In conclusion, the ES components are altered during inflammation in UC, mainly by an increase in CB2 expression. Therefore, the development of new drugs raising the endocannabinoid tone during inflammation may lead to new therapeutical approaches in IBD. Study 2: Haptoglobin and IBD. Hp is a protein with immunomodulatory properties. There is a polymorphism in the Hp gene, with two different alleles: Hp1 and Hp2. The goal of this study was to investigate the role of Hp in IBD, both genetically and functionally. We genotyped, using a “touch-down” PCR, 1061 CD patients, 755 UC patients and 452 healthy individuals. Prevalence of Hp2 was higher in CD and UC patients than in controls. These results were confirmed in IBD trios families (464 CD trios and 151 UC trios) where Hp2 allele was over-transmitted to the affected offspring. We determined serum levels of Hp in 62 healthy controls. Serum Hp values were lower in individuals with genotype 22. We developed two murine models of experimental colitis (DSS and OXA) and we demonstrated that Hp KO mice developed more severe colitis. In Hp KO mice, mRNA levels of IL-17, INF-γ, TNF and IL-6 in DSS-colitis and mRNA levels of IL-13 en OXA-colitis were higher than in WT mice. In DSS-colitis, after adding IL-23, in Hp KO mice production of IL-17 was significantly increased. To summarized, the Hp polymorphism is implicated in genetic susceptibility to IBD, underscoring common pathogenic pathways with other immune-based diseases. Moreover, Hp has a role in reducing the severity of experimental colitis inflammation and it modulates IL-17 production, suggesting potencial therapeutical applications in IBD.

El sistema endocannabinoide (SEC) está formado por los receptores cannabinoides (CB1 y CB2), los ligandos que se unen a ellos, el 2- araquidonoilglicerol (2-AG) y la anandamida (AEA), y las enzimas responsables del metabolismo de estos lípidos. Estas moléculas están involucradas en mecanismos intracelulares de gran relevancia, teniendo funciones neuromoduladoras y neuroprotectoras. En los últimos años, se ha intensificado el estudio del SEC en la retina, si bien se ha demostrado su presencia y la participación de algunos componentes en la función visual, aún se desconoce su contribución en la respuesta a la luz. La entrada de luz al ojo es censada por las proteínas receptoras ubicadas en los discos del segmento externo de las células fotorreceptoras. A este nivel, se inicia la conversión de la señal lumínica en señal eléctrica, proceso denominado fototransducción. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue el de investigar la presencia del SEC en el segmento externo de los bastones de retinas bovinas (ROS) además de su modulación por el estímulo lumínico fisiológico. Este fue aplicado a la retina directamente o al ROS aislado proveniente de retinas mantenidas en oscuridad. En una primera etapa de este trabajo de Tesis se demostró la presencia de los elementos del SEC (receptores y enzimas metabólicas) en el ROS y cómo era su modulación por luz. Los resultados señalan la presencia de los receptores CB1 y CB2, así como de otros receptores que responden a cannabinoides, GPR55 y TRPV1, además de la principal enzima de síntesis diacilglicerol lipasa (DAGL) y de hidrólisis monoacilglicerol lipasa (MAGL) del 2-AG. Los estudios de las actividades de las enzimas de síntesis (DAGL y la lisofosfatidato fosfohidrolasa (LPAP)) e hidrólisis MAGL muestran su balance en favor del incremento del 2-AG en el ROS de retinas expuestas a la luz, coincidiendo con un aumento en los niveles proteicos de los receptores CB1 y CB2. Además, en esta condición de iluminación el nivel del GPR55 disminuye, no observándose modificaciones en la expresión del TRPV1 en el ROS. Otro hallazgo interesante de esta Tesis Doctoral lo presentan las actividades de las enzimas metabólicas en cuanto a la respuesta a las distintas formas de iluminación. Mientras la DAGL es independiente del momento en que se aplica el estímulo lumínico, la MAGL se estimula sólo cuando la luz se aplica directamente a la retina. Dado que las actividades de DAGL y MAGL se vieron modificadas por la luz, en una segunda etapa de este trabajo de Tesis Doctoral, se evaluó si alguna de las proteínas involucradas en el proceso visual, eran responsables de la modulación de estas actividades. Los resultados sugieren el rol de la transducina y de la PDE y arrestina en la regulación de las actividades de DAGL y de MAGL, respectivamente. Por último, y para establecer el rol del receptores CB1 y del CB2 sobre el propio metabolismo del 2-AG, se evaluó la acción de los agonistas y antagonistas de estos receptores sobre las actividades de síntesis e hidrólisis del 2-AG. Los resultados muestran que la modulación de estos receptores genera una menor disponibilidad del 2-AG a través de la disminución en la actividad de LPAP del ROS. Los resultados alcanzados en este trabajo de Tesis evidencian: i) la participación activa del SEC en el proceso visual y en la adaptación a la luz, ii) la modulación de la disponibilidad del 2-AG por proteínas relacionadas al fenómeno de fototransducción, e iii) la regulación del metabolismo del endocannabinoide a través de la modulación de los receptores a los que el se une con mayor afinidad. / The Endocannabinoid system (SEC) is composed of cannabinoid receptors (CB1, CB2), the ligand that binds to these receptors, 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) and anandamide (AEA), and the enzymes responsible for the metabolism of these lipids. These molecules are involved in highly relevant intracellular mechanisms and they have neuromodulatory as well as neuroprotective functions. The study of the SEC in the retina has been recently intensified. The presence and participation of some components of SEC in the visual function have been demonstrated although their contribution to the response to light is still unknown. The entry of light into the eye is sensed by receptors, which are located in the discs of the outer segment of the photoreceptor cells. The conversion of the light signal into an electrical signal, a process called phototransduction, begins at this level. The principal aim of this Ph. D. Thesis was to study the presence of the SEC in rod outer segments (ROS) from bovine retina photoreceptor cells and its modulation by the physiological stimulus of light. This stimulus was applied to the retina either directly or to isolated ROS from retinas kept in the dark. In a first stage of this Ph. D. Thesis work, both the presence of SEC elements (receptors and metabolic enzymes) in ROS and how they are modulated by light were demonstrated. These results indicate the presence of CB1 and CB2 receptors as well as other receptors that respond to cannabinoids, GPR55 and TRPV1, in addition to the main enzyme of synthesis diacylglycerol lipase (DAGL) and hydrolysis monoacylglycerol lipase (MAGL) of 2-AG. The studies conducted on the activities of the biosynthetic enzymes (DAGL and lysophosphatidate phosphohydrolase (LPAP)) and the hydrolytic enzyme (MAGL) show their balance in favor of the increase of 2-AG in ROS of light-exposed retinas, in agreement with an increase in CB1 and CB2 receptor protein levels. In addition, under this lighting condition, the level of GPR55 decreased, with no changes in the expression of TRPV1 in the ROS. Another interesting finding from this Ph.D. Thesis concerns the activities of the metabolic enzymes relation the response to the different forms of lighting. In this respect, while DAGL is independent of the moment when the light stimulus is applied, MAGL is stimulated only when light is applied directly to the retina. Since DAGL and MAGL activities were modified by light, during the second stage of this Ph.D. Thesis work, it was evaluated if any of the proteins involved in the visual process were responsible for the modulation of these activities. The results collected suggest the role of transducin, and PDE and arrestin in the regulation of DAGL and MAGL activities, respectively. Finally, in order to determine the role of CB1 and CB2 receptors in 2-AG metabolism, the action of agonists and antagonists of these receptors on the synthesis and hydrolysis activities of 2-AG was evaluated. The results collected show that the modulation of these receptors generates a lower availability of 2-AG through the decrease in LPAP activity in ROS. Taken together, the results from this Ph.D. work evidence: i) the active participation of the SEC in the visual process and in the adaptation to light, ii) the modulation of the availability of 2-AG by proteins related to the phenomenon of phototransduction, and iii) the regulation of the endocannabinoid metabolism through the modulation of the receptors to which it binds with greater affinity.