Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T11:09:12Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 19392 bytes, checksum: 64f0b61e8783f7a7b478eaea99ccf4ab (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T11:09:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 19392 bytes, checksum: 64f0b61e8783f7a7b478eaea99ccf4ab (MD5) Previous issue date: 2002-02-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A resistência aos antimicrobianos foi estudada em bactérias da microbiota indígena de frangos de corte. O objetivo geral foi determinar os mecanismos de resistência aos antimicrobianos em membros multirresistentes da família Enterobacteriaceae. Quatorze isolados de Enterobacter cloacae e oito de Escherichia coli tiveram seus perfis de resistência investigados. Foi observada ampla variação nos níveis de resistência entre isolados de uma mesma espécie, com base nas concentrações inibitórias mínimas (MIC) de antimicrobianos pertencentes a diferentes classes. A presença de sistemas de efluxo multidrogas foi evidenciada em ambas as espécies, pela diminuição da MIC nas células tratadas com carbonil cianeto m-clorofenilhidrazona (CCCP) e pelas hibridizações com sondas derivadas de genes codificadores de algumas proteínas componentes de sistemas de efluxo multidrogas. O uso da sonda derivada de mexXY resultou em hibridização com DNA plasmidial, enquanto a sonda derivada de mexEF hibridizou com DNA cromossômico. Os sistemas de efluxo MexXY e MexEF são conhecidos em Pseudomonas aeruginosa. Presença de seqüências homólogas às dos genes codificadores das proteínas AcrA e AcrB foi detectada por reação em cadeia de polimerase, PCR. Todos os isolados de E. coli apresentaram resultados positivos para acrAB, enquanto onze isolados de E. cloacae apresentaram amplificação de segmentos com os comprimentos esperados e três apresentaram resultados negativos, isto é, não houve amplificação. O sistema de efluxo AcrAB é conhecido em Escherichia coli e em Salmonella typhimurium. Resistência ao cloranfenicol, dependente de força próton motora, foi relacionada com presença de plasmídios em isolados de E. coli, resultado este obtido de cura e transformação de E. coli selvagem e de transformação de E. coli DH5α com os plasmídios da E. coli original. Todos os isolados resistentes aos β-lactâmicos apresentaram atividade de β- lactamases, exceto um, que apresentou atividade de sistema de efluxo para o β-lactâmico cefaclor. Os resultados demonstram a diversidade de mecanismos de resistência aos antimicrobianos entre isolados da mesma espécie e da mesma fonte, além da presença de sistemas de efluxo de drogas em bactérias da microbiota indígena de frangos. / The resistance to antimicrobial agents in bacteria isolated from poultry carcasses was examined. The main objective was to identify resistance mechanisms in multiresistant members of the Enterobacteriacae family. Fourteen isolates of Enterobacter cloacae and eight of Escherichia coli had their resistance profiles investigated. Wide ranges of Minimum Inhibitory Concentrations, MIC, for individual antimicrobial agents belonging to different classes were observed. In both species, the presence of drug efflux systems was determined by the lowering of MIC for cells treated with carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone, CCCP. DNA hybridization with probes derived from mexXY and mexEF indicated the possible presence of similar genes in some of those isolates. Plasmid DNA hybridized with the mexXY probe and chromossomal DNA hybridized with the mexEF probe. MexXY and MexEF are multidrug efflux systems of Pseudomonas aeruginosa. Amplification of DNA with primers derived from acrAB showed positive results for all of the E.coli isolates. AcrAB is a multidrug efflux system recognized in E. coli and in Salmonella typhimurium. Eleven of the E. cloacae isolates had DNA of the xiiiexpected lengths amplified and three did not show any sign of amplification with either the acrA or acrB primers. There was evidence of a chloranfenicol resistance mechanism dependent of the proton motive force that was related to the the presence of plasmids. The evidence was obtained by plasmid curing and transformation. E. coli DH5α transformed with the referred plasmids also acquired resistance to the same level of the drug. All of the isolates resistant to β-lactam antibiotics presented β-lactamase activity, except for one that showed possible efflux system to cefaclor, as evidenced by the response to CCCP. These results demonstrate diversity in resistance mechanisms to antimicrobial agents among isolates of the same species from the same origin in nature. The presence of drug efflux systems was demonstrated in commensal bacteria of poultry.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo principal desse estudo foi avaliar os mecanismos de resistência aos agentes β-lactâmicos em isolados clínicos de P. aeruginosa procedentes de dois hospitais, localizados no Brasil e nos Estados Unidos da América (EUA). Foram avaliadas 145 amostras bacterianas de P. aeruginosa recuperadas de hemoculturas, sendo 84 isolados obtidos no período de janeiro de 2000 a maio de 2002 do Hospital São Paulo - HSP (Brasil) e 61 isolados obtidos no período de janeiro de 1996 a dezembro de 2003 do Medical College of Virginia - MCV (EUA). Todas as amostras bacterianas foram submetidas ao teste de sensibilidade aos antimicrobianos, avaliado pela técnica de diluição em ágar. A atividade enzimática das carbapenemases foi avaliada pelo método de hidrólise com inibição pelo EDTA. A pesquisa de genes que codificam ESBL e carbapenemases foi realizada pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR), seguido por sequencimento. A transcrição dos genes mexB, mexD, mexF e mexY, que codificam os sistemas de efluxo ABM, CDJ, EFN, XY, respectivamente, da β-lactamase cromossomal ampC e da porina oprD foi avaliada pela técnica de PCR quantitativo em tempo real (qRTPCR), sendo os resultados da transcrição comparados com a cepa referência PA01. Nossos resultados demonstraram que os isolados procedentes do HSP apresentaram taxas de sensibilidade inferiores aos antimicrobianos testados comparado àquelas apresentadas pelos isolados do MCV, exceto para a ciprofloxacina. Sete isolados clínicos de P. aeruginosa do HSP apresentaram atividade carbapenemase, sendo amplificado os genes blaIMP-1 (n=1), blaIMP-16 (n=1) e blaSPM-1 (n=5). Adicionalmente, foi identificada a produção de GES-5 por uma amostra do HSP. Nenhum isolado proveniente do MCV apresentou atividade carbapenemase pela técnica espectrofotométrica ou qualquer amplificação dos genes codificadores de ESBL ou carbapenemases pesquisados. O aumento da transcrição dos genes que codificam os sistemas de efluxo avaliados foi mais frequente entre os isolados clínicos de P. aeruginosa procedentes do HSP (71,4%), em comparação com os isolados do MCV (52,4%). Os sistemas XY (41,6%) e ABM (24,6%) foram os mais frequentes entre os isolados do HSP e do MCV, respectivamente. Adicionalmente, foi avaliada a transcrição dos diferentes genes que codificam esses sistemas simultaneamente com a expressão de outros mecanismos de resistência. Entre os isolados do HSP, a associação desses diferentes determinantes de resistência foi maior que entre os isolados do MCV. A redução da transcrição de oprD foi semelhante entre os dois grupos amostrais, sendo observada em 91,6% e 91,8% dos isolados do HSP e do MCV, respectivamente. O aumento da transcrição de ampC foi observado em 30,9% e 5,0% dos isolados do HSP e MCV. O aumento da transcrição dos genes que codificam os sistemas de efluxo e/ou a redução da transcrição de oprD parecem aumentar as CIMs dos β-lactâmicos, embora a associação destes mecanismos com a produção de β-lactamases seja mais significante para o aumento da CIM. Isso pode sugerir que tais mecanismos podem favorecer a sobrevivência da P. aeruginosa sob pressão seletiva, aumentando, assim, a chance de adquirir outros determinantes de resistência aos agentes β-lactâmicos no ambiente hospitalar, e contribuindo para o surgimento de cepas altamente resistentes a esta classe de antimicrobianos. / The aim of this study was evaluate the mechanisms of β-lactams resistance in P. aeruginosa clinical isolates from two hospitals, located in Brazil and United States of America (USA). We have selected 145 P. aeruginosa isolated in blood cultures. Of those, 84 and 61 isolates were recovered from patients hospitalized in Hospital São Paulo – HSP (Brazil), and in Medical College of Virginia – MCV (USA), respectively. All strains were submitted to antimicrobial susceptibility testing by agar dilution. Investigation of carbapenemase activity of crude extracts was performed by UV spectrophotometric assays. Detection of ESBL- and MBL-encoding genes was conducted by PCR, followed by amplicon sequencing. The hyperexpression of efflux systems (ABM, CDJ, EFN and XY), AmpC chromosomal β-lactamase, as well as reduced OprD expression was evaluated by quantitative real time PCR (qRT-PCR), compared to that of PA01 reference strain. Isolates from HSP showed decreased susceptibility rates for most antimicrobials tested compared to those of MCV isolates, except for ciprofloxacin. Carbapenemhydrolysis was detected in seven P. aeruginosa from HSP, in which we have identified the MBL- encoding genes blaIMP-1 (n=1), blaIMP-16 (n=1) and blaSPM-1 (n=5). In addition, the production of GES-5 was observed in a single isolate from this hospital. In contrast, neither MBL- nor ESBL-encoding genes were observed in isolates from MCV. Efflux hyperexpression was more frequently observed in P. aeruginosa clinical isolates from HSP (71.4%) than from MCV (52.4%). The efflux systems XY (41.6%) and ABM (24.6%) were more frequently hyperexpressed in isolates from HSP and MCV, respectively. The simultaneous expression of different resistance determinants in one isolate was also evaluated. This association was more frequent among HSP isolates. Reduced OprD expression was similar among isolates from HSP and MCV, 91.6% and 91.8%, respectively. The hyperexpression of AmpC was 30.9% among HSP isolates and 5.0% among MCV isolates. The efflux hyperexpression and/or porin loss might increase β-lactam MICs, although not as effectively as do β-lactamases associated with other resistant determinants. This finding suggests that such mechanisms may favor P. aeruginosa survival under selective pressure, increasing its possibility to acquire other β-lactam resistance determinants in the hospital environment, contributing to the emergence of strains highly resistant to this class of antimicrobials. / FAPESP: 06/55937-3 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações