O flúor é um elemento natural encontrado em diversas concentrações tanto na água como no solo. É considerado um nutriente benéfico quando presente em níveis ótimos. Apesar de ser utilizado como medicamento em pacientes com osteoporose, sendo capaz de aumentar a densidade óssea, sua eficácia na redução de fraturas ainda apresenta muitas controvérsias, e a exposição a altos níveis e por tempo prolongado, pode levar à fluorose esquelética. Dessa forma o objetivo deste trabalho foi estudar in vitro o efeito do flúor no processo de mineralização por osteoblastos de duas espécies de camundongos com maior e menor densidade óssea, C3H/HeJ (C3) e C57BL/6J (B6) respectivamente. Os osteoblastos isolados da calvária através da digestão enzimática de animais recém nascidos foram expostos a diferentes doses de NaF, e os resultados mostraram que B6 foi mais suscetível ao NaF, apresentando redução da área mineralizada a partir da dose de 10M, enquanto que com C3, a dose significativa foi a partir de 50M, demonstrando que os osteoprogenitores mais diferenciados de C3, são mais resistentes à ação inibitória do flúor. Os testes de unidades formadoras de colônias indicaram um aumento do número de colônias de osteoprogenitores e do número de nódulos mineralizados com a exposição ao NaF. A atividade da metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) também foi aumentada no período de 7 dias em B6 e reduzida nos períodos de 14 e 21 dias em C3, evidenciando que a ação da MMP-2 nestes osteoblastos estão acopladas de forma distinta a diferentes pontos de restrição durante a progressão da diferenciação celular. A dualidade das respostas ao flúor apresentadas pelos modelos experimentais indica que a influência da ação anabólica do flúor, depende do número de alvos em potencial (quantidade de osteoprogenitores presentes na calvária, de células mesenquimais presentes na medula), da atividade intrínseca destes osteoblastos e do estágio de maturação dessas células. Desta forma, a abordagem in vitro fornece insights sobre as bases celulares e moleculares, o que permitirá um melhor diagnóstico e avaliação dos alvos terapêuticos. / Fluoride is a natural element found at varying concentrations in drinking water as well as in soil and it is considered a beneficial nutrient at optimal levels. However, although it is well recognized that the fluoride therapy is effective in increasing bone density and it has been used as therapeutic agent to treat osteoporosis, the efficacy in fracture reduction is highly controversial, and exposure to high levels and prolonged time can lead to skeletal fluorosis. The purpose of this study was to investigate the in vitro effects of fluoride exposure during mineralization of two inbread strains, C3H/HeJ (C3) and C57BL/6J (B6), with high and low bone mass respectively. The osteoblasts isolated from newborn mouse calvaria were exposed to several fluoride doses, and the results showed that B6 was more susceptible to NaF, as a reduction in the mineralized area with 10M was already seen; while in C3, the significative dose was with 50 M, indicating that more differentiated osteoprogenitors cells of C3 are more resilient to inhibitory fluoride action. The colony forming unit assays indicate an increase of colony numbers of osteoprogenitors cells and mineralized nodules with NaF treatment. The MMP-2 activity was up-regulated after 7 days of NaF exposure in B6 e down-regulated after 14 and 21 days in C3, showing the distinct coupled action of MMP-2 in different restrictions point during development sequence. The bifasic nature of fluoride responses present by these experimental models indicate that the anabolic action of fluoride is associated to the number of the potential targets (numbers of calvarial osteoprogenitors cells, mesenchymal stem cells), the intrinsic osteoblast activity and the maturation stage of these cells. The cell culture systems can provide molecular and cellular insights, and have the prospective to disclose potential targets and/or better efficacy and safety profile.

Submitted by Leonardo Cavalcante (leo.ocavalcante@gmail.com) on 2018-04-23T22:33:49Z No. of bitstreams: 1 Arquivototal.pdf: 8097104 bytes, checksum: 8976cc960e57607b6bc0686e00fc41c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-23T22:33:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arquivototal.pdf: 8097104 bytes, checksum: 8976cc960e57607b6bc0686e00fc41c3 (MD5) Previous issue date: 2016-04-01 / Skeletal fluorosis is a chronic metabolic disorder caused by chronic ingestion or inhalation of high concentrations of fluoride. The main consequences are bone alterations and deformities leading to disability. It is a disease of difficult diagnosis because of its pre-clinical signs resembling other bone diseases. In this sense, this epidemiological, observational, transversal and descriptive study aimed at mapping clinical, radiological and molecular biomarkers of exposure. Initially the sample consisted of 103 individuals of both sexes and varied ages. From the total, 45 individuals were analyzed for the identification of the radiological biomarker and 25 individuals were monitored for the biochemical and proteomic markers. For the analysis of fluoride intake in the region, drinking water was collected and the biomarkers were evaluated. As for identification of the samples regarding fluoride exposure: 25 hours urine analysis was performed through the direct method using TISAB II and III on an specific electrode and for the fluoride dosage on fingernail and hair the analysis was done though the indirect method (HMDS). The radiographs were carried out on a Kodak K 9000 C 3d apparatus (by the same operator) with exposure of 16 S, 10 Ma, 60-70 kvp and the maximum skin intake (DEP) of 5 mgy. The volunteers underwent digital panoramic radiographs under same circumstances. For biochemical parameters it was performed a complete blood count, hormonal dosage, calcium and enzymes dosage (creatinine and alkaline phosphatase). For the proteomic identification it was performed a mass spectrophotometry (MALDI-TOF). Data were analyzed on the statistical package for social sciences (SPSS), version 18, using p<0.05. The results pointed out that 46% of the drinking water from São João do Peixe River presented [F] above the ideal value for human consumption of 0.7mg/L and 84% showed values above 1.5mg/L, being indicative of fluorosis in the region. The average age of the volunteers was 50 years, with the prevalence of women, and they showed a time of exposure around 40 years. Regarding the symptomatology 85 individuals reported pain, of which 77% (chi-squared) presented symptoms on more than 3 regions. However, the lumbar region was the indicative variable of presence of bone fluorosis (linear regression, p < 0.005). As for the radiological biomarker, it was verified that the most discriminatory bone conditions were osteopenia, ossification of soft tissues, bone deformit ies, jaw density, and thin cortical of jaw and jaw. There was evaluation divergence between orthodontists and radiologist. Panoramic radiographs proved to be an auxiliaar method of diagnosis and can only be an indicative of bone changes related to skeletal fluorosis, it cannot be discriminatory in cases of grades I and II skeletal fluorosis. The biochemical variables showed that the average volume of urine excreted was 890 ml in 24 hours, whose concentration contained an average of 3.9 mgF/liter (0.2-3.2 VR), presenting a high fluoride excretion. The average fluoride concentration on fingernails was 14.2 being the highest level ever recorded, probably due to the diffusion capture of F by the HMDS. Serum calcium had an average of 9.0 mg/dl (8.9 -10, 3VR); phosphorus, 3.8 mg/dl (2.4-4.7 VR); alkaline phosphatase, 288 IU/litre (32-91 VR); Alkaline phosphatase bone specific, 96 ug/litre (4.5-16.9 VR); Osteocalcin, 309 ng/ml (11-50 VR); and PTH, 203 pg/ml (10-65 VR). Electrolytes, glucose, albumin, urea and creatinine were with 70% normal, as well as platelet count. Among the sick and non-patient studied groups, there were no differences between the groups, according to the Mann-Whitney test, p < 0.05. For proteomics analysis, there was a large quantity of proteins in the serum, being the affected volunteers more altered when compared to the other group. Few proteins were found on the saliva. Data indicate that mass spectrophotometry is capable of detecting differential proteins so it can be useful for fluoride biomarkers identification as well as it can help understand the skeletal fluorosis mechanism. / A fluorose ó ssea é uma doença metabólica crônica, causada pela alta concentração do flúor ingerido ou inalado. Tem como principal consequência alterações e deformidades ó sseas levando a incapacidade. Mordidade de difíc il diagnó stico, devido aos sinais pré- clínicos assemelhar-se a de outras doenç as ó sseas, gerando problemas para a realizaç ão do diagnó stico. Neste sentido, este estudo epidemiológico, observacional, transversal e descritivo teve como objetivo mapear biomarcadores de exposiç ão, clínicos, radiológicos e moleculares para fluorose ó ssea . A amostra constitui inicialmente de 103 indivíduos de ambos os sexos e variadas faixas etárias. Sendo 45 analisados quanto a identificaç ão do biomarcador radiológico e 25 monitorados quanto ao marcador bioquímico e proteô mico. Para investigaç ão das concentraç ões de ingestão de flúor na região foi realizada a coleta de água para consumo e para identificaç ão das amostras quanto a exposiç ão ao fluoreto foram avaliados os biomarcadores: urina (25 horas) ambos realizado através do método direto com TISAB II e III respectivamente e a dosagem da unha e cabelo, pelo meio indireto por difusão com hexametildisiloxano (HMDS). As radiografias foram realizadas em aparelho Kodak K 9000 C 3D (pelo mesmo operador) com exposiç ão de 16 s, 10 mA, 60- 70 Kvp e dose de entrada de pele (DEP) máxima de 5 mGy. Os indivíduos foram submetidos a radiografias panorâ micas (digital) em aparelhos de RX do mesmo modelo e em condiç ões similares. Para os parâ metros bioquímicos foram realizados hemograma completo, dosagem hormonal, dosagem de cá lcio e enzimologia (creatina e fosfatase alcalina). Para identificaç ão de proteomas utilizou-se espectometria de massa (MALDI- TOF). Os dados foram avaliados por meio do Programa Statistical Package for Social Sciences (SPSS) versão 18, com p<0,005. Os resultados apontaram que 46% da água presente em poç os artesianos em São João do Rio do Peixe-PB, apresentam [F] acima do valor ideal de 0,7mg/L para ingestão de água para consumo humano e 84% aponta valores acima de1,5mg/L, sendo indicativo de fluorose na região. A média de idade foi de 50 anos, com predomínio de mulheres, a amostra apresentou um tempo de exposiç ão em torno de 40 anos. Quanto a sintomatologia 85 relataram dor, destes 77% (qui-quadrado), apresentam mais de 3 regiões acometidas. Porém a região lombar foi a variável indicativa de presenç a de fluorose ó ssea (regressão linerar, p<0,005). No que concerne o biomarcador radiológico, verifica-se que as condiç ões ó sseas mais discriminantes: osteopenia, ossificaç ão dos tecidos moles, deformidades ó sseas, densidade da maxila, e cortical fina de maxila e mandíbula. Houve divergê ncia na avaliaç ão entre ortodontistas e radiologias. A radiografia panorâ mica se mostrou como um recurso auxiliar e apenas indicativa de alteraç ões ó sseas relacionadas com a fluorose ó ssea, não podendo ser discriminató ria nos casos de fluorose ó ssea de graus I e II. Quanto as biomarcadores de exposiç ão foi evidenciado. As variáveis bioquímicas que o volume médio excretado foi de 890 ml em 24 h, cuja concentraç ão continha uma média de 3,9 mg / litro F (0,2-3,2 VR), constatando uma excreç ão elevada. A concentraç ão média da unha encontrado foi de 14,2 sendo o mais elevado nível de concentraç ão já registrada, provavelmente devido à captura de difusão de F pelo HMDS.Cá lcio sérico teve uma média de 9,0 mg / dl (8,9-10,3VR); fó sforo, 3,8 mg / dl (2,4-4,7 VR); fosfatase alcalina, 288 UI / litro (32-91 VR); específica do osso da fosfatase alcalina, 96 ug / litro (4,5-16,9 VR); osteocalcina, 309 ng /ml (11-50 VR); e PTH, 203 pg/ml (10-65 VR). Eletró litos, glicose, albumina, uré ia e creatina estavam com 70% normais, assim como contagem de plaquetas. Entre os grupos estudados doentes e não doentes, não houve diferenç as entre os grupos, segundo o teste de Mann-Whitney, p<0,05. Para aná lise proteô mica, verificou-se a presenç a de uma grande quantidade de proteínas no soro, estando os doentes mais alterado quando comparado com o outro grupo. A saliva poucas proteínas foram encontradas. Os dados indicam que a espectometria de massa é capaz de detectar proteínas diferecialmente expressa. Podendo ser útil para identificaç ão de biomarcadores para F, além de ajudar no avanç o do mecanismo envolvido da fluorose ó ssea.

O flúor é um elemento natural encontrado em diversas concentrações tanto na água como no solo. É considerado um nutriente benéfico quando presente em níveis ótimos. Apesar de ser utilizado como medicamento em pacientes com osteoporose, sendo capaz de aumentar a densidade óssea, sua eficácia na redução de fraturas ainda apresenta muitas controvérsias, e a exposição a altos níveis e por tempo prolongado, pode levar à fluorose esquelética. Dessa forma o objetivo deste trabalho foi estudar in vitro o efeito do flúor no processo de mineralização por osteoblastos de duas espécies de camundongos com maior e menor densidade óssea, C3H/HeJ (C3) e C57BL/6J (B6) respectivamente. Os osteoblastos isolados da calvária através da digestão enzimática de animais recém nascidos foram expostos a diferentes doses de NaF, e os resultados mostraram que B6 foi mais suscetível ao NaF, apresentando redução da área mineralizada a partir da dose de 10M, enquanto que com C3, a dose significativa foi a partir de 50M, demonstrando que os osteoprogenitores mais diferenciados de C3, são mais resistentes à ação inibitória do flúor. Os testes de unidades formadoras de colônias indicaram um aumento do número de colônias de osteoprogenitores e do número de nódulos mineralizados com a exposição ao NaF. A atividade da metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) também foi aumentada no período de 7 dias em B6 e reduzida nos períodos de 14 e 21 dias em C3, evidenciando que a ação da MMP-2 nestes osteoblastos estão acopladas de forma distinta a diferentes pontos de restrição durante a progressão da diferenciação celular. A dualidade das respostas ao flúor apresentadas pelos modelos experimentais indica que a influência da ação anabólica do flúor, depende do número de alvos em potencial (quantidade de osteoprogenitores presentes na calvária, de células mesenquimais presentes na medula), da atividade intrínseca destes osteoblastos e do estágio de maturação dessas células. Desta forma, a abordagem in vitro fornece insights sobre as bases celulares e moleculares, o que permitirá um melhor diagnóstico e avaliação dos alvos terapêuticos. / Fluoride is a natural element found at varying concentrations in drinking water as well as in soil and it is considered a beneficial nutrient at optimal levels. However, although it is well recognized that the fluoride therapy is effective in increasing bone density and it has been used as therapeutic agent to treat osteoporosis, the efficacy in fracture reduction is highly controversial, and exposure to high levels and prolonged time can lead to skeletal fluorosis. The purpose of this study was to investigate the in vitro effects of fluoride exposure during mineralization of two inbread strains, C3H/HeJ (C3) and C57BL/6J (B6), with high and low bone mass respectively. The osteoblasts isolated from newborn mouse calvaria were exposed to several fluoride doses, and the results showed that B6 was more susceptible to NaF, as a reduction in the mineralized area with 10M was already seen; while in C3, the significative dose was with 50 M, indicating that more differentiated osteoprogenitors cells of C3 are more resilient to inhibitory fluoride action. The colony forming unit assays indicate an increase of colony numbers of osteoprogenitors cells and mineralized nodules with NaF treatment. The MMP-2 activity was up-regulated after 7 days of NaF exposure in B6 e down-regulated after 14 and 21 days in C3, showing the distinct coupled action of MMP-2 in different restrictions point during development sequence. The bifasic nature of fluoride responses present by these experimental models indicate that the anabolic action of fluoride is associated to the number of the potential targets (numbers of calvarial osteoprogenitors cells, mesenchymal stem cells), the intrinsic osteoblast activity and the maturation stage of these cells. The cell culture systems can provide molecular and cellular insights, and have the prospective to disclose potential targets and/or better efficacy and safety profile.