Die Arbeit befasst sich mit den Auswirkungen eines pränatal gesetzten Leberschadens auf die Fertilität adulter weiblicher Mäuse. Es wurden die Ovarien und Vaginen von Mäusen histologisch untersucht, bei welchen es durch einen leberspezifischen, embryonalen Knock-out (KO) des Membranproteins Smoothened und daraus folgender Ausschaltung des Hedgehog- (Hh-) Signaltransduktionswegs in der fetalen Leber unter anderem zu einer Infertilität der homozygoten, weiblichen KO-Mäuse kam. Die Vaginalhistologie der KO-Mäuse weist auf einen fehlenden Ovarialzyklus hin. Die Ovarien sind signifikant kleiner als die Ovarien der Wildtyp-Mäuse und zeigen ein vollständiges Fehlen von Gelbkörpern. Die Anzahl der heranwachsenden und reifenden Follikel ist eher erniedrigt und die Atresierate in den Gonadotropin-abhängigen Follikeln mit Durchmesser > 249 µm ist signifikant erhöht. Unter den größten Gonadotropin-abhängigen Follikeln > 350 µm im Durchmesser beträgt die Atresierate 100 %. Das ovarielle Stroma besteht aus hellen, großen, in Ballen zusammenliegenden Zellen. In der Leber findet sich eine gesteigerte Expression des Enzyms 17alpha-Hydroxylase bzw. 17/ 20-Lyase (CYP17A1) und damit ein erhöhter Spiegel des Androgens Dehydroepiandrostendion (DHEA) im Serum. Das Enzym 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase, welches die weitere Umsetzung von DHEA katalysiert, wird zudem vermindert exprimiert. Die Konzentration des Insulin-like growth factors 1 (IGF-1) im Serum ist signifikant erniedrigt, während die Konzentration seines Bindungsproteins IGFBP-1 im Serum erhöht ist. Diese Befunde sprechen für eine schwere, am ehesten hormonell bedingte Störung der terminalen Follikelreifung mit daraus folgender Anovulation und Infertilität. Insgesamt finden sich Veränderungen, welche Ähnlichkeiten zum polyzystischen Ovarsyndrom (PCOS) beim Menschen zeigen, welches unter anderem durch Anovulation und Hyperandrogenämie gekennzeichnet ist. Zudem könnte dieses Mausmodell einen Einblick in die systemischen Einflüsse des hepatischen Hh-Signaltransduktionswegs bieten.

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<p>The formation of a single lumen during tubulogenesis is crucial for the development and function of many organs. Although 3D cell culture models have identified molecular mechanisms controlling lumen formation in vitro, their function during vertebrate organogenesis is poorly understood. In this work we used the zebrafish gut as a model to investigate single lumen formation during tubulogenesis. Previous work has shown that multiple small lumens enlarge through fluid accumulation and coalesce into a single lumen. However, since lumen formation occurs in the absence of apoptosis, other cellular processes are necessary to facilitate single lumen formation. </p><p>Using light sheet microscopy and genetic approaches we identified a distinct intermediate stage in lumen formation, characterized by two adjacent un-fused lumens. These lumens are separated by cell contacts that contain basolateral adhesion proteins. We observed that lumens arise independently from each other along the length of the gut and do not share a continuous apical surface. Resolution of this intermediate phenotype into a single, continuous lumen requires the remodeling of basolateral contacts between adjacent lumens and subsequent lumen fusion. </p><p>Furthermore, we provide insight into the genetic mechanisms regulating lumen formation through the analysis of the Hedgehog pathway. We show that lumen resolution, but not lumen opening, is impaired in <italic>smoothened (smo)</italic> mutants, indicating that fluid-driven lumen enlargement and resolution are two distinct processes. We also show that <italic>smo</italic> mutants exhibit perturbations in the Rab11 trafficking pathway, which led us to demonstrate that Rab11-mediated recycling, but not degradation, is necessary for single lumen formation. Taken together, this work demonstrates that lumen resolution is a distinct genetically-controlled process, requiring cellular rearrangement and lumen fusion events, to create a single, continuous lumen in the zebrafish gut.</p> / Dissertation

La voie de signalisation Sonic Hedgehog (Shh) joue un rôle fondamental au cours de l’embryogenèse pour la mise en place de nombreux tissus. Elle persiste à l’âge adulte et régulerait notamment le contrôle de fonctions cérébrales. Son activation requiert la liaison d’un peptide Shh sur le récepteur Patched (Ptc) qui réprime l’activité constitutive de Smoothened (Smo), un récepteur apparenté à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Récemment, des essais cliniques pour le traitement de médulloblastomes et de diverses tumeurs solides chez l’Homme ont été menés avec des antagonistes de Smo. Cependant, ces molécules ont révélé des limitations à leur utilisation puisque des résistances au traitement sont apparues. Le travail de cette thèse a conduit au développement d’un modèle pharmacophorique des antagonistes de Smo qui a ensuite permis le criblage virtuel d’une banque de molécules et l’identification de nouvelles familles d’antagonistes de Smo. L’acylthiourée MRT-10 et l’acylurée MRT-14 ont été les deux premiers composés caractérisés. Des études de relations structure-activité ont permis l’identification d’une nouvelle famille d’inhibiteurs du récepteur Smo de haute affinité à laquelle l’acylguanidine MRT-83 appartient. Ce composé s’adapte parfaitement au modèle pharmacophorique des antagonistes de Smo. Les modifications structurales que MRT-83 présentes en comparaison avec les deux têtes de séries précédemment caractérisées sont à l’origine du gain d’activité de MRT-83 sur de nombreux tests cellulaires mettant en jeu l’activation de la voie Shh. Le composé MRT-83 inhibe la liaison de la BODIPY-cyclopamine sur le récepteur Smo humain et bloque la prolifération des précurseurs des cellules granulaires de rat avec une affinité de l’ordre du nanomolaire, comparable à celle des antagonistes de référence de Smo tels que le GDC-0449 et le LDE-225. Malgré l’homologie de séquence entre Smo et la famille des récepteurs Frizzled impliqués dans la signalisation Wnt, le composé MRT-83 ne présente aucun effet sur la voie Wnt. MRT-83 bloque la translocation de Smo dans le cil primaire induite par l’activation de la voie Shh dans les cellules NT2, une lignée issue d’un tératocarcinome humain, contrairement à l’antagoniste de Smo de référence, la cyclopamine qui induit l’adressage du récepteur dans le cil primaire. L’injection stéréotaxique dans le ventricule latéral de cerveau de souris adulte de MRT-83, contrairement à celle d’un composé de structure analogue, dépourvu d’activité sur Smo, inhibe l’expression des transcrits de Ptc induite par l’injection de Shh dans la zone sous-ventriculaire, l’une des deux principales aires de neurogenèse adulte. Ces résultats démontrent que les dérivés MRT bloquent également la signalisation Shh in vivo. Ainsi, les composés MRT-10, MRT-14, MRT-83 et les molécules de structure analogues caractérisées sont de puissants antagonistes de Smo. Ces molécules constituent de nouveaux outils pharmacologiques qui pourraient permettre d’améliorer notre compréhension des mécanismes moléculaires et biochimiques régulant la signalisation Hh et permettre le développement de nouvelles molécules en clinique pour le traitement des tumeurs Hh-dépendantes. / The Sonic Hedgehog (Shh) signaling pathway is implicated in multiple physiological responses including the control of brain functions. In mammals, the Shh pathway is expressed at the primary cilium and its activation requires the binding of a Shh peptide to the Patched (Ptc) receptor which represses the constitutive activity of Smoothened (Smo), a proposed member of the G-protein-coupled receptor (GPCR) family. Recently, clinical trials for treating medulloblastoma and various solid tumors in human have been conducted with Smo antagonists such as GDC-0449 or LDE-225. Such molecules may have some limitations leading to treatment resistance. In the present work, the development of a pharmacophoric model of Smo antagonists allowed a virtual screening strategy to identify novel Smo inhibitors. The acylthiourea MRT-10 and the acylurea MRT-14 were the two first leads identified. Structure-activity relationship experiments led to the discovery of new series of Smo inhibitors with high potency and to which the acylguanidine MRT-83 belongs. This inhibitor perfectly fits with the proposed pharmacophoric model for Smo antagonists. The discrete structural differences between MRT-83 and the original leads may account for the increased potency of MRT-83 observed in various in vitro Shh-based assays. MRT-83 inhibits BODIPY-cyclopamine binding to human Smo and Shh-mediated proliferation of rat granule cell proliferation with nanomolar potency similar to GDC-0449 or LDE-225. Despite significant homology of Smo with the Frizzled family of receptors which are involved in the Wnt signaling pathway, MRT-83 displays no significant effect on this pathway. MRT-83 blocks Smo translocation induced by Shh pathway activation to the primary cilia of NT2 cells that derive from a pluripotent testicular carcinoma whereas cyclopamine, a reference Smo antagonist, induces Smo accumulation of Smo signals at the primary cilium. Therefore, it might be anticipated that MRT-83, like GDC-0449 and LDE-225, interacts with Smo in a manner different from that of cyclopamine, suggesting that while their binding sites are overlapping, they are not identical. Stereotaxic injection of MRT-83 into the lateral ventricle of adult mice but not of a structurally-related compound inactive at Smo, abolished upregulation of Ptc transcription induced by Shh in the neighboring subventricular zone, one of the two main neurogenic areas of the adult brain. These data demonstrate that MRT derivatives efficiently antagonize Shh signaling in vivo. Thus, MRT-10, MRT-14, MRT-83 and structurally-related molecules are potent Smo antagonists. These compounds should be useful for clarifying the molecular and biochemical mechanisms underlying the resistance of Smo inhibitors in brain cancer cells and may help develop new therapies against Shh pathway-related brain diseases.

La voie de signalisation Hedgehog (Hh) joue un rôle fondamental au cours du développement embryonnaire et participe au maintien des niches neurogéniques dans le cerveau adulte (Ruat et al, 2015). Son activation requiert la liaison d’un peptide Hh sur le récepteur Patched (Ptc) qui réprime l’activité constitutive de Smoothened (Smo), un membre de la classe F des récepteurs couplés aux protéines G (Wang et al, 2013). La dérégulation de la voie Hh peut conduire au développement de tumeurs, comme les médulloblastomes ou les carcinomes basocellulaires. Des agonistes et des antagonistes de Smo ont été développés et présentent un intérêt thérapeutique dans le traitement des maladies neurodégénératives et des tumeurs Hh-dépendantes, respectivement (Ruat and Hoch, 2015). Les études cristallographiques du Smo humain (hSmo) complexé à différents ligands ont identifié deux types d’antagonistes ; ceux se liant principalement aux boucles extracellulaires de Smo (site 1, comme le LY2940680) et ceux se liant plus profondément dans la cavité transmembranaire (site 2, comme le SANT 1) (Ruat et al, 2014).Mes travaux de thèse ont conduit à la caractérisation du composé acylguanidine MRT-92, l’un des plus puissants antagonistes du récepteur Smo. Le MRT-92 inhibe différentes réponses biologiques induites par l’activation de la voie Hh, notamment la prolifération des précurseurs des cellules granulaires du cervelet de rat avec une affinité sub-nanomolaire. Le MRT 92 bloque aussi la translocation de Smo dans le cil primaire induite par l’activation de la voie Hh. Le développement de sa forme tritiée [3H]MRT-92 (Kd = 0.3 nM pour hSmo) a permis d’étudier les interactions des modulateurs avec le récepteur hSmo et d’analyser les résistances associées aux mutations de hSmo. Le composé MRT 92 se lie au récepteur hSmoD473H, résistant au traitement par le GDC-0449, suggérant son intérêt thérapeutique pour le traitement de cette résistance. Par une modélisation moléculaire et une étude de mutagenèse, j’ai identifié que le MRT-92 se lie sur un nouveau site au niveau du domaine transmembranaire de Smo qui se superpose aux sites 1 et 2 préalablement décrits. Le développement d’un modèle pharmacophorique des agonistes de Smo a permis le criblage virtuel d’une banque de molécules et l’identification du composé quinolone GSA-10. Le GSA-10 stimule une voie Hh non canonique qui permet la différenciation des cellules mésenchymateuses C3H10T1/2 en ostéoblastes en se fixant au récepteur Smo. Contrairement au composé SAG, agoniste de référence de Smo, le GSA-10 n’induit pas de prolifération cellulaire des cellules granulaires du cervelet de rat et n’augmente pas la transcription des gènes cibles de la voie tels que Gli1 et Ptc. Le GSA-10 est la première molécule agoniste de Smo qui n’induit pas sa translocation au cil primaire. De plus, nous avons observé que la forskoline, un inhibiteur de l’adénylate cyclase, est un régulateur positif et négatif de la différenciation ostéoblastique induite par le GSA-10 et le SAG, respectivement. Le GSA-10 nous a également permis de mettre en évidence deux formes conformationnelles de Smo, SmoSAG et SmoGSA-10, pouvant être discriminées pharmacologiquement par les antagonistes de Smo. Plusieurs antagonistes comme le GDC-0449, le CUR61414, la cyclopamine ou le MRT-92 perdent leur sensibilité pour inhiber le SmoGSA-10. L’ensemble de ce travail a conduit au développement de nouveaux outils pharmacologiques qui pourraient permettre d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans la modulation de l’activité du récepteur Smo et permettre le développement de nouvelles molécules en clinique pour le traitement des tumeurs du cerveau Hh-dépendantes. / The Hedgehog (Hh) signaling pathway plays a critical role during embryogenesis and participates to the maintenance of neural stem cells in the adult brain (Ruat et al, 2015). Its activation requires the binding of a Hh peptide to its receptor Patched (Ptc) which represses the constitutive activity of Smoothened (Smo), a member of class F G-protein-coupled receptors (Wang et al, 2013). Deregulation of the Hh pathway is associated with the development of tumors, such as medulloblastoma and basal cell carcinoma. Agonists and antagonists of Smo are candidates for the treatment of degenerative diseases and Hh-linked tumors, respectively (Ruat and Hoch, 2015). Crystallization studies of human Smo (hSmo) bound to different ligands have identified two types of 7 transmembrane-directed antagonists : those binding mostly to extracellular loops (site 1, e.g., LY2940680) and those penetrating deeply in the 7-transmembrane cavity (site 2, e.g., SANT-1) (Ruat et al, 2014).The present work allowed the caracterization of the acylguanidine MRT-92, one of the most potent Smo antagonist. MRT-92 inhibits Smo induced-responses in different cell-based assays, notably the proliferation of rat cerebellar granule cell with nanomolar potency. We developed its tritiated derivative [3H]MRT-92 (Kd= 0.3 nM for hSmo) for creating a comprehensive framework for the interaction of small molecule modulators with hSmo and for understanding chemoresistance linked to hSmo mutations. MRT-92 binds to the mutated hSmoD473H receptor resistant to GDC-0449 treatment, suggesting its therapeutic interest for the treatment of this resistance. Guided by molecular docking and site-directed mutagenesis data, we demonstrated the existence of a third type of Smo antagonists represented by MRT 92 that simultaneously recognized and occupied both sites 1 and 2.The development of a pharmacophoric model of Smo agonists allowed a virtual screening strategy to identify the GSA-10 compound, a quinolinecarboxamide. GSA-10 stimulates a non-canonical Hh pathway allowing C3H10T1/2 mesenchymal cells differentiation into osteoblasts. However, GSA-10 does not induce Gli-dependent reporter gene transcription nor rat cerebellar granule cell proliferation, and it does not regulate the subcellular localization of Smo at the primary cilium. Moreover, we observed that forskolin, a known activator of adenylate cyclase, is a positive and negative regulator of GSA-10 and SAG-mediated cell differentiation, respectively. Our data provide also evidences for two different conformational forms of Smo named SmoSAG and SmoGSA-10, which can be pharmacologically discriminate by Smo antagonists. Different antagonists including GDC 0449, CUR61414, Cyclopamine and MRT-92 loose their sensibility to inhibit SmoGSA-10.The present work allowed the identification of new pharmacological tools which should be useful for understanding the mechanisms underlying the resistance of Smo inhibitors in cancer cells and may help to design new therapies with improved pharmacological properties for treating Hh-linked brain tumors.

Hedgehog is a lipid-linked morphogen that is carried on lipoprotein particles and that regulates both patterning and proliferation in a wide variety of vertebrate and invertebrate tissues. Hyperactivity of Hedgehog signaling causes numerous forms of cancer. Hedgehog acts by binding to its receptor Patched, relieving the suppression of Smoothened and initiating Smoothened signaling. The mechanism by which Patched represses Smoothened has been unclear, but correlates with reduced Smoothened levels on the basolateral membrane. The structural homology of Patched with the Niemann-Pick-Type C1 protein and bacterial transmembrane transporters suggests that Patched might regulate lipid trafficking to repress Smoothened. However, no endogenous lipid regulators of Smoothened have yet been identified, nor has it ever been shown that Patched actually controls lipid trafficking. This work shows that, in Drosophila melanogaster, the Sterol-Sensing Domain of Patched regulates Smoothened trafficking from Patched-positive endosomes. Furthermore, it demonstrates that Patched recruits internalized lipoproteins to Patched-positive endosomes. Thereby, Patched regulates the efflux of specific lipoprotein-derived lipids from this compartment via its Sterol-Sensing Domain and utilizes these lipids to destabilize Smoothened on the basolateral membrane. We propose that Patched normally promotes Smoothened degradation and subsequently downregulates its activity by changing the lipid composition of endosomes through which Smoothened passes. For this purpose, Patched utilizes a specific lipid – possibly a modified sterol or sphingolipid – derived from lipoproteins. Further, we suggest that the presence of Hedgehog on lipoprotein particles inhibits utilization of their lipids by Patched.

The Hedgehog signalling pathway is an essential developmental pathway present in all bilaterians that is involved in embryogenesis, body patterning and stem cell homeostasis. Dysregulation of the Hh pathway leads to various kinds of cancer, such as basal cell carcinoma and medulloblastoma. Smoothened (SMO), a Frizzled-type G-protein coupled receptor (GPCR), is the essential transmembrane signal transducer within the Hh pathway, conveying the signal from the upstream transmembrane protein, Patched1 (Ptc1), to the downstream intracellular proteins. The mechanisms by which SMO transmits the Hh signal from the extracellular environment, through the plasma membrane and to the intracellular proteins are not known. In this thesis, I present my work into the structural and functional characterisation of the extracellular and transmembrane domains (TMD) of human SMO in order to better understand the molecular mechanisms of its signal transduction. The extracellular region of SMO contains a highly conserved cysteine-rich domain (CRD) and a linker domain (LD). I present the first crystal structure of the CRD, LD and TMD of SMO, which is also the first crystal structure of a GPCR with a large functional extracellular domain. This structure revealed a domain architecture for SMO that enables regulation of its transmembrane domain by its extracellular domains. It also revealed a cholesterol molecule bound to the CRD, which we subsequently determined to be a new endogenous small-molecule agonist for SMO. I present five further structures of SMO bound to different small molecule agonists and antagonists. Together, these structures demonstrate that the position of the CRD relative to the TMD reflects the activation state of SMO. We also generated nanobodies against the extracellular region of SMO in order to stabilise its conformation. These studies not only improve our understanding of the workings of a key transmembrane protein within a fundamental signalling pathway but will also aid efforts to develop better therapeutics for an important cancer target.

In the vertebrate retina, bipolar interneurons consist of at least 13 distinct subtypes, which are classified based on their morphology, behavior and gene expression. The mechanisms underlying the formation of these subtypes is poorly understood. Our previous unpublished work has implicated Sonic Hedgehog (Shh) in the formation of cone and rod bipolar cell subtypes. In this thesis, I characterized the relationship between Hh signaling and bipolar subtype cell development in greater detail. Using an in vivo plasmid-based reporter approach, I show that Hh signaling is active in both retinal progenitor cells (RPCs) and bipolar cells of the postnatal retina. Next, to address function, I used a conditional gene targeting approach to show that activation of Smoothened (Smo), a downstream Hh signaling component, is both necessary and sufficient in postnatal RPCs to promote the formation of cone but not rod bipolar cells. In contrast, activation of Smo in postmitotic bipolar cells that are greater than 24 hours old from cell birth, does not affect bipolar subtype formation. Together, these results suggest that Hh signaling functions in postnatal RPCs (and potentially in early bipolar cell precursors) to promote cone bipolar cell formation. / Graduate / 2018-06-12

Die Arbeit befasst sich mit den Auswirkungen eines pränatal gesetzten Leberschadens auf die Fertilität adulter weiblicher Mäuse. Es wurden die Ovarien und Vaginen von Mäusen histologisch untersucht, bei welchen es durch einen leberspezifischen, embryonalen Knock-out (KO) des Membranproteins Smoothened und daraus folgender Ausschaltung des Hedgehog- (Hh-) Signaltransduktionswegs in der fetalen Leber unter anderem zu einer Infertilität der homozygoten, weiblichen KO-Mäuse kam. Die Vaginalhistologie der KO-Mäuse weist auf einen fehlenden Ovarialzyklus hin. Die Ovarien sind signifikant kleiner als die Ovarien der Wildtyp-Mäuse und zeigen ein vollständiges Fehlen von Gelbkörpern. Die Anzahl der heranwachsenden und reifenden Follikel ist eher erniedrigt und die Atresierate in den Gonadotropin-abhängigen Follikeln mit Durchmesser > 249 µm ist signifikant erhöht. Unter den größten Gonadotropin-abhängigen Follikeln > 350 µm im Durchmesser beträgt die Atresierate 100 %. Das ovarielle Stroma besteht aus hellen, großen, in Ballen zusammenliegenden Zellen. In der Leber findet sich eine gesteigerte Expression des Enzyms 17alpha-Hydroxylase bzw. 17/ 20-Lyase (CYP17A1) und damit ein erhöhter Spiegel des Androgens Dehydroepiandrostendion (DHEA) im Serum. Das Enzym 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase, welches die weitere Umsetzung von DHEA katalysiert, wird zudem vermindert exprimiert. Die Konzentration des Insulin-like growth factors 1 (IGF-1) im Serum ist signifikant erniedrigt, während die Konzentration seines Bindungsproteins IGFBP-1 im Serum erhöht ist. Diese Befunde sprechen für eine schwere, am ehesten hormonell bedingte Störung der terminalen Follikelreifung mit daraus folgender Anovulation und Infertilität. Insgesamt finden sich Veränderungen, welche Ähnlichkeiten zum polyzystischen Ovarsyndrom (PCOS) beim Menschen zeigen, welches unter anderem durch Anovulation und Hyperandrogenämie gekennzeichnet ist. Zudem könnte dieses Mausmodell einen Einblick in die systemischen Einflüsse des hepatischen Hh-Signaltransduktionswegs bieten.

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