Les cellules iNKT ont des propriétés régulatrices qui suscitent un intérêt particulier en immunopathologie. Mon travail de thèse a eu pour objectif de mesurer l'impact du défaut des cellules iNKT de la souris NOD dans deux situations auto-immunes : 1) le diabète de type 1, une maladie développée spontanément par la souris NOD dans laquelle nous avons montré que les cellules iNKT, tout en constituant des cibles thérapeutiques sous l'impulsion de leur ligand a-GalCer n'ont pas d'activité protectrice spontanée; 2) l'hépatite induite par la ConA, dont la moindre susceptibilité chez la souris NOD a révélé le caractère dominant du rôle délétère de la production d'IL-4 assurée surtout par les cellules iNKT spléniques et non hépatiques et qui est directement potentialisée par l'IL-12, une cytokine qui exacerbe la maladie. En conclusion, notre travail ouvre une nouvelle voie thérapeutique tout en illustrant le caractère ambivalent « mi ange, mi démon » des cellules iNKT en situation auto-immune.

Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune qui résulte en la destruction des cellules (ß des îlots de Langerhans par les cellules du système immunitaire. Des travaux précédents de notre laboratoire ont identifié la cytokine "Thymic Stromal Lymphopoietin" (TSLP) comme étant un stimulus tolérogénique pour les cellules dendritiques (DCs) chez le modèle murin du DT1, la souris "Non Obese Diabeiic" (NOD). Les DCs conditionnées à la TSLP (TSLP-DCs) présentent un phénotype semi-mature, sont capables d’induire une réponse Th2 ainsi qu’une conversion et une expansion des lymphocytes T régulateurs (Tregs) in vitro et protègent les souris NOD contre le DT1. Ces observations nous ont amené à investiguer les mécanismes qui entraînent cette protection contre le DT1. Les travaux décrits dans ce mémoire montrent que les TSLP-DCs injectées chez les souris NOD migrent vers la rate, de manière privilégiée. Ces observations nous ont amené à étudier l’influence des TSLP-DCs sur la réponse Th1/Th2 au niveau de la rate. Nous avons observé que les splénocytes CD4[indice supérieur +] et CD8[indice supérieur +] de souris injectées avec des TSLP-DCs exprimaient moins d’IFN? par rapport au souris témoins (splénocytes des souris injectées avec des LPS-DCs). Ces résultats suggèrent une diminution de la réponse Th1 chez ces splénocytes. Par contre, les résultats obtenus avec l’IL-10 ne nous ont pas permis de conclure quant à l’influence des TSLP-DCs sur la réponse Th2. Cependant, nous avons confirmé la capacité des TSLP-DCs à induire la conversion des lymphocytes T CD4[indice supérieur +]CD25[indice supérieur -] en Tregs CD4[indice supérieur +]CD25[indice supérieur +]Foxp3[indice supérieur +]. Nous avons aussi montré que ces Tregs partiellement convertis inhibent la prolifération de lymphocytes T 8.3-CD8[indice supérieur +] diabétogènes, et empêchent la production d’IFN?. Les Tregs convertis en présence de TSLP-DCs ou de LPS-DCs ont également été injectés à des souris 8.3-NOD.RAG2[indice supérieur -/-]. Les résultats ont révélé que seuls les Tregs différenciés en présence de TSLP-DCs ont la capacité d’empêcher le développement du DT1. Nos travaux suggèrent que la diminution de la réponse Th1 et l’induction d’une population efficiente de lymphocytes Tregs font partie des mécanismes utilisés par les TSLP-DCs pour protéger les souris NOD contre le DT1.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La maladie de Fabry est une maladie lysosomale présentant une grande hétérogénéité phénotypique et génotypique. Elle est causée par des mutations au niveau du gène GLA, situé sur le chromosome X, entrainant un déficit de l'enzyme alpha-galactosidase A. Celui-ci mène à une accumulation de globotriaosylcéramide (Gb3), de globotriaosylsphingosine (lyso-Gb3) et de galabiosylcéramide (Ga2) et leurs isoformes et analogues respectifs qui sont utilisés comme biomarqueurs pour la maladie de Fabry. Il est possible de les quantifier dans les liquides biologiques tels que le plasma et l’urine des patients. Le principal traitement consiste en une thérapie d’enzyme de remplacement (TER) qui n’est pas efficace pour tous les patients, car des complications peuvent survenir suite à une réponse auto-immune contre l’enzyme infusée. Le développement d’autres thérapies est au coeur de la recherche actuelle. La thérapie génique à l’aide d’un vecteur viral pour cette maladie lysosomale est en développement au Canada. Un modèle de souris NOD/SCID/Fabry (NSF) a été généré pour le développement du vecteur viral, la compréhension de la distribution des biomarqueurs au niveau des tissus de différents organes et l’évaluation des effets du traitement. Ce modèle est une souris avec une inactivation complète du gène GLA ainsi que l’absence de système immunitaire. Les objectifs du projet de maîtrise étaient donc de: 1) développer et valider une méthode pour l’homogénéisation des tissus, l’extraction et le dosage du Gb3 et ses isoformes/analogues dans les tissus de différents organes de souris Fabry et souris contrôles à l’aide de la chromatographie liquide ultra performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (UPLC-MS/MS); 2) comparer les profils de distribution des biomarqueurs dans différents organes pour des souris atteintes de la maladie de Fabry et des souris contrôles. L’analyse des souris NSF a permis d’établir un profil de biomarqueurs comportant jusqu’à 22 isoformes pour chaque organe et de mettre en évidence des différences significatives entre la distribution du Gb3 dans lesdits organes. La quantité la plus élevée de Gb3 se retrouve au niveau de la rate, suivis du petit intestin, des reins, des poumons, du coeur, du foie et du cerveau. Les isoformes formés d’un acide gras sans insaturation sont les plus abondants dans l’ensemble des organes. Un transfert technologique sera effectué pour l’analyse des biomarqueurs dans des échantillons de plasma de patients Fabry ayant reçu la thérapie génique. En conclusion, la méthode mise au point est sensible et offre un outil efficace pour l’analyse des tissus de différents organes de souris par la production d’un profil de biomarqueurs, ce qui peut aussi mener à de meilleurs outils pour monitorer les patients atteints de la maladie de Fabry.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Le système immunitaire joue un rôle complexe, tantôt protecteur, tantôt facilitateur dans la relation hôte-tumeur. La souris transgénique pour le proto-oncogène humain RET développe un mélanome spontané et métastatique et constitue un remarquable modèle pour étudier les facteurs immunitaires et génétiques de la réponse de l’hôte. Ce modèle a été essentiellement examiné sur le fond C57BL/6. La tumeur primaire se situe au niveau de l’œil et se propage ensuite à la face et au dos ainsi qu’aux viscères. La pathogenèse du mélanome est cependant multifactorielle et le contexte génétique peut donc moduler de façon déterminante l’expression du transgène, la surveillance immunitaire et l’évolutivité des tumeurs. Par croisements en retour, nous avons transféré le transgène RET du fond génétique B6 sur le fond NOD (Non-Obese Diabetic), connu par sa propension à l’auto-immunité. Une accélération du développement tumoral a été observée chez les souris NOD.RET+, au site primitif et surtout à distance, par comparaison aux souris B6.RET+. L’objectif de ce travail était ensuite de caractériser les modifications immunitaires en relation avec le fond pro-inflammatoire de la souris NOD et l’accélération du développement tumoral. Nous avons observé une augmentation des cellules T régulatrices, CD4+Foxp3+ dans les tumeurs des souris NOD.RET+ comparées aux souris B6.RET+. Cette augmentation était corrélée avec celle des cellules CD8 exprimant l’interféron-gamma (IFNγ). Surtout, le phénotype agressif chez les souris NOD.RET+ était associé à une perte de l’expression de la Dectin-1 sur les cellules myéloïdes. La Dectin-1 est un récepteur de type C-lectine, connu pour son rôle essentiel dans la réponse anti-infectieuse. De ce fait, le traitement des souris avec le curdlan, un ligand de la Dectin-1, prévenait le développement des métastases. Par ailleurs, l’inactivation du gène Nos2, codant la synthase du monoxyde d’azote de type 2, protégeait également les souris vis-à-vis des métastases. De façon remarquable, l’expression de la Dectin-1 était restaurée chez les souris Nos2-KO, suggérant pour la première fois un lien entre ce récepteur et la voie Nos2. Parallèlement, une étude de la valeur pronostique de l’expression quantitative du gène NOS2 a été entreprise par qPCR sur des biopsies de tumeurs humaines obtenues chez 108 patients tunisiens (sein, n=27 ; côlon/Rectum, 24 ; cavum, 28 ; mélanome, 29). D’une façon générale, l’expression de NOS2 était plus élevée dans les tumeurs du sein comparées à celle du côlon et du cavum, et surtout aux mélanomes où NOS2 était faiblement exprimé. De plus, l’expression de NOS2 était plutôt de mauvais pronostic. En effet, elle était corrélée avec l’indice de Breslow, le niveau de Clark et le sous-type histologique dans les mélanomes. Dans le cancer du cavum, elle était corrélée avec l’âge, le stade TNM, la présence de métastases, la réponse au traitement et l’expression de COX-2. Dans les cancers coliques, elle était corrélée avec le stade TNM, la taille et la localisation des tumeurs et leur type histologique. Dans le cancer du sein, elle était associée avec la taille des tumeurs, le stade tumoral, le grade SBR et les cas triples négatifs. Notre étude a ainsi permis d’établir un nouveau modèle murin de mélanome spontané et agressif, la souris NOD.RET+, qui devrait permettre de mieux comprendre les facteurs de l’hôte qui influencent le pronostic des mélanomes murins et donc peut-être humains et plus généralement la relation hôte-tumeur. Par ailleurs, le rôle de NOS2 a été souligné et surtout relié à l’expression de la Dectin-1. Ces deux protéines pourraient constituer des cibles thérapeutiques intéressantes, d’autant plus que nous avons confirmé la valeur de mauvais pronostic de l’expression de NOS2 dans quatre cancers humains d’origine épithéliale. / Mice transgenic for the RET oncogene provide a remarkable model for investigating the mechanisms underlying the promotion and the development of melanoma. This model was established on the C57BL/6 genetic background. In the present study, we investigated an effect of the strongly proinflammatory and autoimmune genetic makeup of the non-obese diabetic (NOD) strain. We bred (NODxB6)F1 mice and backcrossed them with NOD mice. F1 mice and mice at subsequent generations of backcrossing showed marked acceleration of tumor development, in particular with a more frequent and earlier extension of the primary uveal melanoma. In close relation with this severe evolution, we observed a profound drop in Dectin-1 expression on CD11b+Ly6G+ granulocytic myeloid cells correlating with an expansion of CD4+Foxp3+ T regulatory cell and of interferon (IFN)-γ producing CD8+ T cell subsets in tumors. IFNγ is a major inducer of the type 2 nitric-oxide synthase (Nos2) gene whose products are known to be tumorigenic. Germline inactivation of the Nos2 gene was associated with a dramatically improved tumor prognosis and a restoration of Dectin-1 expression on myeloid cells. Moreover, in vivo treatment of (NODxB6)F1.RET+ mice with curdlan, a glucose polymer that binds Dectin-1, prevented tumor extension and was associated with marked reduction of the CD4+Foxp3+ T cell subset. In parallel, we study the prognostic value of iNOS expression in four types of human tumors of 108 Tunisian patients: (breast n=27, colorectal=24, nasopharyngeal=28, and melanoma=29). The level of iNOS was measured by RT-QPCR in tumor specimens. We showed that the expression of iNOS was higher in breast compared to colorectal and nasopharyngeal tumors whereas in melanoma, the level of iNOS expression was low. Furthermore, iNOS expression correlated with the Breslow thickness, Clark level and histological subtype in melanoma while in nasopharyngeal carcinoma, significant association was seen with age at diagnosis, TNM, metastasis, response to treatment and expression of COX-2. Furthermore, the expression of iNOS correlated with tumor size, TNM, tumor location, and histological type in colorectal cancer, and with tumor size, tumor stage, SBR grade and triple negative cases in breast cancer. These observations highlight the (NODxB6)F1.RET+ mice as a new model to investigate the role of the immune system in the host-tumor relationship. Furthermore, the role of NOS2 was emphasized and mainly related to the expression of the Dectin-1. These two proteins could constitute a potentially promising therapeutic target, especially as we confirmed the poor prognostic value of the expression of NOS2 in four epithelial human cancers.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le diabète de type 1 (T1D) est une maladie auto-immune caractérisée par la destruction des cellules β du pancréas par les lymphocytes T auto-réactifs. Durant ma thèse, nous nous sommes intéressés au rôle des cellules de l'immunité innée dans le T1D à l'aide d'un modèle murin de la maladie : la souris NOD. Au contraire des cellules du système adaptatif (lymphocytes T et B), les cellules de l'immunité innée constituent la première ligne de défense de l'organisme lors d'une infection. Cette population est constituée entre autre de neutrophiles, cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC), macrophages, mais aussi de lymphocytes T et B non conventionnels tel que les cellules iNKT et B-1a. Précédemment, notre laboratoire a mis en lumière le rôle des lymphocytes iNKT dans le développement du T1D. Durant la première partie de ma thèse, nous avons démontré que les lymphocytes iNKT17, une sous-population des lymphocytes iNKT, ont un rôle délétère dans le T1D chez la souris NOD. Ces cellules infiltrent le pancréas et y produisent de l'IL-17, une cytokine pro-inflammatoire. Grâce à des expériences de transferts, nous avons mis en évidence que les lymphocytes iNKT17 exacerbent la maladie via la production d'IL-17. Dans la deuxième partie de ma thèse, nous nous sommes intéressés aux mécanismes qui induisent l'activation des lymphocytes T auto-réactifs. Nous avons observé chez la souris NOD, que la mort physiologique des cellules β conduit à l'activation de cellules de l'immunité innée : les neutrophiles, les lymphocytes B-1a et les pDC. La coopération entre ces cellules conduit à l'activation des pDC qui produisent de l'IFNα. Cette cytokine active les lymphocytes T auto-réactifs qui vont détruire les cellules β du pancréas. Nos résultats montrent que l'immunité innée est un acteur important dans la physiopathologie du diabète sucré.

Le diabète de type 1 (T1D) est une maladie auto-immune caractérisée par la destruction des cellules β du pancréas par les lymphocytes T auto-réactifs. Durant ma thèse, nous nous sommes intéressés au rôle des cellules de l’immunité innée dans le T1D à l’aide d’un modèle murin de la maladie : la souris NOD. Au contraire des cellules du système adaptatif (lymphocytes T et B), les cellules de l’immunité innée constituent la première ligne de défense de l’organisme lors d’une infection. Cette population est constituée entre autre de neutrophiles, cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC), macrophages, mais aussi de lymphocytes T et B non conventionnels tel que les cellules iNKT et B-1a. Précédemment, notre laboratoire a mis en lumière le rôle des lymphocytes iNKT dans le développement du T1D. Durant la première partie de ma thèse, nous avons démontré que les lymphocytes iNKT17, une sous-population des lymphocytes iNKT, ont un rôle délétère dans le T1D chez la souris NOD. Ces cellules infiltrent le pancréas et y produisent de l’IL-17, une cytokine pro-inflammatoire. Grâce à des expériences de transferts, nous avons mis en évidence que les lymphocytes iNKT17 exacerbent la maladie via la production d’IL-17. Dans la deuxième partie de ma thèse, nous nous sommes intéressés aux mécanismes qui induisent l’activation des lymphocytes T auto-réactifs. Nous avons observé chez la souris NOD, que la mort physiologique des cellules β conduit à l’activation de cellules de l’immunité innée : les neutrophiles, les lymphocytes B-1a et les pDC. La coopération entre ces cellules conduit à l’activation des pDC qui produisent de l’IFNα. Cette cytokine active les lymphocytes T auto-réactifs qui vont détruire les cellules β du pancréas. Nos résultats montrent que l’immunité innée est un acteur important dans la physiopathologie du diabète sucré. / The type 1 diabetes ( T1D ) is an autoimmune disease characterized by the destruction of β cells in the pancreas by autoreactive T lymphocytes. During my thesis, we are interested in the role of cells of innate immunity in T1D using a mouse model of the disease: NOD mice. In contrast to cells of the adaptive system (T and B lymphocytes ) cells of innate immunity is the first line of defense of the body during infection . This population consists of neutrophils , among other , plasmacytoid dendritic cells ( pDC ) , macrophages , T lymphocytes but not conventional B as iNKT cells and B -1a.Previously, our laboratory has highlighted the role of iNKT cells in the development of T1D . During the first part of my thesis , we demonstrated that iNKT17 cells, a subpopulation of iNKT cells, have a deleterious role in T1D in NOD mice . These cells infiltrate the pancreas and there produce IL -17 , a proinflammatory cytokine. Through transfer experiments , we demonstrated that lymphocytes iNKT17 exacerbate disease through the production of IL-17 . In the second part of my thesis , we investigated the mechanisms that induce the activation of autoreactive T lymphocytes. We observed in NOD mice , the physiological death of β cells leads to activation of innate immunity cells : neutrophils, lymphocytes B- 1a and pDCs . The cooperation between these cells leads to activation of pDC that produce IFNa . This cytokine activates autoreactive T cells which will destroy the β cells of the pancreas. Our results show that innate immunity is an important player in the pathogenesis of diabetes mellitus.