Thesis (Ph. D.)--Rijksuniversiteit te Leiden, 1988. / Includes bibliographical references.

Les protéines sont impliquées dans de nombreux processus biologiques. Il est nécessaire pour comprendre en détail leur fonction et leur mode d'action afin d'obtenir des informations sur leur structure et sur leurs interactions éventuelles avec leurs partenaires. Le travail réalisé durant cette thèse a consisté à développer deux méthodes innovantes utilisant la spectrométrie de masse pour étudier la structure des protéines et à appliquer ces méthodes à une problématique biologique. Nous avons optimisé une méthode associant les échanges H/D et la spectrométrie de masse sur une protéine modèle, la protéine PBP-2X. L'utilisation combinée de trois protéases nous a permis d'obtenir un meilleur recouvrement de séquence de la protéine étudiée et une plus grande résolution spatiale dans la localisation des zones d'intérêt. Une méthode associant la réticulation chimique et la spectrométrie de masse a été mise au point sur une protéine modèle : le cytochrome c. Les contraintes de distances ainsi obtenues vont intervenir dans une démarche bioinformatique visant à déterminer la famille de repliement d'une protéine de structure inconnue. Enfin, ces deux méthodes ont été appliquées avec succès sur des protéines du système de sécrétion de type III de Pseudomonas aeruginosa : PcrV et PcrG. Nos résultats expérimentaux sur PcrV corrèlent à la structure modélisée de PcrV et la protéine PcrG est globalement peu structurée. L'interaction PcrV-PcrG a été caractérisée, elle met en jeu les domaines « coiled-coil » de chacune des deux protéines. La formation du complexe induit un changement de la conformation de PcrV qui pourrait avoir pour conséquence la stabilisation de PcrG.

PARMI LES DIFFERENTES SOURCES NATURELLES DE COMPOSES BIOLOGIQUEMENT ACTIFS, LES VENINS REPRESENTENT, DE PAR LA GRANDE VARIETE DE LEURS CONSTITUANTS, UNE CIBLE DE CHOIX POUR LA RECHERCHE MEDICALE. LES TOXINES QU'ILS CONTIENNENT SONT VARIEES ET COMPRENDRE LEUR MODE D'ACTION DANS LE BUT DE SYNTHETISER DES ANALOGUES D'INTERET PHARMACOLOGIQUE PASSE PAR UNE DETERMINATION PRECISE DE LEUR STRUCTURE CHIMIQUE AVEC LA CONTRAINTE QUE LA FAIBLE QUANTITE DE MATERIEL GENERALEMENT DISPONIBLE REND L'ENSEMBLE DES PROCESSUS DE SEPARATION ET DE CARACTERISATION TRES DELICAT. C'EST DANS CE CONTEXTE QUE SE SITUE CETTE THESE DONT L'OBJECTIF A ETE DE METTRE AU POINT DE NOUVELLES STRATEGIES D'ANALYSE PAR SPECTROMETRIE DE MASSE A HAUTE RESOLUTION DE NOUVELLES TOXINES PEPTIDIQUES. CETTE THESE A PARTICULIEREMENT CIBLE L'ETUDE DE TOXINES PEPTIDIQUES DE CONES (MOLLUSQUES UTILISANT UN HARPON VENIMEUX POUR ATTEINDRE ET PARALYSE! R LEUR PROIE) ET DE SERPENTS. AU FINAL, LA SPECTROMETRIE DE MASSE A HAUTE RESOLUTION S'EST REVELEE COMME UN OUTIL TRES PUISSANT POUR LA CARACTERISATION DE PETITES TOXINES MODIFIEES PAR SES GRANDES CAPACITES EN TERMES DE PRECISION SUR LA MESURE DE MASSE MAIS AUSSI DANS L'ETUDE DE PLUS GROSSES TOXINES POUR LESQUELLES LA RECENTE TECHNIQUE DE DISSOCIATION PAR CAPTURE D'ELECTRON S'EST MONTREE DES PLUS PERFORMANTES.

Until first half of the XX century, sickle cell disease was practically limited to the malaria endemic areas and countries having known an important surge of African slaves. Today, migratory flows and progress of medicine have modified considerably the distribution of sickle cell disease which is from now on a frequent affection in Western Europe. The preventive implementation of medical care makes it possible to reduce morbidity and mortality associated with this pathology. Stake of a medical policy and economic interests, neonatal screening for hemoglobin disorders justifies then fully the implementation of powerful and adapted means. In order to initiate a newborn screening programme in our centre, we developed various immunological tests allowing to identify the sickle hemoglobin. We first of all developed an indirect immunoassay and led a population study on 46082 Belgian newborns and 1825 neonates from Central Africa. The performances of this assay were improved thereafter by conceiving a competitive test. Next, for reasons independent of our will, we had unfortunately to abandon the immunological approach. This methodology was thus supplanted in our center by an innovative method for this indication: the mass spectrometry. Our promising results currently authorize us to perennialize our policy in the neonatal screening for sickle cell disease and open the way for new developments in other fields. / Jusquà la première moitié du XXe siècle, la drépanocytose se limitait pratiquement aux zones dendémie palustre et aux pays ayant connu un important afflux desclaves dorigine africaine. Aujourdhui, les flux migratoires et les progrès de la médecine ont considérablement modifié la distribution de cette maladie qui est désormais une affection fréquente en Europe occidentale. La prise en charge précoce permet de réduire la morbidité et la mortalité associées à cette maladie. Enjeu dune politique sanitaire et dintérêts économiques, le dépistage néonatal de la drépanocytose justifie donc ainsi pleinement la mise en uvre de moyens performants et adaptés. Afin dinitier un programme de dépistage au sein de notre centre, nous avons initialement développé divers tests immunologiques permettant didentifier lhémoglobine anormale. Nous avons tout dabord mis au point un immunoessai indirect et conduit une étude de population sur 46082 nouveau-nés belges et 1825 bébés originaires dAfrique centrale. Les performances de lessai ont par la suite été améliorées en concevant un test compétitif. Lapprovisionnement laborieux danticorps nécessaires aux tests de détection a par la suite entravé notre programme. En effet, la commercialisation en a été interrompue et la production danticorps monoclonaux par nos moyens propres na pas été couronnée du succès escompté. Lapproche immunologique du dépistage néonatal de la drépanocytose a ainsi été supplantée dans notre centre par une méthode novatrice pour cette indication : la spectrométrie de masse. Nos résultats prometteurs nous autorisent actuellement à pérenniser notre nouvelle façon de faire dans le dépistage néonatal de la drépanocytose et ouvre la voie pour de nouveaux développements dans dautres domaines.

Les pesticides appartiennent à la grande famille des polluants organiques. Ils sont destinés à lutter contre les parasites des cultures au sens large.La diffusion des pesticides dans la nature engendre une pollution des différents compartiments de la biosphère (eau, sol et atmosphère) et peut induire des effets toxiques aigus sur les êtres vivants de la biomasse terrestre et aquatique. Il est aujourd'hui démontré que certains pesticides sont des perturbateurs endocriniens et présentent en particulier des effets cancérogènes et mutagènes chez l'être humain. Les pesticides peuvent subir différents processus de transformation dans le cycle biologique naturel (biodégradation, volatilisation, irradiation solaire...) ou suite aux traitements appliqués dans les filières de potabilisation des eaux naturelles et dans les stations de retraitement des eaux usées. La présence de produits de dégradation de pesticides dans notre environnement est d'autant plus alarmante que leurs structures et leurs toxicités potentielles demeurent généralement inconnues. Des molécules qui appartiennent à deux familles de pesticides ont été choisies pour cette étude : les herbicides, représentés par le metholachlore, et les fongicides, représentés par la procymidone, le pyrimethanil et le boscalid. Le premier volet de la thèse a porté sur le développement d'une stratégie analytique permettant de caractériser les structures de composés issus de la dégradation par photolyse de ces pesticides. Le deuxième volet a porté sur l'estimation de la toxicité des produits de dégradation à l'aide d'une base de test in silico. L'identification des produits de dégradation a été réalisée grâce à deux techniques d'analyses complémentaires : la chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse "multi étapes" (GC-MSn) et la chromatographie en phase liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem (LC-MS/MS). L'estimation de la toxicité des produits de dégradation a été réalisée grâce au programme T.E.S.T. QSAR récemment développés pour tenter de prévoir la toxicité des molécules. La stratégie d'élucidation structurale des produits de dégradation des pesticides étudiés est basée sur l'étude des mécanismes de fragmentation des molécules mères des produits de dégradation. La masse molaire des molécules mères a été précisée par l'identification des masses sur charge (m/z) des ions pseudo moléculaires obtenus à l'aide des différentes modes d'ionisations en spectrométrie de masse : ionisation électronique (EI) et ionisation chimique (CI) en GC-MS et ionisation par électronébulisation (ESI) en LC-MS. La stratégie utilisée pour l'élucidation structurale des produits de dégradation est avérée très efficace, la plupart des structures chimiques des produits formés ayant été élucidées. Une étude cinétique a été réalisée pour visualiser l'apparition et la disparition des produits de dégradation durant la photolyse et pour donner une idée sur le taux de disparition de la molécule mère pour chaque pesticide. Les résultats de photolyse ont montré que le méthalochlore, le procymidone et le boscalid ont été dégradés sous irradiation après un certain temps en libérant des produits de dégradation avec des structures proches ou différentes des molécules mères. Tandis que le pyrimethanil a présenté une grande stabilité pendant 8 heurs d'irradiation (quantité restante après irradiation est de 60%) et a donné des produits de dégradation avec des quantités modérées. Concernant l'estimation de la toxicité, la plupart des produits de dégradation identifiés présentent des toxicités équivalentes ou plus importantes que celles des molécules d'origine. Les méthodes chimiques d'analyses utilisées et l'estimation de toxicités des produits de dégradations identifiés sont avérées complémentaires et indispensables pour mettre en évidence la présence d'autres produits polluants toxiques qui émergent dans l'environnement sans vrai contrôle.

L'analyse isotopique des actinides est nécessaire pour le pilotage du cycle du combustible, le contrôle du traité de non-prolifération ou pour la surveillance environnementale. La précision de ces analyses peut être limitée par la performance du détecteur utilisé mais aussi par les incertitudes associées aux intensités d’émission disponibles dans les tables de données nucléaires. La désintégration des actinides est généralement suivie par d’intenses émissions de photons X et gamma dans la gamme d’énergie inférieure à 100 keV. Leur détection peut être intéressante pour l'analyse des actinides. Cependant, les techniques conventionnelles de mesure ne permettent pas de séparer correctement les raies des émissions concernées. Cette thèse a été consacrée à la mesure des intensités à l’aide d’un détecteur cryogénique. Ce dernier est basé sur un calorimètre métallique magnétique (MMC) qui permet de mesurer le dépôt d’énergie sous forme d’une élévation de température. Le MMC, appelé SMX3, comporte quatre pixels ; il est spécifiquement conçu pour la spectrométrie X et gamma de haute résolution dans la gamme d'énergie inférieure à 100 keV en vue de la mesure des intensités d’émission des actinides. Outre la haute résolution fournie par SMX3, due à son principe de fonctionnement, ce détecteur possède un rendement de détection constant et quasiment égal à 100% dans la gamme d'énergie inférieure à 25 keV, où les rayons XL des actinides sont émis. La courbe de rendement de SMX3 a été étalonnée par une méthode qui consiste en une mesure d’une seule source étalon d’Am-241 combinée à des simulations Monte Carlo. Les trois actinides Pu-238, Pu-239, et Cm-244 ont été mesurés afin de fournir des intensités absolues et relatives des émissions Li-Yj (avec Y=L,M,N,O,P i=1,2,3 et j=1..7). Grâce à la très haute résolution en énergie du MMC, les raies XL individuelles des actinides peuvent être séparées. Les raies satellites sont aussi détectées, leurs intensités relatives aux raies diagrammes dépendent de l’isotope en fonction des paramètres fondamentaux atomiques. Les intensités des raies XL individuelles ont pu être déterminées pour la première fois, notamment pour les transitions L₁-L₃. De plus, les intensités des régions XLi (i=1,2,3) ont été établies. Les intensités des groupes XL et XL globale sont comparées avec les calculs et les données expérimentales disponibles dans la littérature. / Isotopic analysis of actinides is necessary for fuel cycle management, non-proliferation treaty control or environmental monitoring. The accuracy of these analyses may be limited by the performance of the detector used but also by the uncertainties associated with the emission intensities available in the nuclear data tables. The disintegration of actinides is generally followed by intense X-ray and gamma photon emissions in the energy range below 100 keV. Their detection may be of particular interest for actinide analysis. However, conventional measurement techniques do not allow to properly separate the lines of the considered emissions. This thesis was devoted to the measurement of intensities using a cryogenic detector. The latter is based on a magnetic metallic calorimeter (MMC) that measures energy deposition as a temperature rise. The MMC, called SMX3, has four pixels and is specifically designed for high resolution X-ray and gamma spectrometry in the energy range below 100 keV to measure actinide emission intensities. In addition to the high resolution provided by SMX3 through its operating principle, this detector has a constant detection efficiency and almost equal to 100% over the energy range below 25 keV, where actinides' XL rays are emitted.The SMX3 yield curve was calibrated by a method that consists of a single standard source measurement of Am-241 combined with Monte Carlo simulations. The three actinides Pu-238, Pu-239, and Cm-244 were measured to provide absolute and relative intensities of Li-Yj emissions (with Y=L,M,N,O,P i=1,2,3 and j=1..7). Thanks to the very high energy resolution of the MMC, the individual XL lines of actinides can be separated. Satellite lines are also detected, their intensities relative to the diagram lines depend on the isotope according to the fundamental atomic parameters. The intensities of the individual XL lines could be determined for the first time, especially for the transitions L₁-L₃. In addition, the intensities of the XLi regions (i=1,2,3) were established. The intensities of the overall XL and XL groups are compared with the calculations and experimental data available in the literature.

The submitted thesis is devoted to the quantitative analysis of tyrosine kinase inhibitors, specifically imatinib and nilotinib, by liquid chromatography-mass spectrometry method. The main purpose of developing this new method of analysis at the Department of Clinical Biochemistry and Diagnostics at the University Hospital in Hradec Králové was measuring and monitoring serum or plasma concentration levels of these drugs in patients with chronic myeloid leukemia, less often in patients with gastrointestinal stromal tumour. The main task during the elaboration of the thesis was to fully optimize and validate the method. Previously, this method for the analysis of tyrosine kinase inhibitors was routinely performed here by high-performance liquid chromatography with spectrophotometric (UV) detection. As part of the modernization of laboratory technology, they started to use high-performance liquid chromatography with mass spectrometry at the workplace. The analytes with their internal standards were obtained by a liquid-liquid extraction process. Then, samples were separated on a C18 reverse phase column using isocratic elution. Subsequently, both analytes were detected by a triple quadrupole tandem mass spectrometer with ESI ion source in a positive mode. As a part of the method validation was to...

L'ETUDE EXPERIMENTALE A DEMONTRE (1) L'INFLUENCE IMPORTANTE DE CERTAINS PARAMETRES (FO2, COMPOSITION DE L'ALLIAGE METALLIQUE, FS2) SUR LA SOLUBILITE DES EGP DANS LES LIQUIDES BASALTIQUES ET (2) LE ROLE SENSIBLEMENT MOINS IMPORTANT D'AUTRES PARAMETRES (T, COMPOSITION DU LIQUIDE SILICATE). A 1 ATM, 1300< T <1430\C ET POUR LES COMPOSITIONS DAF0, LA SOLUBILITE DES EGP AUGMENTE AVEC LA FO2 ET T. LES EGP SONT DISSOUS DANS LE BAIN SILICATE SOUS FORME D'ESPECES OXYDEES ET METALLIQUES. LE CALCUL DE SPECIATION MONTRE LA PRESENCE DE TROIS (PD) ET DEUX (PT) ESPECES DISSOUTES DONT LES PROPORTIONS VARIENT AVEC LA FO2. LA DEPENDANCE POSITIVE DE LA SOLUBILITE DES EGP AVEC LA TEMPERATURE IMPLIQUERAIT UNE PREFERENCE POUR LES ESPECES EGP OXYDEES. L'INTRODUCTION DU FER DANS LE SYSTEME SILICATE (DAF5 ET DAF10) N'INFLUE PAS SUR LA TENDANCE GENERALE DE SOLUBILITE DES EGP AVEC LA FO2. CEPENDANT, PT ET PD SONT DISSOUS SOUS FORME OXYDEE (2+). EN PRESENCE DE SOUFRE, LES SOLUBILITES DES EGP MONTRENT UNE INVERSION DE LA TENDANCE AVEC UNE AUGMENTATION DES CONCENTRATIONS DE PD ET PD (1) VERS LES CONDITIONS REDUCTRICES ET (2) AVEC L'INTRODUCTION DU FER. LE TRAITEMENT THERMODYNAMIQUE DES RESULTATS ET LEUR COMPARAISON AVEC LES CONCENTRATIONS EN EGP MESUREES OU ESTIMEES DANS UN CERTAIN NOMBRE DE LIQUIDES NATURELS MONTRE QUE : (1) EN ABSENCE DE SOUFRE ET POUR DES COMPOSITIONS DE METAL PUR (PT ET/OU PD), LES CONCENTRATIONS PREDITES SONT TRES SUPERIEURES A CELLES DES LIQUIDES NATURELS. LA PRISE EN COMPTE D'ALLIAGES D'ACTIVITE EN EGP < 1 REDUIT LES ECARTS ENTRE LES VALEURS DE PT ET PD DU MODELE ET DES LIQUIDES NATURELS. (2) EN PRESENCE DE SOUFRE, ET MALGRE L'ABSENCE DE DONNEES PRECISES SUR LA FS2 DES SYSTEMES NATURELS, LA COMPARAISON EST ENCOURAGEANTE. ENFIN, LES RESULTATS DU CALCUL DES COEFFICIENTS DE PARTAGE DE PT ET PD ET LEUR COMPARAISON AVEC CEUX ESTIMES A PARTIR DES ABONDANCES DES EGP DANS LE MANTEAU MONTRE QUE LES TENEURS OBSERVEES NE SONT PAS LE RESULTAT D'UN EQUILIBRE CHIMIQUE ENTRE LE COEUR ET LE MANTEAU. LA PRESENCE DE SOUFRE POURRAIT REGLER LE PROBLEME DU SURPLUS DES EGP ET CONSTITUE UNE BONNE HYPOTHESE DE TRAVAIL.

Le transporteur d'ADP/ATP est une protéine de la membrane interne mitochondriale qui joue un rôle physiologique majeur en catalysant l'échange d'un ADP cytoplasmique contre un ATP néo-synthétisé dans la matrice mitochondriale. Cette protéine peut être inhibée de manière très spécifique par deux poisons naturels, le carboxyatractyloside (CATR) et l'acide bongkrekique (BA) qui stabilisent la protéine dans deux états conformationnels distincts adoptés au cours du mécanisme de transport. Afin de mieux appréhender cette dynamique fonctionnelle, une étude du transporteur d'ADP/ATP bovin en complexe avec le CATR ou le BA dans le détergent Triton X-100 a été réalisée par échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse. Ces travaux se sont déroulés en 4 parties. La première a consisté à adapter cette technique à l'étude des protéines membranaires intégrales. En effet, la présence de détergents, nécessaires au maintien en solution de l'état natif de ces protéines, n'a pas permis jusqu'ici de les étudier par cette approche. Pour pallier cette difficulté, un protocole automatisé de chromatographie liquide permettant l'élimination du Triton X-100 a été mis au point. Les cinétiques de deutération des différents complexes ont alors pu être analysées dans le deuxième volet de cette étude. Les données obtenues ont permis de proposer des modèles conformationnels du transport de nucléotides à travers la membrane interne mitochondriale, dans lesquels le transporteur présenterait une cavité ouverte tour à tour vers l'espace intermembranaire et vers la matrice. Afin d'apporter d'autres éléments de réponse sur ce mécanisme de transport et de s'affranchir de différents problèmes liés à l'utilisation des détergents, des essais de deutération du transporteur d'ADP/ATP bovin dans les mitochondries ont été entrepris et représentent le troisième volet de ces travaux. Cette approche, qui nécessite encore plusieurs améliorations, a permis d'obtenir les premières données de deutération d'une protéine membranaire dans son environnement natif. Le transporteur d'ADP/ATP est aussi impliqué dans des pathologies humaines plus ou moins graves. Dans une dernière partie, l'étude de ces mutations a été abordée en réalisant chez la levure Saccharomyces cerevisiae une étude phénotypique et biochimique de plusieurs mutants du transporteur de l'amibe Dictyostelium discoideum correspondant aux mutations humaines. Cette étude a mis en évidence un problème dans le mécanisme intrinsèque de transport, induit par la mutation V291M, qui pourrait être à l'origine de la pathologie associée.

Aujourd'hui la recherche en biologie dispose d'une masse d'informations génomiques considérable qu'il faut comprendre fonctionnellement pour faire émerger de nouveaux concepts, qui formeront le berceau de nouvelles thérapies. Ces études mettent en jeu des mécanismes contrôlés à l'échelle moléculaire et nécessitent le traitement d'informations à haut-débit et de manière parallèle. Les travaux pluridisciplinaires présentés ont permis de mettre au point une technologie miniaturisée de culture de cellules en gouttes matricées sur supports solides, pour tester l'action des molécules sur le comportement de cellules.<br />Après avoir mis au point un démonstrateur macroscopique validé par des transfections de molécules nucléiques, nous avons développé un protocole de fabrication de substrats miniaturisés capable de maintenir 100 nano-gouttes par cm² à l'aide d'un différentiel de tension de surface. Un robot de dispense de pico-gouttes a été intégré pour réaliser les gouttes de culture cellulaire de manière automatique. Le comportement des cellules au sein des gouttes est évalué par microscopie en fluorescence à haut-contenu après fixation. Chaque cellule de chaque goutte est caractérisée par des dizaines de paramètres de manière individuelle.<br />Cette nouvelle approche analytique a été appliquée dans le cadre d'un projet multipartenaire de criblage de siRNA visant à étudier l'impact de gènes sur la chimiorésistance de glioblastomes. Par ailleurs nous avons montré l'utilisation de la spectrométrie de masse comme méthode de phénotypage multiparamétrique. Cette technologie de puce à cellules est particulièrement adaptée à l'étude à haut-débit des comportements fins de cultures cellulaires.