Weißes Fettgewebe (WAT) stellt heute aus vielerlei Hinsicht ein interessantes Forschungsgebiet dar. Zum einen ist die Prävalenz der Adipositas weiterhin sehr hoch; mit ihr einher gehen Gesundheitsprobleme wie Bluthochdruck, Diabetes, Dyslipidämie und Atherosklerose, sowie deshalb das Bestreben, bessere Behandlungsmöglichkeiten zu entwickeln. Zum anderen hofft man im Bereich des Tissue Engineering, zukünftig mit in vitro hergestelltem weißem Fettgewebe Weichteildefekte decken zu können. Aus therapeutischer Sicht ist die weitere Erforschung von weißem Fettgewebe deshalb von großer Wichtigkeit. In vivo ist weißes Fettgewebe stark vaskularisiert. Die starken physiologischen Schwankungen von Fettgewebe erfordern deshalb ein besonders dynamisches Gefäßwachstum. Für ein genaueres Verständnis der Physiologie von WAT ist es unerlässlich das Zusammenspiel von Gefäß- und Fettzellen zu verstehen. 2-dimensionale Kultursysteme sind in ihrer Aussagekraft über die Bedingungen in vivo jedoch sehr limitiert. Deshalb kommt in der Erforschung von WAT zunehmend die 3-dimensionale Kultivierung zur Anwendung, welche bezüglich des Gewebekontextes einem lebenden Organismus näher kommt und damit eine größere Aussagekraft haben kann. Ein Ziel dieser Arbeit war, die Voraussetzungen für die Untersuchung der einzelnen Zellfraktionen von Kokulturen aus mesenchymalen Stammzellen aus humanem Fettgewebe (ASC) und mikrovaskulären Endothelzellen (MVEC) zu schaffen. Hierfür wurde erfolgreich ein Protokoll zur Trennung solcher Zellsuspensionen mittels Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) etabliert. Während in vorangegangenen Arbeiten nur eine der beiden Zellfraktionen analysiert werden konnte, ermöglichte es dieses Protokoll nun beide Zellfraktionen einer Kokultur verunreinigungsfrei zu isolieren und zu analysieren. Dies eröffnet neue Möglichkeiten in der Erforschung des Zusammenspiels dieser beiden Zelltypen. Um diese zu demonstrieren wurde in dieser Arbeit die Expression von vier Genen in ASC und MVEC aus gemeinsamer Kokultivierung in einem 3-dimensionalen Sphäroid-Modell analysiert. Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Expression der Gene Angiopoietin-2, Interleukin-1B, Interleukin-6 und Leukemia Inhibitory Factor in MVEC bei 3-dimensionaler Kokultivierung mit ASC nach zwei Tagen Kultur stark anstieg, während sich in der Fraktion der ASC kaum Veränderungen zeigten. Dies wiederum spricht für eine angiogene Aktivität der MVEC. Ohne ein Protokoll zur Trennung solcher ASC-MVEC-Kokulturen mittels MACS, welche die weitere Analyse beider Zelltypen erlaubt, wäre diese Untersuchung so nicht möglich gewesen Ziel dieser Arbeit war auch, der Hypothese über eine Beteiligung des Wnt-Signalwegs an der Steuerung der Adipogenese durch Endothelzellen in ASC-MVEC-Kokultur-Sphäroiden nachzugehen. Zuvor konnte beobachtet werden, dass in diesen die Triglyceridsynthese lokal reduziert war, während sie in ASC-Monokultur-Sphäroiden homogen verteilt und nicht inhibiert war. Hierfür wurden Schnitte von adipogen induzierten ASC-MVEC-Kokultur-Sphäroiden und ASC-Monokultur-Sphäroiden immunhistochemisch auf aktives beta-Catenin gefärbt, wodurch der aktive Wnt-Signalweg innerhalb des Sphäroids dargestellt werden konnte. Tatsächlich konnte innerhalb der Kokultur-Sphäroide für die Hälfte der untersuchten Schnitte eine regionale Erhöhung von aktivem beta-Catenin festgestellt werden, welche auf der Seite der ASC-Monokultur-Sphäroide nicht nachweisbar war. In Betrachtung der Ergebnisse dieser Arbeit -- auch im Kontext weiterer Forschungsergebnisse -- erscheint eine Beteiligung des Wnt-Signalwegs an der Steuerung der Adipogenese in ASC-MVEC-Kokultur-Sphäroiden sehr wahrscheinlich. In dieser Arbeit konnte ein Beitrag zum Verständnis des Zusammenspiels von ASC und MVEC in 3-dimensionaler Kokultivierung sowie dessen weiterer Untersuchung geleistet werden. Die gewonnenen Erkenntnisse unterstreichen die Anwendbarkeit und Wichtigkeit von 3-dimensionalen Kulturumgebungen in der Erforschung von weißem Fettgewebe, sowohl für die Adipositasforschung als auch für Adipose Tissue Engineering. / Coculture of Adipose Derived Stem Cells and Microvascular Endothelial Cells - Aspects in a 3D Spheroid-Model

Beta-Hydroxybutyrat (3OHB) ist ein physiologischer Ketonkörper,wie er zum Beispiel im Rahmen einer ketogenen Diät als alternativer Energielieferant produziert wird. Außerdem ist 3OHB ein Modulator von Zellhämostase und zahlreichen Signalwegen. Ziel dieser Arbeit war, zu untersuchen ob 3OHB die Polarisation von Makrophagen beeinflusst und ob er deren Interaktion mit Sphäroiden aus Brustkrebszellen beeinflusst wird. Die Makrophagen-Subtypen (M0, M1 und M2) wurden aus THP1-Zellen polarisiert. Die Subtypen wurden auf den Oberflächenmarker CCR7, sowie auf das Protein Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) untersucht. Außerdem wurde die Expression von Monocarboxylat-Transportern 1 und 4 (MCT1, MCT4) und die Expression von G-Protein-gekoppelten-Rezeptoren 41, 43 und 109A (GPR41, GPR43, GPR109A) untersucht. In den Tests zur Gen- und Proteinexpression konnte festgestellt werden, das die Transporterproteine und Oberflächenrezeptoren, die zur Verwertung von 3OHB und zu einer möglichen Beeinflussung der Zellen durch 3OHB notwendig sind, bei den Makrophagen-Subtypen vorhanden sind. Das Gelingen der Polarisation wurde zumindest für die M1‑Fraktion durch den durchgeführten IDO‑Versuch gesichert. Des Weiteren wurde eine mögliche Beeinflussung des Zytokinspektrums der Fraktionen durch die Polarisation, sowie durch unterschiedliches Angebot an Sauerstoff und Anwesenheit von 3OHB untersucht. Die Zusammenschau der experimentellen Ergebnisse lässt die Aussage zu, dass 3OHB eine immunmodulierende Wirkung auf die getesteten Makrophagen-Fraktionen hat. Weitere Schlussfolgerungen unserer Versuche waren nicht immer eindeutig, und zum Teil widersprechen sie den Ergebnissen aus bisherigen Studien, was die Komplexität der Interaktionen zwischen Zyto- und Chemokinen, Makrophagen-Subtypen und beeinflussenden Faktoren verdeutlicht, sodass man von einer Übertragbarkeit der in vitro Ergebnisse auf eine in vivo Situation aktuell nicht ausgehen kann. Zusätzlich wurden die vier Fraktionen auf ihr Migrations-und Invasionsverhalten untersucht, letzteres anhand von Sphäroiden aus der Brustkrebszelllinie BT20. Diese scheinen unter Einfluss von 3OHB ebenfalls moduliert, wobei hier noch vielfältige Möglichkeiten der weiteren Austestung dieser Annahme bestehen. / Beta-hydroxybutyrate (3OHB) is a physiological ketone body that is produced, for example, as part of a ketogenic diet as an alternative source of energy. In addition, 3OHB is a modulator of cell hemostasis and numerous signaling pathways. The aim of this work was to investigate whether 3OHB influences the polarization of macrophages and whether it affects their interaction with spheroids from breast cancer cells. The macrophage subtypes (M0, M1 and M2) were polarized from THP1 cells. The subtypes were analyzed for the surface marker CCR7, as well as for the protein indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO). In addition, the expression of monocarboxylate transporters 1 and 4 (MCT1, MCT4) and the expression of G-protein-coupled receptors 41, 43 and 109A (GPR41, GPR43, GPR109A) were examined. The tests on gene and protein expression showed that the transporter proteins and surface receptors required for the utilization of 3OHB and for a possible influence of 3OHB on the cells are present in the macrophage subtypes. The success of the polarization was ensured, at least for the M1 fraction, by the IDO experiment. Furthermore, a possible influence on the cytokine spectrum of the fractions by the polarization, as well as by different supply of oxygen and presence of 3OHB was investigated.The summary of the experimental results allows the conclusion that 3OHB has an immunomodulating effect on the tested macrophage fractions.Further conclusions of our experiments were not always clear and partly contradict the results of previous studies, which illustrates the complexity of the interactions between cyto- and chemokines, macrophage subtypes and influencing factors, so that a transferability of the in vitro results to an in vivo situation cannot be assumed at present. In addition, the four fractions were examined for their migration and invasion behavior, the latter using spheroids from the BT20 breast cancer cell line.These also appear to be modulated under the influence of 3OHB, although there are still many possibilities for further testing this assumption.

Um das Verständnis für physikalische und biologische Dynamiken zu verbessern, werden oft stellvertretend mathematische Modelle entwickelt, implementiert,validiert und analysiert. Die Entscheidung für oder gegen einen bestimmten Modelltyp, zum Beispiel ob die Auflösung in Raum und Zeit diskret oder kontinuierlich definiert ist, kann erheblichen Einfluss auf die Ergebnisse haben. Insbesondere bei der Untersuchung und Simulation der Dynamiken von biologischen Zellen, die häufig auch als biologische Flüssigkeiten (Biofluids) bezeichnet und in der Literatur oft mit physikalischen Flüssigkeiten verglichen werden, ist die Wahl des geeigneten Modelltyps nicht immer trivial. In diesem Zusammenhang stellt die vorliegende Arbeit drei verschiedene Szenarien vor. Unter Zuhilfenahme von unterschiedlichen mathematischen Modellen werden diese Szenarien dann untersucht. Dabei wird deutlich, dass trotz des ähnlichen Kontextes von physikalischen und biologischen Dynamiken je Szenario unterschiedliche Modelltypen besser geeignet sind und mitunter verschiedene Aussagen liefern. Daher muss für jedes dieser Szenarien die Entscheidung, welches Modell genommen wird und ob dieses in Raum und Zeit diskret oder kontinuierlich ist, neu evaluiert werden. Das erste Szenario befasst sich mit einer rein physikalischen Dynamik und beschreibt das Aufsteigen einer runden Flüssigkeitsblase innerhalb einer anderen Flüssigkeit. In diesem Zusammenhang wird auch häufig von zwei Phasen gesprochen. Dieser Fall dient auch als numerischer Benchmark-Test zur Bewertung der Genauigkeit von Zwei-Phasen-Modellen. Innerhalb dieses Kontextes werden oft Modelle verwendet, die kontinuierlich in Bezug auf Ort und Zeit sind. In der vorliegenden Arbeit wird stellvertretend das Cahn-Hilliard-Navier-Stokes-Modell verwendet. Vor allem wird ein neuer einfacher Diskretisierungsansatz für dieses Modell vorgestellt. Unter Verwendung eines Standard-Benchmark-Tests wird gezeigt, dass die Genauigkeit vergleichbar zu bisherigen Methoden ist. Das zweite Szenario fokussiert sich auf eine biologische Dynamik und beschreibt das Wachstum eines Tumorsphäroiden und sein Verhalten bei der Behandlung mit Radiostrahlung. Tumorsphäroide sind spezielle 3D in-vitro Experimente, welche eine Ansammlung von mehreren tausend Zellen umfassen und Tumormikroumgebung und Mikrometastasen nachempfinden. Durch ihre 3D Struktur zeigen sie Stoffwechselgradienten von Sauerstoff, Nährstoffen und Abfallprodukten. Die Modellierung solcher Sphäroide wird häufig mit zell- oder agentenbasierten Modellen beschrieben, die in Bezug auf Ort und Zeit meist diskret sind und das Zellverhalten regelbasiert beschreiben. In dieser Arbeit wird hierfür stellvertretend ein zellulärer Automat verwendet. Dieser dient später als Vergleichsmodell zu dem neu entwickelten und hier vorgestellten Ansatz: dem 1D Radial Shell Modell, welches im Ort diskret und in der Zeit kontinuierlich ist. Dieses ermöglicht weitere Erkenntnisse und Vorhersagen zum Wachstum der Sphäroide, insbesondere für die Dynamik bei kleinem Sphäroidvolumen. Im dritten Szenario wird ein Grenzfall zwischen den physikalischen und biologischen Flüssigkeiten beschrieben: Die Entmischungsdynamik von biologischen Zellen, welche oft in der Literatur mit der Entmischung von zwei physikalischen Flüssigkeiten, wie Wasser und Öl, verglichen wird. Daher werden die beiden zuvor vorgestellten Modelle, das kontinuierliche Cahn-Hilliard-Navier-Stokes-Modell und der diskrete zelluläre Automat, für diesen Sachverhalt simuliert und analysiert. Zudem werden beide Modelle miteinander und jeweils mit biologischen Experimenten verglichen, wobei aufgrund ihrer unterschiedlichen zeitlichen und räumlichen Auflösung verschiedene Vor- und Nachteile identifizierbar sind. Am Ende zeigt sich entgegen bisherigen Versuchen in der Literatur, dass die Anpassung der Modelle an die Experimentaldaten nicht ausschließlich durch das Skalierungsverhalten machbar ist, da die Zeitskalen in den Experimenten häufig zu kurz sind. Daher sollten zusätzliche Metriken, wie zum Beispiel der durchschnittliche Clusterdurchmesser oder die Verteilung der Clustergrößen, beachtet werden. / Enhancing the understanding of physical and biological dynamics is crucial, which is why assisting mathematical models are often developed, implemented, validated, and analyzed. The decision for or against a particular model type, for example, whether the resolution in space and time is defined discretely or continuously, can considerably influence the results. Especially when investigating and simulating the dynamics of biological cells, also referred to as biological fluids and in the literature often compared to physical fluids, choosing the appropriate model type is not trivial in every case. This work presents three scenarios, which are further examined with the help of various mathematical models. Despite the similar context, dynamics of physical and biological fluids, some model types are more suited and deliver different results for each scenario. Therefore, the decision should be made new, depending on the scenarios, which model type is optimal, discrete, or continuous in space and time. The first scenario describes pure physical dynamics by the rise of a round fluid bubble within another fluid, which is often referred to as two phases. This setup also serves as a numerical benchmark test to evaluate the accuracy of physical two-phase-models. Within this context, the models used are often continuous regarding space and time. In this work, the Cahn-Hilliard-Navier-Stokes-model is chosen as a representative example. In particular, a new discretization approach for the model is introduced and evaluated by the previous benchmark test, which showcases that the new, more straightforward discretization approach leads to comparably precise results. The second scenario focuses on biological dynamics and describes the untreated growth of a tumor spheroid and further its behavior when exposed to \acl{rt}. These tumor spheroids are, in particular, 3D-assays of in-vitro experiments, which are 3D avascular aggregates of several thousand tumor cells mimicking tumor microareas or micrometastases. Due to their 3D structure, spheroids exhibit metabolic gradients of oxygen, nutrients, and waste products. These are usually simulated with cell or agent-based models, which are discrete in terms of space and time and describe the cell behavior in a rule-based manner. In this work, a cellular automaton is used as a representative. Later, this model will serve as a comparison for the new innovative approach presented here: the 1D Radial Shell model, which is space-discrete and time-continuous. This model allows further insights and predictions, for example, regarding the behavior of spheroids at small volumes, justifying the use of multiple model types. The third scenario can be seen as the in-between of physical and biological fluid dynamics: The segregation of biological cells of two distinct types, which is in the literature often referred to as similar or equal to that of two physical fluids, like oil and water. Therefore, this process is simulated and analyzed with the previously introduced continuous Cahn-Hilliard-Navier-Stokes and the discrete cellular automaton models. Thereby, both models are compared with each other and also individually with biological experiments. The comparison enables the identification of various advantages and disadvantages due to their different temporal and spatial resolution. In the end, it becomes clear that adapting the models to the experimental data is only partially feasible through the scaling behavior, as the time scale in the experiments is often too short, which stands in contrast to the current standard in the literature. Therefore, we emphasize that additional metrics should be considered, such as the average cluster diameter or cluster size distribution.

At the forefront of cancer treatment development and evaluation, three-dimensional Tumour Spheroid Control Experiments play a pivotal role in the battle against cancer. Conducting and evaluating in vitro experiments are time-consuming processes. This thesis details the development, implementation, and validation of an algorithmic model that classifies spheroids as either controlled or relapsed by assessing the success of their treatments based on criteria rooted in biological insights. The introduction of this model is crucial for biologists to accurately and efficiently predict treatment efficacy in 3D in vitro experiments. The motivation for this research is driven by the need to improve the objectivity and efficiency of treatment outcome evaluations, which have traditionally depended on manual and subjective assessments by biologists. The research involved creating a comprehensive dataset from multiple 60-day in vitro experiments by combining data from various sources, focusing on the growth dynamics of tumour spheroids subjected to different treatment regimens. Through preprocessing and analysis, growth characteristics were extracted and utilized as input features for the model. A feature selection and optimization technique was applied to refine the software model and improve its predictive accuracy. The model is based on a handful of comprehensive criteria, calibrated by employing a grid search mechanism for hyperparameter tuning to optimize accuracy. The validation process, conducted via independent test sets, confirmed the model’s capability to predict treatment outcomes with a high degree of reliability and an accuracy of about 99%. The findings reveal that algorithmic classification models can make a significant contribution to the standardization and automation of treatment efficacy assessment in tumour spheroid experiments. Not only does this approach reduce the potential for human error and variability, but it also provides a scalable and objective means of evaluating treatment outcomes.:1 Introduction 1.1 Background and Motivation 1.2 Biological Background 1.3 Iteration Methodology 1.4 Objective of the Thesis 2 Definition of basic Notation and Concepts 2.1 Time Series Analysis 2.2 Linear Interpolation 2.3 Simple Exponential Smoothing 2.4 Volume of a Spheroid 2.5 Heavyside Function 2.6 Least Squares Method 2.7 Linear Regression 2.8 Exponential Approximation 2.9 Grid Search 2.10 Binary Regression 2.11 Pearson Correlation Coefficient 3 Observation Data 3.1 General Overview 3.1.1 Structure of the Data 3.1.2 Procedure of Data Processing using 3D-Analysis 3.2 Data Engineering 3.2.1 Data Consolidation and Sanitization 3.2.2 Extension and Interpolation 3.2.3 Variance Reduction 4 Model Development 4.1 Modeling of Various Classification-Relevant Aspects 4.1.1 Primary Criteria 4.1.2 Secondary Criteria 4.1.3 Statistical Learning Approaches 4.2 Day of Relapse Estimation 4.3 Model Implementation 4.3.1 Combination of Approaches 4.3.2 Implementation in Python 4.4 Model Calibration 4.4.1 Consecutive Growth 4.4.2 Quintupling 4.4.3 Secondary Criteria 4.4.4 Combined Approach 5 Model Testing 5.1 Evaluation Methods 5.1.1 Applying the Model to New Data 5.1.2 Spheroid Control Probability 5.1.3 Kaplan-Meier Survival Analysis 5.1.4 Analysis of Classification Mismatches 5.2 Model Benchmark 5.2.1 Comparison to Human Raters 5.2.2 Comparison to Binary Regression Model 5.3 Robustness 5.3.1 Test using different Segmentation 5.3.2 Feature Reduction 5.3.3 Sensitivity 5.3.4 Calibration Templates 6 Discussion 6.1 Practical Application Opportunities 6.2 Evaluation of the Algorithmic Model 6.3 Limitations 7 Conclusion 7.1 Summary 7.2 Future Research Directions / Dreidimensionale Experimente zur Kontrolle von Tumorsphäroiden sind zentral für die Entwicklung und Evaluierung von Krebstherapien. Die Durchführung und Auswertung von In-vitro-Experimenten ist jedoch zeitaufwendig. Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung, Implementierung und Validierung eines algorithmischen Modells zur Einstufung von Sphäroiden als kontrolliert oder rezidivierend. Das Modell bewertet den Behandlungserfolg anhand biologisch fundierter Kriterien. Diese Innovation ist entscheidend für die präzise und effiziente Vorhersage der Wirksamkeit von Behandlungen in 3D-In-vitro-Experimenten und zielt darauf ab, die Objektivität und Effizienz der Beurteilung von Behandlungsergebnissen zu verbessern, die traditionell von manuellen, subjektiven Einschätzungen der Biologen abhängen. Die Forschung umfasste die Erstellung eines umfassenden Datensatzes aus mehreren 60-tägigen In-vitro-Experimenten, bei denen die Wachstumsdynamik von Tumorsphäroiden unter verschiedenen Behandlungsschemata untersucht wurde. Durch Vorverarbeitung und Analyse wurden Wachstumscharakteristika extrahiert und als Eingangsmerkmale für das Modell verwendet. Das Modell basiert auf wenigen umfassenden Kriterien, die mithilfe eines Gittersuchmechanismus zur Abstimmung der Hyperparameter kalibriert wurden, um die Genauigkeit zu optimieren. Der Validierungsprozess bestätigte die Fähigkeit des Modells, Behandlungsergebnisse mit hoher Zuverlässigkeit und einer Genauigkeit von etwa 99 % vorherzusagen. Die Ergebnisse zeigen, dass algorithmische Klassifizierungsmodelle einen wesentlichen Beitrag zur Standardisierung und Automatisierung der Bewertung der Behandlungseffektivität in Tumorsphäroid-Experimenten leisten können. Dieser Ansatz verringert nicht nur das Potenzial für menschliche Fehler und Schwankungen, sondern bietet auch ein skalierbares und objektives Mittel zur Bewertung von Behandlungsergebnissen.:1 Introduction 1.1 Background and Motivation 1.2 Biological Background 1.3 Iteration Methodology 1.4 Objective of the Thesis 2 Definition of basic Notation and Concepts 2.1 Time Series Analysis 2.2 Linear Interpolation 2.3 Simple Exponential Smoothing 2.4 Volume of a Spheroid 2.5 Heavyside Function 2.6 Least Squares Method 2.7 Linear Regression 2.8 Exponential Approximation 2.9 Grid Search 2.10 Binary Regression 2.11 Pearson Correlation Coefficient 3 Observation Data 3.1 General Overview 3.1.1 Structure of the Data 3.1.2 Procedure of Data Processing using 3D-Analysis 3.2 Data Engineering 3.2.1 Data Consolidation and Sanitization 3.2.2 Extension and Interpolation 3.2.3 Variance Reduction 4 Model Development 4.1 Modeling of Various Classification-Relevant Aspects 4.1.1 Primary Criteria 4.1.2 Secondary Criteria 4.1.3 Statistical Learning Approaches 4.2 Day of Relapse Estimation 4.3 Model Implementation 4.3.1 Combination of Approaches 4.3.2 Implementation in Python 4.4 Model Calibration 4.4.1 Consecutive Growth 4.4.2 Quintupling 4.4.3 Secondary Criteria 4.4.4 Combined Approach 5 Model Testing 5.1 Evaluation Methods 5.1.1 Applying the Model to New Data 5.1.2 Spheroid Control Probability 5.1.3 Kaplan-Meier Survival Analysis 5.1.4 Analysis of Classification Mismatches 5.2 Model Benchmark 5.2.1 Comparison to Human Raters 5.2.2 Comparison to Binary Regression Model 5.3 Robustness 5.3.1 Test using different Segmentation 5.3.2 Feature Reduction 5.3.3 Sensitivity 5.3.4 Calibration Templates 6 Discussion 6.1 Practical Application Opportunities 6.2 Evaluation of the Algorithmic Model 6.3 Limitations 7 Conclusion 7.1 Summary 7.2 Future Research Directions