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Efeitos biológicos da peçonha da aranha Parawixia bistriata em ratos: isolamento e caracterização química parcial de uma neurotoxina pró-convulsivante / Biological effects of the Parawixia bistriata spider venon in rats: isolation and partially chemical characterization of a convulsant neurotoxin.

Rodrigues, Marcelo Cairrão Araujo 04 February 2003 (has links)
As peçonhas de artrópodos são ricas fontes de neurotoxinas, verdadeiras ferramentas moleculares com ação seletiva e específica sobre o Sistema Nervoso Central (SNC) de mamíferos, e de grande relevância clínico-científica. Demonstramos recentemente que a peçonha de P. bistriata, quando injetada por via intracerebroventricular (i.c.v.), desencadeava crises convulsivas em ratos, um indício da existência de neurotoxinas pró-convulsivantes na peçonha dessa aranha. O grupo do Prof. Dr. Joaquim Coutinho-Netto isolou da peçonha dessa aranha várias neurotoxinas, dentre as quais uma denominada PbTx 2.2.1, que possui a capacidade de inibir a captação do neurotransmissor GABA em sinaptosomas corticais de ratos (in vitro), uma ação considerada como potencialmente anticonvulsivante. As frações PbTx 2.2.1 e 1.2.3 protegem retinas de ratos após isquêmia. Mas, não se testou o efeito anticonvulsivante dessa fração em experimentos in vivo. O presente trabalho teve dois objetivos: 1- Propor um método cromatográfico para isolar da peçonha de aranhas, neurotoxinas pró-convulsivantes não protéicas e de baixo peso molecular. Isolar e caracterizar parcialmente estas neurotoxinas da peçonha da aranha P.bistriata; 2- verificar se a fração PbTx 2.2.1 possui efeito anticonvulsivante in vivo. O isolamento da peçonha de P. bistriata, realizado com filtração em gel (Sephadex G-50 e G-25), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (colunas de fase reversa e troca catiônica), e CLAE-acoplado a espectrometria de massa (CLAE-MS) produziu uma fração (fração 7) e um subcomponente (fração 7.1) com atividade pró-convulsivante, após injeção i.c.v. Tal fração apresenta características típicas de ácidos nucléicos. Confirmou-se, através de ressonância magnética nuclear (RMN) que o constituinte majoritário desta fração é o nucleosídeo inosina. O método cromatográfico mostrou-se muito lento. Uma outra fração (fração 6) da mesma peçonha inibiu as crises causadas por bicuculina i.c.v., ao passo que a fração 1 apresentou atividade de fosfatase ácida e alcalina. A injeção i.c.v. da fração PbTx 2.2.1, 20 min antes do convulsivante bicuculina também i.c.v., bloqueou as crises convulsivas em 71,4% dos animais, o que caracteriza um efeito anticonvulsivante in vivo desta fração. Conclui-se que: 1- A peçonha de P. bistriata possui, dentre muitas, uma fração (fração 7) com efeito pró-convulsivante quando injetada i.c.v. em ratos. Nesta fração, aparentemente o composto majoritário é o nucleosídeo inosina. A peçonha da mesma aranha possui também uma fração com atividade anticonvulsivante (fração 6) e outra com atividade de fosfatase ácida e alcalina (fração 1). 2- o método cromatográfico proposto pode ser otimizado talvez pelo uso de ultrafiltração; 3- a fração PbTx 2.2.1 apresenta efeito anticonvulsivante in vivo no modelo de indução de crises por injeção i.c.v. de bicuculina. / Arthropod venoms are rich sources of neurotoxins, molecular tools with selective and specific actions over the mamalian central nervous system with great clinical and scientific importance. Previous work of our laboratory showed that the spider venom of Parawixia bistriata, when injected by intracerebroventricular (i.c.v.) route, induced convulsive seizures in rats, a sign of convulsant neurotoxins. The group of Professor Joaquim Coutinho-Netto isolated from this spider venom a neurotoxin called PbTx 2.2.1 which is a GABA transporter inhibitor in the rat cortical synaptosomal preparation (in vitro), a potencially anticonvulsant property. The fractions PbTx 2.2.1 and 1.2.3 protected retinal cells against isquemy. But, it has not been tested if the PbTx 2.2.1 fraction also has an in vivo anticonvulsant action. Present work has two objectives: 1- to propose a chromatographic methodology to isolate non-proteic low molecular weigh convulsant neurotoxins from spider venoms. Isolate and partially characterize these neurotoxins from P. bistriata venom; 2- test if PbTx 2.2.1 has in vivo anticonvulsant effect. Biochemical venom isolation by gel filtration (Sephadex G-50 and G-25), reverse phase and cationic exchange in high pressure liquid cromatography (HPLC) and also HPLC coupled to mass spectrometry (HPLC-MS), has pointed that the P. bistriata spider venom has a fraction (fraction 7) and a subfraction (7.1) with convulsant activity when injected i.c.v. in rats. Fraction 7 has nucleosidic characteristics. Nuclear magnetic ressonance (NMR) has showed that the principal component of this fraction is the nucleoside iosine. An other fraction (fraction 6) isolated from the same venom, inhibited seizures induced by i.c.v. bicuculine and the fraction 1 showed acid and basic phosphatase activity PbTx 2.2.1, when injected i.c.v. 20 min prior to the convulsant bicuculline (i.c.v.), has blocked seizures in 71.4 % of the animals, what was considered an anticonvulsant effect. The conclusions are: 1- the spider venom of P. bistriata has a fraction (fraction 7) with convulsant action when injected i.c.v. in rats. The major component of this fraction is the nucleoside iosine. This spider venom also has another fraction (fraction 6) with anticonvulsant activity and one with acid and alcaline phosphatase (fraction 1); 2- the chomatographic methodology can be improved, perhaps by ultrafiltration methods; 3- the PbTx 2.2.1 fraction has anticonvulsant effect in vivo.
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Análise neuroetológica e estudo da atividade pró-convulsivante e anticonvulsivante in vivo da peçonha bruta da aranha Parawixia bistriata em ratos: injeção central e periférica. / Neuroethological analysis, convulsant and anticonvulsant in vivo activity of the Parawixia bistriata spider venom in rats: central and peripheric injections.

Rodrigues, Marcelo Cairrão Araujo 24 March 1999 (has links)
Durante a evolução, alguns animais desenvolveram toxinas que são capazes tanto de paralisar quanto de matar suas presas, através de ação seletiva sobre receptores ou canais iônicos. As acilpoliaminas, por exemplo, são componentes não-proteicos antagonistas dos receptores glutamatérgicos acoplados a canais iönicos, que mostraram-se anticonvulsivantes em diversos modelos animais. Apesar do estudo das alterações comportamentais em animais após a injeção de substâncias químicas (etofarmacologia) ter auxiliado a estudar o mecanismo de ação destas substâncias no SNC, não há relatos sobre os efeitos comportamentais da injeção i.c.v. e i.v. da peçonha da aranha Parawixia bistriata. Descobriu-se recentemente na peçonha bruta da aranha Parawixa bistriata uma ação potencialmente anticonvulsivante in vitro: ela potencia a neurotransmissão gabaérgica e desloca receptores glutamatérgicos de seus sítios específicos em sinaptosomas do cérebro de rato (FONTANA, 1997). O objetivo do presente trabalho é estudar as alterações comportamentais causadas pela injeção central e periférica da peçonha bruta de P. bistriata através de uma metodologia quantificativa (método neuroetológico), e verificar se esta peçonha possui ação anticonvulsivante in vivo em um modelo químico de indução de crises agudas - o pentilenotetrazol (PTZ, 80 mg/kg, i.p.). Os resultados mostram que a injeção i.c.v. da peçonha bruta origina nos ratos dois quadros comportamentais, identificados como crises convulsivas, denominados de crises graves e leves. Nas crises graves, observou-se, entre outros, mioclonias semelhantes às crises convulsivas límbicas descritas por Racine (1972). As crises leves são caracterizadas por tremores generalizados, e sacudidelas de corpo (wet dog shakes). A injeção da peçonha i.v. não origina crises nos animais mas, no entanto, causa um intenso aumento nas interações estatísticas das seqüências comportamentais, que lembram em muito as atividades de deslocamento. Tanto nas crises graves, leves, e na injeção i.v., a neuroetologia permitiu a visualização das interações entre as mioclonias convulsivas límbicas e os outros comportamentos, dados não fornecidos pelas escalas de medição de intensidade das crises límbicas. Buscando indícios da presença de componentes anticonvulsivantes não-proteicos (como acilpoliaminas), injetou-se i.c.v. a peçonha de P. bistriata fervida (numa dose que não causa crises nem alteração motora per se), seguida da injeção i.p. de PTZ. Verificou-se que este tratamento abole as crises clônicas e tônicas induzidas por PTZ. Conclui-se que a peçonha bruta de P. bistriata provavelmente possui componentes pró-convulsivantes com possível ação sobre o sistema límbico. Esta peçonha pode conter, também, componentes anticonvulsivantes não-proteicos, possivelmente acilpoliaminas. / Spider venoms have hight affinity and specificity for neuronal receptors, transporters and ion channels, therefore been important tools to characterize mammal and insect nervous system. However, behavioural alterations in mammals caused by injections of spider venoms have not been studied in detail. In this work we describe the rat behavioural alteration caused by central injection of the crude venom of the spider Parawixia bistriata, using a neuroethological methodology. There were seen two types of seizures, named mild and severe. Neuroethological flowcharts showed that in mild seizures, there was a strong statistical correlation (c2) between tremor followed by laying or by laying left, which indicates that the venom, perhaps, is difficulting central coordination of movements. In severe seizures, this effect is enworsed, with the animal falling.This type of seizure are similar to those described by Racine (1972). Since the crude venom of P. bistriata showed a potencial anticonvulsant activity in vitro, we tested if it would indeed inhibit clonic and tonic convulsions induced by pentilenetetrazole (PTZ; 80 mg/kg, i.p.). Boiled crude venom of P. bistriata was i.c.v. injected, and 20 minutes later, animals (n=10) received PTZ. A control group (n=10) received only PTZ. The results were: central injection of the venom abolished clonic and tonic convulsions induced by PTZ, in 60% of the animals. In conclusion, the crude spider venom of P. bistriata, centrally injected, causes central loss of movement coordination, and elicits limbic seizures similar to those described by Racine (1972), but, when boiled and injected in lower doses, it blocks clonic and tonic convulsions induced by PTZ (80 mg/kg).
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Molecular Structure and Dynamics of Spider Silk and Venom Proteins Investigated by Nuclear Magnetic Resonance

January 2014 (has links)
abstract: Spider dragline silk is well known for its outstanding mechanical properties - a combination of strength and extensibility that makes it one of the toughest materials known. Two proteins, major ampullate spidroin 1 (MaSp1) and 2 (MaSp2), comprise dragline silk fibers. There has been considerable focus placed on understanding the source of spider silk's unique mechanical properties by investigating the protein composition, molecular structure and dynamics. Chemical compositional heterogeneity of spider silk fiber is critical to understand as it provides important information for the interactions between MaSp1 and MaSp2. Here, the amino acid composition of dragline silk protein was precisely determined using a solution-state nuclear magnetic resonance (NMR) approach on hydrolyzed silk fibers. In a similar fashion, solution-state NMR was applied to probe the "13"C/"15"N incorporation in silk, which is essential to understand for designing particular solid-state NMR methods for silk structural characterization. Solid-state NMR was used to elucidate silk protein molecular dynamics and the supercontraction mechanism. A "2"H-"13"C heteronuclear correlation (HETCOR) solid-state NMR technique was developed to extract site-specific "2"H quadrupole patterns and spin-lattice relaxation rates for understanding backbone and side-chain dynamics. Using this technique, molecular dynamics were determined for a number of repetitive motifs in silk proteins - Ala residing nanocrystalline &beta-sheet; domains, 3"1"-helical regions, and, Gly-Pro-Gly-XX &beta-turn; motifs. The protein backbone and side-chain dynamics of silk fibers in both dry and wet states reveal the impact of water on motifs with different secondary structures. Spider venom is comprised of a diverse range of molecules including salts, small organics, acylpolyamines, peptides and proteins. Neurotoxins are an important family of peptides in spider venom and have been shown to target and modulate various ion channels. The neurotoxins are Cys-rich and share an inhibitor Cys knot (ICK) fold. Here, the molecular structure of one G. rosea tarantula neurotoxin, GsAF2, was determined by solution-state NMR. In addition, the interaction between neurotoxins and model lipid bilayers was probed with solid-state NMR and negative-staining (NS) transmission electron microscopy (TEM). It is shown that the neurotoxins influence lipid bilayer assembly and morphology with the formation of nanodiscs, worm-like micelles and small vesicles. / Dissertation/Thesis / Ph.D. Chemistry 2014
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Análise neuroetológica e estudo da atividade pró-convulsivante e anticonvulsivante in vivo da peçonha bruta da aranha Parawixia bistriata em ratos: injeção central e periférica. / Neuroethological analysis, convulsant and anticonvulsant in vivo activity of the Parawixia bistriata spider venom in rats: central and peripheric injections.

Marcelo Cairrão Araujo Rodrigues 24 March 1999 (has links)
Durante a evolução, alguns animais desenvolveram toxinas que são capazes tanto de paralisar quanto de matar suas presas, através de ação seletiva sobre receptores ou canais iônicos. As acilpoliaminas, por exemplo, são componentes não-proteicos antagonistas dos receptores glutamatérgicos acoplados a canais iönicos, que mostraram-se anticonvulsivantes em diversos modelos animais. Apesar do estudo das alterações comportamentais em animais após a injeção de substâncias químicas (etofarmacologia) ter auxiliado a estudar o mecanismo de ação destas substâncias no SNC, não há relatos sobre os efeitos comportamentais da injeção i.c.v. e i.v. da peçonha da aranha Parawixia bistriata. Descobriu-se recentemente na peçonha bruta da aranha Parawixa bistriata uma ação potencialmente anticonvulsivante in vitro: ela potencia a neurotransmissão gabaérgica e desloca receptores glutamatérgicos de seus sítios específicos em sinaptosomas do cérebro de rato (FONTANA, 1997). O objetivo do presente trabalho é estudar as alterações comportamentais causadas pela injeção central e periférica da peçonha bruta de P. bistriata através de uma metodologia quantificativa (método neuroetológico), e verificar se esta peçonha possui ação anticonvulsivante in vivo em um modelo químico de indução de crises agudas - o pentilenotetrazol (PTZ, 80 mg/kg, i.p.). Os resultados mostram que a injeção i.c.v. da peçonha bruta origina nos ratos dois quadros comportamentais, identificados como crises convulsivas, denominados de crises graves e leves. Nas crises graves, observou-se, entre outros, mioclonias semelhantes às crises convulsivas límbicas descritas por Racine (1972). As crises leves são caracterizadas por tremores generalizados, e sacudidelas de corpo (wet dog shakes). A injeção da peçonha i.v. não origina crises nos animais mas, no entanto, causa um intenso aumento nas interações estatísticas das seqüências comportamentais, que lembram em muito as atividades de deslocamento. Tanto nas crises graves, leves, e na injeção i.v., a neuroetologia permitiu a visualização das interações entre as mioclonias convulsivas límbicas e os outros comportamentos, dados não fornecidos pelas escalas de medição de intensidade das crises límbicas. Buscando indícios da presença de componentes anticonvulsivantes não-proteicos (como acilpoliaminas), injetou-se i.c.v. a peçonha de P. bistriata fervida (numa dose que não causa crises nem alteração motora per se), seguida da injeção i.p. de PTZ. Verificou-se que este tratamento abole as crises clônicas e tônicas induzidas por PTZ. Conclui-se que a peçonha bruta de P. bistriata provavelmente possui componentes pró-convulsivantes com possível ação sobre o sistema límbico. Esta peçonha pode conter, também, componentes anticonvulsivantes não-proteicos, possivelmente acilpoliaminas. / Spider venoms have hight affinity and specificity for neuronal receptors, transporters and ion channels, therefore been important tools to characterize mammal and insect nervous system. However, behavioural alterations in mammals caused by injections of spider venoms have not been studied in detail. In this work we describe the rat behavioural alteration caused by central injection of the crude venom of the spider Parawixia bistriata, using a neuroethological methodology. There were seen two types of seizures, named mild and severe. Neuroethological flowcharts showed that in mild seizures, there was a strong statistical correlation (c2) between tremor followed by laying or by laying left, which indicates that the venom, perhaps, is difficulting central coordination of movements. In severe seizures, this effect is enworsed, with the animal falling.This type of seizure are similar to those described by Racine (1972). Since the crude venom of P. bistriata showed a potencial anticonvulsant activity in vitro, we tested if it would indeed inhibit clonic and tonic convulsions induced by pentilenetetrazole (PTZ; 80 mg/kg, i.p.). Boiled crude venom of P. bistriata was i.c.v. injected, and 20 minutes later, animals (n=10) received PTZ. A control group (n=10) received only PTZ. The results were: central injection of the venom abolished clonic and tonic convulsions induced by PTZ, in 60% of the animals. In conclusion, the crude spider venom of P. bistriata, centrally injected, causes central loss of movement coordination, and elicits limbic seizures similar to those described by Racine (1972), but, when boiled and injected in lower doses, it blocks clonic and tonic convulsions induced by PTZ (80 mg/kg).
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Efeitos biológicos da peçonha da aranha Parawixia bistriata em ratos: isolamento e caracterização química parcial de uma neurotoxina pró-convulsivante / Biological effects of the Parawixia bistriata spider venon in rats: isolation and partially chemical characterization of a convulsant neurotoxin.

Marcelo Cairrão Araujo Rodrigues 04 February 2003 (has links)
As peçonhas de artrópodos são ricas fontes de neurotoxinas, verdadeiras ferramentas moleculares com ação seletiva e específica sobre o Sistema Nervoso Central (SNC) de mamíferos, e de grande relevância clínico-científica. Demonstramos recentemente que a peçonha de P. bistriata, quando injetada por via intracerebroventricular (i.c.v.), desencadeava crises convulsivas em ratos, um indício da existência de neurotoxinas pró-convulsivantes na peçonha dessa aranha. O grupo do Prof. Dr. Joaquim Coutinho-Netto isolou da peçonha dessa aranha várias neurotoxinas, dentre as quais uma denominada PbTx 2.2.1, que possui a capacidade de inibir a captação do neurotransmissor GABA em sinaptosomas corticais de ratos (in vitro), uma ação considerada como potencialmente anticonvulsivante. As frações PbTx 2.2.1 e 1.2.3 protegem retinas de ratos após isquêmia. Mas, não se testou o efeito anticonvulsivante dessa fração em experimentos in vivo. O presente trabalho teve dois objetivos: 1- Propor um método cromatográfico para isolar da peçonha de aranhas, neurotoxinas pró-convulsivantes não protéicas e de baixo peso molecular. Isolar e caracterizar parcialmente estas neurotoxinas da peçonha da aranha P.bistriata; 2- verificar se a fração PbTx 2.2.1 possui efeito anticonvulsivante in vivo. O isolamento da peçonha de P. bistriata, realizado com filtração em gel (Sephadex G-50 e G-25), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (colunas de fase reversa e troca catiônica), e CLAE-acoplado a espectrometria de massa (CLAE-MS) produziu uma fração (fração 7) e um subcomponente (fração 7.1) com atividade pró-convulsivante, após injeção i.c.v. Tal fração apresenta características típicas de ácidos nucléicos. Confirmou-se, através de ressonância magnética nuclear (RMN) que o constituinte majoritário desta fração é o nucleosídeo inosina. O método cromatográfico mostrou-se muito lento. Uma outra fração (fração 6) da mesma peçonha inibiu as crises causadas por bicuculina i.c.v., ao passo que a fração 1 apresentou atividade de fosfatase ácida e alcalina. A injeção i.c.v. da fração PbTx 2.2.1, 20 min antes do convulsivante bicuculina também i.c.v., bloqueou as crises convulsivas em 71,4% dos animais, o que caracteriza um efeito anticonvulsivante in vivo desta fração. Conclui-se que: 1- A peçonha de P. bistriata possui, dentre muitas, uma fração (fração 7) com efeito pró-convulsivante quando injetada i.c.v. em ratos. Nesta fração, aparentemente o composto majoritário é o nucleosídeo inosina. A peçonha da mesma aranha possui também uma fração com atividade anticonvulsivante (fração 6) e outra com atividade de fosfatase ácida e alcalina (fração 1). 2- o método cromatográfico proposto pode ser otimizado talvez pelo uso de ultrafiltração; 3- a fração PbTx 2.2.1 apresenta efeito anticonvulsivante in vivo no modelo de indução de crises por injeção i.c.v. de bicuculina. / Arthropod venoms are rich sources of neurotoxins, molecular tools with selective and specific actions over the mamalian central nervous system with great clinical and scientific importance. Previous work of our laboratory showed that the spider venom of Parawixia bistriata, when injected by intracerebroventricular (i.c.v.) route, induced convulsive seizures in rats, a sign of convulsant neurotoxins. The group of Professor Joaquim Coutinho-Netto isolated from this spider venom a neurotoxin called PbTx 2.2.1 which is a GABA transporter inhibitor in the rat cortical synaptosomal preparation (in vitro), a potencially anticonvulsant property. The fractions PbTx 2.2.1 and 1.2.3 protected retinal cells against isquemy. But, it has not been tested if the PbTx 2.2.1 fraction also has an in vivo anticonvulsant action. Present work has two objectives: 1- to propose a chromatographic methodology to isolate non-proteic low molecular weigh convulsant neurotoxins from spider venoms. Isolate and partially characterize these neurotoxins from P. bistriata venom; 2- test if PbTx 2.2.1 has in vivo anticonvulsant effect. Biochemical venom isolation by gel filtration (Sephadex G-50 and G-25), reverse phase and cationic exchange in high pressure liquid cromatography (HPLC) and also HPLC coupled to mass spectrometry (HPLC-MS), has pointed that the P. bistriata spider venom has a fraction (fraction 7) and a subfraction (7.1) with convulsant activity when injected i.c.v. in rats. Fraction 7 has nucleosidic characteristics. Nuclear magnetic ressonance (NMR) has showed that the principal component of this fraction is the nucleoside iosine. An other fraction (fraction 6) isolated from the same venom, inhibited seizures induced by i.c.v. bicuculine and the fraction 1 showed acid and basic phosphatase activity PbTx 2.2.1, when injected i.c.v. 20 min prior to the convulsant bicuculline (i.c.v.), has blocked seizures in 71.4 % of the animals, what was considered an anticonvulsant effect. The conclusions are: 1- the spider venom of P. bistriata has a fraction (fraction 7) with convulsant action when injected i.c.v. in rats. The major component of this fraction is the nucleoside iosine. This spider venom also has another fraction (fraction 6) with anticonvulsant activity and one with acid and alcaline phosphatase (fraction 1); 2- the chomatographic methodology can be improved, perhaps by ultrafiltration methods; 3- the PbTx 2.2.1 fraction has anticonvulsant effect in vivo.
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Characterization of bioactive peptides without disulfide bridges from the venom of Lycosa poonaensis species inhabiting the Egyptian environment / エジプト地域に棲息するLycosa poonaensisの毒液に含まれるジスルフィド結合を持たない生理活性ペプチドの構造決定

Megaly, Alhussin Mohamed Abdelhakeem 26 September 2022 (has links)
京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第24241号 / 農博第2520号 / 新制||農||1094(附属図書館) / 学位論文||R4||N5412(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻 / (主査)教授 宮川 恒, 教授 三芳 秀人, 教授 森 直樹 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM
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Envolvimento das cavéolas na permeabilidade da barreira hematoencefálica após envenenamento por Phoneutria nigriventer em ratos = Involvement of the caveolae in the permeability of the blood-brain barrier after envenoming by Phoneutria nigriventer in rats / Involvement of the caveolae in the permeability of the blood-brain barrier after envenoming by Phoneutria nigriventer in rats

Soares, Edilene Siqueira, 1989- 04 July 2015 (has links)
Orientador: Maria Alice da Cruz-Höfling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T16:36:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soares_EdileneSiqueira_M.pdf: 11448561 bytes, checksum: 00aace7be2d8fec579aea2fd4166f813 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Neste trabalho investigamos a permeabilização da barreira hematoencefálica (BHE) pela peçonha da aranha Phoneutria nigriventer (PNV) através da via transcelular no cerebelo de ratos. As cavéolas foram analisadas nas células endoteliais pela expressão de proteínas associadas à sua formação (caveolina-1, Cav-1 e dinamina-2, Din2) e internalização (caveolina-1 fosforilada, pCav-1 e quinase da família Src, SKF), e nos astrócitos com avaliação da caveolina-3 (Cav-3) e da conexina-43 (Cx43) (formadora de junções comunicantes). A ação do PNV sobre o endotélio também foi avaliada pela ativação (acoplamento) ou inativação (desacoplamento) da enzima eNOS, produtora de óxido nítrico (NO). As estruturas que compõe a BHE foram avaliadas através de microscopia eletrônica de transmissão. Inicialmente, o estudo de Cav-1 contemplou sua localização, expressão gênica e proteica após o envenenamento em diferentes idades, ratos neonatos eram mais suceptíveis ao envenenamento do que ratos adultos. Após PNV, a imunomarcação para Cav-1 foi mais evidente na camada granular e molecular e em neurônios de Purkinje. A expressão Cav-1 e Din2 (foramdoras das vesículas e seu gargalo, respectivamente) aumentou em períodos de envenenamento agudo (1 h), de recuperação (5 h) e na ausência de sinais clínicos (24 h); em contrapartida SKF e pCav-1 envolvidas na internalização caveolar foram superexpressas em períodos opostos (às 2 h e 72 h). O PNV induziu aumento da metaloproteinase-9 da matriz (MMP9), importante mediadora de quebra da BHE e aumentou a formação e o tráfego de vesículas no endótelio após envenenamento. A análise de eNOS revelou desacoplamento (aumento de monômeros) nos períodos de envenenamento agudo (1-2 h) com progressivo retorno e super-expressão de dímeros (re-acoplamento) às 72 h; essas alterações foram relacionadas à ação do PNV sobre os níveis intracelulares de cálcio investigado pelo aumento na expressão de calmodulina e confimado pela localização de calbindina-D28. Os dados revelam a interferência do PNV sobre a homeostase endotelial e função vascular ao afetar o sistema eNOS/NO, importante controlador do tônus vascular. Nos astrócitos, as cavéolas são formadas por Cav-3 e sua superexpressão é associada a doenças neurológicas. O PNV aumentou significativamente os níveis basais de Cav-3 em astrócitos GFAP positivos (astrogliose reativa) em períodos de aumento de Cx43 (às 1, 5 e 24 h), e na vigência de edema citotóxico nos pés astrocitários e alterações nos contatos sinápticos axo-dendríticos e axo-somáticos. Em conjunto os resultados revelam que: (a) a quebra da via transcelular da BHE pelo PNV tem aumento da endocitose via cavéolas; (b) componentes da unidade neurovascular, como endotélio, astrócitos e neurônios estão intimamente envolvidos; (c) no endotélio, os efeitos são mediados pelo sistema eNOS/NO; (d) a SKF ativa o sistema endocítico e de transporte vesicular; (e) nos astrócitos, a dinamica expressão de Cx43 e Cav-3 e o retorno aos níveis basais em paralelo com a ausência de sinais de intoxicação nos animais (72 h) dá evidências de que ambas as proteínas interagem na resposta astrocitária. Os dados permitem sugerir que a presença de peptídeos neurotóxicos no veneno de Phoneutria nigriventer estão no centro dos efeitos aqui relatados / Abstract: In this work, we investigated the blood-brain barrier (BBB) permeabilization induced by Phoneutria nigriventer venom (PNV) in the transcellular route of rats¿ cerebellum. Caveolae was analyzed in endothelial cells accessing the expression of proteins involved in caveolae formation (caveolin-1, Cav-1 and dynamin-2, Dyn2) and internalization (phosphorylated Caveolin-1, pCav-1 and Src kinase family, SKF), in astrocytes caveolae role were evaluated with caveolin-3 (Cav-3) and connexin-43 (Cx43) (gap-junction main protein). PNV action on the endothelium was also investigated through activation (coupling) or inactivation (uncoupling) of eNOS enzyme, responsible for nitric oxide (NO) production. BBB components were evaluated using transmission electron microcopy. Initially, Cav-1 study addressed its localization along with Cav-1 protein and gene expression after envenoming in different age animals, neonate rats were more susceptible to envenoming than adult rats. After PNV, Cav-1 labeling was intense in granular and molecular layers and in Purkinje neurons. Cav-1 and Dyn2 (responsible for caveolae vesicles formation and scission, respectively) expression increased in periods of acute envenomation (1 h), recovery (5 h) and in the absence of clinical signals (24 h); in opposition SKF and pCav-1 involved in caveolae internalization were overexpress in opposite periods (at 2 h and 72 h). PNV induced increases in matrix metaloproteinases-9 (MMP9) an important BBB breakdown mediator, and increases in vesicles formation and traffic in the endothelium after envenoming. The study of eNOS activity revealed uncoupling (increasing in eNOS monomers) in acute periods after envenomation (1 h and 2 h) and progressive return followed by overexpression of dimers (re-coupling) at 72 h; those alterations were related to PNV action on calcium intracellular levels confirmed by Calmodulin increased expression and confirmed using Calbindin-D28 localization. Data revealed PNV interference on endothelial homeostasis and vascular function once affects the eNOS/NO system, an important vascular tonus controller. In astrocytes, caveolae are formed by Cav-3 and its overexpression is related to neurological disorders. PNV increased the basal levels of Cav-3 in GFAP-positive astrocytes (reactive astrogliosis) in the same periods as increased Cx43 (at 1, 5 e 24 h), during cytotoxic edema in astrocytes end-feet and alterations in axo-dendrites and axo-somatic synaptic contacts. Together, the results revealed that: (a) the BBB breakdown in transcellular route by PNV involves upregulation of caveolae endocytosis (b) the neurovascular unit components such as the endothelium, astrocytes and neurons are intimal involved (c) in the endothelium the effects are mediated by the eNOS/NO system and (d) SKF activates endocytic system and vesicular transport; (e) in the astrocytes, Cx43 and Cav-3 dynamic expression and their return to basal level in parallel with the absence of toxic signals in the animals (72 h) provides evidence that both protein interacts in astrocytes response. The data allows us to suggest that the neurotoxic peptides presented in Phoneutria nigriventer venom are in the center of the effects reported here / Mestrado / Biologia Tecidual / Mestra em Biologia Celular e Estrutural
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Identification, caractérisations physico-chimiques et pharmacologiques de nouveaux inhibiteurs de la mélanogenèse isolés à partir de venins d'animaux : exemple de l'Argiotoxine-636 / Identification, physico-chemical and pharmacological characterizations of a new melanogenesis inhibitor, isolated from animal venoms : argiotoxin-636 example

Verdoni, Marion 01 June 2015 (has links)
La mélanogenèse engage 3 enzymes. La tyrosinase catalyse l’oxydation des 2 premiers substrats pour former la DOPAquinone. Celle-ci, en présence de cystéine peut s’y conjuguer pour produire des pheomélanines (pigments clairs). En son absence, la DOPAquinone est convertie en DOPAchrome, précurseur de la voie de synthèse des eumélanines (pigments foncés). Leur formation implique deux autres enzymes : TRP-1 et TRP-2. Un dérèglement de ce processus entraîne des dermatoses de type hyperpigmentations chez les phototypes IV à VI. Traiter ces problématiques efficacement sans effets secondaires nécessite d'identifier de nouvelles molécules actives capables de réguler la synthèse des eumélanines.Pour atteindre l'objectif, nous avons évalué l’effet inhibiteur de 100 venins d’animaux sur l’activité DOPA oxydase de la tyrosinase de champignon. Des analyses HPLC et spectrophotométriques alternées, ont permis de localiser la sous-fraction active conte-nant la molécule d'intérêt. La détermination du poids moléculaire par spectrométrie de masse conjuguée à l’analyse d'AA après hydrolyse acide a permis d'identifier l’Argiotoxine-636 (ARGTX-636). Elle est un inhibiteur mixte de la diphénolase. Des études préliminaires de SAR ont également été réalisées. En parallèle, une méthode analytique par HPLC/MS a été mise au point pour confirmer l'activité inhibitrice de la DHICA oxydase de l'enzyme par l'ARGTX-636.Pour la première fois est reportée l’isolation et la caractérisation d’un nouveau composé extrait d’un venin d’araignée capable de réguler la mélanogenèse. Cette approche peut avoir un impact majeur dans la recherche de nouvelles molécules actives dans le domaine de la dermo-cosmétique. / Melanogenesis involves three enzymes. Tyrosinase catalyses the oxidation of the two first substrates and leads to the formation of DOPAquinone, which may be conjugated with cysteine to produce pheomelanins (red-yellow pigments). In absence of cys-teine, DOPAquinone is spontaneously converted in DOPAchrome, the precursor of eumelanin products (brown-black pig-ments). The formation of eumelanin molecules partially relies on the activity of two other enzymes called Tyrosinase related protein 2 and Tyrosinase related protein 1. A dysregulation of this process engenders hyperpigmentation tasks into skin IV to VI phototypes. To treat these issues effectively without side effects requires the identification of new active molecules able to regulate the eumelanin synthesis.To achieve the objective, we evaluated the inhibitory effect of 100 animals venoms, on the DOPA oxidase activity of mushroom tyrosinase. HPLC and spectrophotometric analysis alternating, we allowed us to localize the active sub-fraction containing the interest molecule. The molecular weight determination by mass spectrometry combined with the AA analysis after acid hy-drolysis identified argiotoxin-636 (ARGTX-636). It is a mixed-type inhibitor on diphenolase activity. SAR preliminary stu-dies have also been conducted. In parallel, an analytical method by HPLC / MS was developed to confirm the DHICA oxy-dase activity inhibitory effect by ARGTX-636.For the first time is reported the isolation and characterization of a novel compound extracted from a spider venom able to regulate melanogenesis process. This approach can have a major impact in the search for new active compounds in the dermo-cosmetics field.
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Vice President Research, Office of the January 2009 (has links)
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