Tripanossomas são parasitas obrigatórios de uma grande variedade de hospedeiros vertebrados e invertebrados sendo descritas até hoje centenas de espécies, genótipos, linhagens e DTUs. Análises moleculares foram chaves para perceber a complexidade deste gênero e necessários na predição de histórias evolutivas entre tripanossomas patogênicos e não patogênicos do velho e novo mundo. Além dos marcadores tradicionais (SSU rDNA e gGAPDH), o gene Spliced Leader (SL) tem sido útil na identificação e genotipagem de tripanossomatídeos, mas poucas espécies possuem genes SL bem estudados. Este trabalho caracterizou as estruturas primárias e secundárias do gene SL de várias espécies representantes dos principais clados de tripanossomas, evidenciando seu polimorfismo inter e intra-específico e mostrando sua utilidade como DNA barcoding. Os resultados obtidos permitiram a descrição de novas espécies (T. livingstonei e T. wauwau), a identificação de subgrupos nas DTUs de T. cruzi e suportaram os relacionamentos filogenéticos obtidos com os marcadores tradicionais. / Trypanosomes are obligate parasites found in a great variety of vertebrate and invertebrate hosts, with hundreds of species, genotypes, lineages and discrete typing units (DTUs) being described. Molecular analyses have been essential to understanding the complexity of trypanosomes and to predict the evolutionary history of the non-pathogenic and pathogenic species from the Old and New World. Besides traditional phylogenetic markers (SSU rDNA and gGAPDH), Spliced Leader (SL) gene has proven useful for identifying and genotyping trypanosomatids, but well defined SL sequences are available for only a few species. In this study, SL primary and secondary structures were determined for species representatives of the main trypanosome clades, showing inter and intra-specific variability that rendered them useful for DNA barcoding. SL results allowed the description of new trypanosome species (T. livingstonei and T. wauwau), the identification of subgroups in the T. cruzi DTUs, in addition to support the phylogenetic relationships obtained with traditional markers.