Alternative splicing is a major contributing factor to protein diversity. The human genome project validated that there are about 25,000 genes, but over 100,000 proteins. Genes contain numerous exons that are specifically regulated; thus, elucidating alternative splicing mechanisms of pre-mRNAs is an immense undertaking. Two basic tools are used to study this mammoth task. For in vitro studies, usually in vitro transcription followed by splicing assays is used. For in vivo studies, the main technique is the construction of minigenes. These techniques enable one to study the mechanisms/conditions that explain an exon's inclusion or exclusion in the mature mRNA. In this project, studies were focused in the protein kinase C (PKC) family, and specifically in certain exons of PKCbeta and PKCdelta genes. The PKCbeta gene codes two proteins: PKCbetaI and PKCbetaII. The pre-mRNA of PKCbeta contains 18 exons. If exon-17 (exon-betaII) is included in the spliced transcript, protein PKCbetaII is expressed. If exon-betaII is skipped (excluded), protein PKCbetaI is expressed. Previous and current results indicate that insulin treatment not only favors exon-betaII inclusion, but also regulates 3?-UTR size in mature mRNA. We identified up to five different PKCbetaII mRNAs that differ only in the 3?-UTR size (all five mature transcripts express the same PKCbetaII protein). PKCbetaII is required for glucose uptake in skeletal muscle and adipocytes. Additional studies revealed that inclusion of exon-betaII involves SRp40 in its phosphorylated form. Small interfering RNA (siRNA) knockdown of Akt2 and Clk1 further revealed that SRp40 was phosphorylated by Akt2/Clk1, and that Akt2 phosphorylates Clk1. The knockdown of Clk1 or SRp40 down-regulated glucose uptake. The PKCdelta gene contains 18 exons. The standard size of exon-10 is 97-bases, and when included in the mature transcript, PKCdeltaI is expressed. Exon-10 has an additional 5?-splice site that extends the exon size to 190-bases. When this extended size is included in the mature transcript, PKCdeltaVIII is expressed which has a profound effect in the fate of the cell by blocking apoptosis. Our results reveal that all-trans retinoic acid regulates the inclusion of exon-10 extended size. Moreover, the inclusion involves SC35 (SRp30b). Finally, we elucidated the position of the SC35 cis-element.

L'épissage alternatif des ARNs pré-messagers est le mécanisme majeur de diversification de l'information génétique chez les eucaryotes supérieurs. Près de 70% des gènes sont concernés par ce mécanisme. Au cours de la différenciation érythroïde, l'inclusion de l'exon 16 du pré-messager 4.1R représente un événement majeur pour la fonction érythrocytaire normale de la protéine 4.1R. Cet événement d’épissage est bloqué dans les cellules MEL surexprimant l’oncoprotéine Spi.1/PU.1. Mon travail de thèse avait pour but de comprendre ce mécanisme de blocage en étudiant le rôle de la voie de signalisation de la PI3K en relation avec la phosphorylation de Spi.1/PU.1 d'une part, et celle des facteurs d'épissage de la famille des protéines SR d'autre part. J’ai montré que l’inhibition de la PI3K active la production d’hémoglobine ainsi que l’épissage de l’exon 16 4.1R. Ensuite j’ai montré que la phosphorylation de Spi-1/PU.1 par la PI3K est nécessaire pour son activité d’inhibition de la différenciation et de l’épissage de l’exon 16 4.1R. Enfin, j’ai montré que le facteur d’épissage Srp40 de la famille des protéines SR est un activateur stade spécifique de l’inclusion de l’exon 16. La surexpression de Srp40 dans les cellules MEL active l’inclusion de l’exon 16 indépendamment de la différenciation. / Pre-mRNA alternative splicing is a major mechanism of diversification of genetic information in evolued eukaryotes. The expression of about 70% of genes is regulated by this mechanism. During late erythroid development, the inclusion of exon 16 in the mature 4.1R mRNA is a major event that is essential for the corresponding protein function. This process is inhibited in MEL cells overexpressing the oncoprotein Spi-1/PU.1. My thesis work aims to understand the mechanism of this inhibition by studying the role of PI3K signal transduction pathway and its effects on Spi-1/PU.1 in the first place, then its effects on the SR protein family. I showed that PI3K inhibition leads to the activation of hemoglobin synthesis and to the inclusion of exon 16. Moreover, I showed that the phosphorylation mediated by the PI3K pathway is necessary for both the differentiation-inhibiting activity of Spi-1/PU.1 and concurrent inclusion of exon 16. Finally, I showed that the Srp40 splicing factor is an activator of the exon 16 inclusion. Overexpression of Srp40 in MEL cells lineage activates exon 16 inclusion independently of the differentiation.

L'épissage alternatif des ARNs pré-messagers est le mécanisme majeur de diversification de l'information génétique chez les eucaryotes supérieurs. Près de 70% des gènes sont concernés par ce mécanisme. Au cours de la différenciation érythroïde, l'inclusion de l'exon 16 du pré-messager 4.1R représente un événement majeur pour la fonction érythrocytaire normale de la protéine 4.1R. Cet événement d'épissage est bloqué dans les cellules MEL surexprimant l'oncoprotéine Spi.1/PU.1. Mon travail de thèse avait pour but de comprendre ce mécanisme de blocage en étudiant le rôle de la voie de signalisation de la PI3K en relation avec la phosphorylation de Spi.1/PU.1 d'une part, et celle des facteurs d'épissage de la famille des protéines SR d'autre part. J'ai montré que l'inhibition de la PI3K active la production d'hémoglobine ainsi que l'épissage de l'exon 16 4.1R. Ensuite j'ai montré que la phosphorylation de Spi-1/PU.1 par la PI3K est nécessaire pour son activité d'inhibition de la différenciation et de l'épissage de l'exon 16 4.1R. Enfin, j'ai montré que le facteur d'épissage Srp40 de la famille des protéines SR est un activateur stade spécifique de l'inclusion de l'exon 16. La surexpression de Srp40 dans les cellules MEL active l'inclusion de l'exon 16 indépendamment de la différenciation.