Modulation par PPARa des concentrations en microparticules dans un modèle murin d’athérosclérose et de stéato-hépatite non alcooliqueL'athérosclérose et la stéato-hépatite non alcoolique sont des pathologies complexes fréquemment associées au syndrome métabolique. Elles se caractérisent par une accumulation de lipides et le développement d’une inflammation chronique susceptible d’induire un stress cellulaire qui peut conduire à la formation de microparticules (MPs). Ces petites vésicules membranaires (0,1-1µm) produites par les cellules activées, sont susceptibles d’exacerber l’inflammation. Il a été montré que le fénofibrate, une molécule hypolipémiante dont le mécanisme d’action passe par l’activation du récepteur nucléaire PPARa (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor a), inhibe le développement de l’athérosclérose et de la stéato-hépatite dans un modèle expérimental murin. L’objectif de notre travail a été d’une part 1) d’étudier l’influence du développement de l’athérosclérose et de la stéatose hépatique sur les concentrations en MPs au niveau plasmatique et au niveau des lésions d’athérosclérose et du foie, respectivement, en utilisant un modèle expérimental murin développant une athérosclérose et une stéato-hépatite non alcoolique, la souris apoE2-KI, 2) d’analyser la modulation par PPARa des concentrations en MPs dans les lésions athéroscléreuses, le foie et la circulation sanguine. Nous avons montré que le développement de lésions d’athérosclérose chez la souris apoE2-KI était lié à une augmentation de la concentration en MPs dans le sinus aortique, siège du développement de ces lésions. Un traitement par le fénofibrate réduit la concentration en MPs, ceci parallèlement à son effet inhibiteur du développement de l’athérosclérose mais également dans des lésions établies, sur lesquelles le fénofibrate n’a pas d’effet curatif en terme de surface des lésions et du contenu en lipides et en macrophages. Ces effets n’apparaissent pas dans la souris E2-KI déficiente pour PPARa, montrant l’implication du récepteur dans ces processus. Le développement de la stéatose hépatique induit également une augmentation de la concentration en MPs dans le foie. Cependant, le fénofibrate n’a pas d’effet sur la concentration en MPs, en dépit de son effet bénéfique dans le développement de la stéatose hépatique. Ces travaux ont mis en évidence pour la première fois la présence de MPs dans un modèle murin d’athérosclérose et de stéato-hépatite non alcoolique. L’activation de PPAR module différemment les concentrations en MPs dans la lésion d’athérosclérose et le foie des souris apoE2-KI. II) Rôle de PPARg dans l’efférocytose par les macrophages alternatifs humainsL’efférocytose est un processus physiologique permettant d’éliminer les cellules en apoptose, évitant ainsi qu’elles n’entrent en nécrose et ne libèrent leur contenu toxique. C’est un processus complexe faisant intervenir de nombreuses voies et molécules, notamment la thrombospondine-1 (TSP-1). PPARg, un récepteur nucléaire appartenant à la famille des PPARs, est principalement exprimé dans le tissu adipeux, mais également dans les macrophages. L’objectif de ce travail a été d’étudier l’effet de l’activation de PPARg sur l’efférocytose par les macrophages alternatifs humains.Nous avons comparé l’expression de plusieurs gènes impliqués dans l’efférocytose entre des macrophages primaires humains différenciés classiquement (RM) ou alternativement (M2), activés ou non avec un agoniste de PPARg (GW1929) à la fin de la différenciation. L’expression de différents gènes codant pour des protéines impliquées dans le processus d’efférocytose augmente dans les M2 par rapport aux RM. Nous avons comparé l’expression de ces mêmes gènes dans des zones de plaques d’athérosclérose humaines définies comme M2 ou non selon des marquages immunohistochimiques (détection du mannose-récepteur). / Atherosclerosis and non-alcoholic-steatohepatitis (NASH) are complex pathologies associated withmetabolic syndrome. They are characterized by lipid accumulation and chronic inflammation which can inducecellular stress and microparticle (MP) formation. These small membrane vesicles (0.1-1μm) produced fromactivated cells have deleterious properties such as inflammation enhancement. Fenofibrate, a hypolipemic drugactivating PPARa (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor a), inhibits atherosclerosis and NASHdevelopment in a mouse experimental model.The aim of our work was first to study effects of atherosclerosis and NASH development on MPconcentrations in the plasma, atherosclerotic lesions and in the liver, and second to study PPARa modulation ofMP concentration in these contexts. For these studies, we used the apolipoprotein E2 knock-in (apoE2-KI)mouse.We showed that atherosclerosis development in apoE2-KI mice was linked to an increase of MPconcentration in the aortic sinus, location of atherosclerosis lesions in this model. Fenofibrate treatment reducedMP concentration during lesion development but also in established lesions, where this treatment has no curativeeffect on lesion area, lipid and macrophage contents. These effects did not occur in apoE2-KI PPARa deficientmice, proving PPARa implication in these processes. NASH development induced also increased MPconcentration in the liver. However, despite fenofibrate has beneficial effects on steatosis and inflammation inthe liver, this treatment did not modify MP concentration.This study put in evidence for the first time MPs in a mouse experimental model of atherosclerosis andNASH. PPARa activation differently modulates MP concentrations in atherosclerotic lesions and in the liver ofapoE2-KI mice.II) PPARg implication in efferocytosis by human alternative macrophagesEfferocytosis is a physiological mechanism allowing apoptotic cell elimination, avoiding necrosis andtoxic content liberation, triggering anti-inflammatory cytokine production by macrophages. This complexprocess depends on numerous pathways and molecules, such as thrombospondin-1 (TSP-1). Studies havereported that alternative differentiation of macrophages influenced phagocytic capacity, without addressing themolecular mechanism.The nuclear receptor Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (PPAR)g is expressed in macrophageswhere it exerts anti-inflammatory properties and its activation by synthetic ligands during monocytedifferentiation induces an alternative polarization state.The aim of our work was to study the effects of PPARg activation on efferocytosis by human alternativemacrophages.We analysed the expression of several genes implicated in efferocytosis in primary human restingmacrophages (RM) or in alternatively differentiated macrophages (M2) with or without PPARg activation byGW1929, added at the end of the differentiation. The expression of genes involved in efferocytosis was higher inM2 macrophages compared to RM. We then compared the expression of these genes in alternative M2macrophages present in the human atherosclerotic lesions. Interestingly, efferocytosis gene expression wasincreased in M2 macrophages ex vivo.We also showed that TSP-1 expression is increased by PPARg activation in human macrophages, in aPPARg-dependent manner. Using a functional phagocytosis assay with labelled apoptotic cells and fluorescentbeads, we confirmed that phagocytotic activity was increased in M2 macrophages compared to RM. Moreover,PPARg activation induced phagocytosis capacity in M2 macrophages.These results showed a new property of PPARg in macrophages. In addition to the established antiinflammatoryproperties, PPARg activation could increase apoptotic cell phagocytosis in atherosclerotic lesion,with consequences on early stage development of the pathology.

La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) est une manifestation du syndrome métabolique dont la prévalence est en constante évolution. Les stratégies thérapeutiques sont soit difficiles à mettre en œuvre soit d’une efficacité limitée. Nous avons étudié une approche nutritionnelle avec 3 acides aminés particuliers : la glutamine, l’arginine et la citrulline (Cit) pour leurs propriétés de pharmaconutriments azotés. Dans un modèle de NAFLD modérée induite par le fructose, seule la citrulline (1 g/kg/j) permettait une amélioration du métabolisme lipidique. Toutefois, l’étude de la cinétique de NAFLD suggérait un effet protecteur du simple apport azoté. L’effet spécifique de la Cit par rapport au simple apport azoté (AANE) a donc été déterminé dans un modèle de NAFLD induite par 8 semaines de régime enrichi en fructose. Ceci a permis de confirmer l’effet protecteur de la Cit et des AANE. Toutefois, la Cit exerce un effet plus spécifique sur l’expression de Srebp1c et de Fas et améliore la disponibilité périphérique en Arg, un élément important de l’insulino-sensibilité. La stéatose est associée à une perte de masse maigre, suggérant une oxydation des AA aux dépens de l’anabolisme musculaire, et une accumulation de lipides à l’origine de la stéatose et du gain de masse grasse viscérale ; la Cit et les AANE en agissant sur la NAFLD préviendraient cet effet du fructose. Nous avons ensuite évalué les effets de la Cit dans un modèle de stéatose plus sévère induite par le western diet. La Cit améliore la fonction hépatique (diminution des lipides et de l’inflammation hépatique) et préserve l’axe intestin-foie (restauration du groupe Bacteroides/Prevotella dans la muqueuse colique, diminution de l’inflammation intestinale et augmentation de l’expression de la Claudine 1) mais ne permet pas de prévenir l’ensemble des altérations liées au western diet. Il serait intéressant d’évaluer la relation effet/dose et l’efficacité de la Cit en association avec d’autres traitements. Par ailleurs, les mécanismes cellulaires restent à élucider. / Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a manifestation of the metabolic syndrome whose prevalence is constantly growing. Therapeutic strategies are either difficult to implement or of limited effectiveness. We studied a nutritional approach with three specific amino acids: glutamine, arginine and citrulline (Cit) for their pharmaconutrient properties. In a model of moderate fructose-induced NAFLD, citrulline alone (1 g/kg/day) improved lipid metabolism. However, the study of the kinetics of NAFLD suggested a protective effect of nitrogen supply by itself. The specific effect of Cit compared to that of nitrogen (NEAAs) has been determined in a model of 8 week fructose diet-induced NAFLD. This has confirmed the protective effect of Cit and NEAAs. However, Cit exerted a specific effect on the expression of Fas and SREBP1c and improves peripheral Arg availability, an important component of insulin sensitivity. Steatosis was associated with loss of lean mass, suggesting AA oxidation at the expense of muscle anabolism, and lipid accumulation causing steatosis and visceral fat gain; Cit and NEAAs by acting on NAFLD would prevent this effect of fructose. We then evaluated the effects of Cit in a model of more severe steatosis induced by western diet. Cit improved liver function (reduced fat and liver inflammation) and protected the liver-gut axis (restoration of Bacteroides/Prevotella group in the colonic mucosa, decreased intestinal inflammation and increased expression of claudin 1) but did not prevent all western diet-induced alterations. It would be interesting to assess the dose/effect relationship and the effectiveness of Cit in combination with other treatments. Furthermore, the cellular mechanisms remain to be elucidated.

L'influence de l'hypothèse de la programmation fœtale sur la stéato-hépatite non-alcoolique (NASH) n’a pas été suffisamment étudiée. La carence en donneurs de méthyles pendant la grossesse et l'allaitement est fréquente dans la population et est un modèle expérimental de programmation fœtale. Dans ce modèle, elle entraîne une stéatose hépatique chez les ratons de 21 jours, résultant notamment d'une déficience de l'oxydation des acides gras. Nous avons évalué les effets de la programmation fœtale sur la NASH chez des rats Wistar nés de mères recevant soit un régime standard, soit un régime carencé en donneurs de méthyles (iMDD), pendant la gestation et l'allaitement. Les ratons sevrés ont ensuite reçu un régime standard (D21 à D50), puis une partie de ces rats devenus adultes ont ensuite été soumis à un régime hyper-énergétique (HF) (D50 à D185). Les animaux ont été sacrifiés à D50 et D185. Nous avons observé une augmentation de la graisse abdominale et du rapport ASAT/ALAT, mais aucune anomalie histologique hépatique chez les rats D50 iMDD. En revanche, les rats D185 iMDD/HF ont développé une NASH, avec les caractéristiques d'une insulino-résistance ainsi qu'une augmentation de l'expression de nombreux gènes et protéines impliqués dans l'inflammasome, l'activation des cellules étoilées hépatiques, la fibrose et le remodelage tissulaire, incluant l'AngII, TGFβ1 et NFκB. En conclusion, la carence en donneurs de méthyles pendant la gestation et l'allaitement produit une NASH chez des animaux soumis ultérieurement à un régime hyper-énergétique à l'âge adulte, malgré le retour préalable à une alimentation standard. Ces résultats suggèrent qu'une carence gestationnelle en donneurs de méthyles est un facteur de risque de NASH chez les individus exposés ultérieurement à un régime hyper-énergétique. / The influence of fetal programming hypothesis on non-alcoholic steato-hepatitis (NASH) has deserved insufficient interest. Methyl donor deficiency during pregnancy and lactation is frequent in population and is an experimental model of fetal programming. In this model, it produces a liver steatosis in 21 days old pups, which results from decreased fatty acid oxidation. We evaluated the effects of fetal programming on NASH in Wistar rats born from mothers fed either a control or a methyl donor deficient (iMDD) diet during pregnancy and lactation. Pups received a control diet after weaning (D21 to D50) and a part from adult rats were fed with an high-fat diet (HF) (D50 to D185). Animals were sacrificed at D50 and D185. In D50 iMDD rats, we observed an increased abdominal fat and ASAT/ALAT ratio, but no liver histological abnormality. However, D185 iMDD/HF rats have developed NASH, with hallmarks of insulin resistance and increased expression of several genes and proteins involved in inflammasome, stellate cell stimulation, fibrosis and tissu remodelling, including AngII, TGFβ1 and NFκB. In conclusion, MDD during pregnancy and lactation produces NASH in animals subjected subsequently to an high-fat diet during adulthood, despite the recovery of a control diet. These results suggest that MDD during pregnancy is a risk factor of NASH development in subjects subsequently exposed to high-fat diet.