La stéatose hépatocytaire, définie par l’accumulation de triglycérides dans les hépatocytes, est fréquente au cours de l’hépatite chronique C. La stéatose peut être induite par le VHC de génotype 3 et constitue alors une lésion cytopathique virale au cours de l’hépatite chronique C. Cette observation clinique suggère que la stéatose viro-induite est liée à la fonction d’une ou de plusieurs protéine(s) virale(s) du génotype 3 rarement portée par les protéines correspondantes de génotype non-3. L’objectif de ce travail a été d’identifier des déterminants viraux de la stéatose hépatocytaire viro-induite au cours de l’hépatite chronique C et entrevoir les mécanismes impliqués dans cette pathologie. Des analyses menées sur des séquences de VHC strictement sélectionnés pour leur génotype et leur capacité à induire une stéatose chez les patients atteints d’hépatite chronique C, ont permis de mettre en évidence des déterminants putatifs de la stéatose viro-induite. Des résidus associés au caractère stéatogène ou non stéatogène des séquences de VHC étudiées ont été identifiés dans les régions codant E1, E2 et NS3. Le caractère partiel de la compartimentation de ces mutations nécessite toutefois une étude fonctionnelle de ces séquences pour valider leur pertinence. Le motif FATG164-167 de la protéine de capside, qui a été impliqué dans l’accumulation spécifique de triglycérides par la protéine de capside, se révèle caractéristique du génotype 3 et non associé à un pouvoir stéatogène in vivo. Nous avons examiné, in vitro, selon le génotype de la protéine virale et son association avec une stéatose in vivo, d’une part les interactions entre les gouttelettes lipidiques et les protéines de capside, et d’autre part les changements morphologiques des gouttelettes lipidiques liés à l’expression de la protéine de Capside. Ces travaux montrent que les protéines de Capside de génotypes 1b et 3a sont localisées de manière similaire à la surface des gouttelettes lipidiques indépendamment du caractère stéatogènes de VHC dont elles sont issues. Néanmoins, l’expression de la protéine de capside de génotype 3 est associée à la formation de gouttelettes lipidiques plus grosses et plus nombreuses par rapport à celles de génotype 1b. Ces résultats suggèrent que l’interaction de la protéine de Capside avec les gouttelettes lipidiques pourrait jouer un rôle dans l’induction d’une stéatose par le VHC de génotype 3. L’absence de différences génétique ou fonctionnelle entre les protéines de Capside de génotype 3 issues de VHC stéatogène ou non stéatogène in vivo suggèrent cependant que d’autres protéines virales et/ou facteurs cellulaires doivent certainement être impliqués dans le développement d’une stéatose hépatocytaire chez les patients infectés par un VHC de génotype 3a / Hepatocellular steatosis is common in patients with chronic hepatitis C. Steatosis can be considered as a true cytopathic lesion induced by hepatitis C virus genotype 3, suggesting that one or more viral proteins produced during genotype 3 infection are involved in the steatogenic process, while the same proteins produced during infection by other genotypes are not. Our objective was to identify the viral determinants of HCV-induced steatosis and to understand the underlying mechanisms. Extensive analysis performed on HCV sequences selected on their genotype and their association with in vivo steatosis are revealed putative viral determinants of viral-induced steatosis in E1-E2 and NS3 proteins coding regions. However, we can not rule out the potential role of these positions in HCV-induced steatosis and experimental study should be drawn to explore this issue. In addition, the FATG164-167 motif, which has been implicated in HCV core protein induced steatosis, was constantly present on genotype 3a sequences independently of the original presence or absence of liver steatosis. We examined in vitro interactions between lipid droplets and full-length core protein isolated from patients with HCV genotype 3a infection, with and without steatosis, and from steatosis-free patients infected by hepatitis C HCV 1b. We also examined morphological changes in the lipid droplets according to the HCV genotype and the presence of steatosis in vivo. We showed that the core protein of both HCV genotypes 1b and 3a binds tightly to the surface of intracellular lipid droplets. However, cells transfected with genotype 3a contain more neutral lipids in lipid droplets, and more large lipid droplets, than cells transfected with genotype 1b sequences. This suggests that hepatitis C virus core protein-lipid droplet interaction could play a role in virus-induced steatosis. Importantly, we found no genetic or functional differences between genotype 3a core proteins from patients with and without hepatitis C virus-induced steatosis. This suggests that other viral proteins and/or host factors are involved in the development of hepatocellular steatosis in patients infected by hepatitis C virus genotype 3a

L'apolipoprotéine D (apoD) est une glycoprotéine qui transporte plusieurs molécules hydrophobes, telles que l'acide arachidonique, le cholestérol et la progestérone. Afin d'étudier le rôle neuroprotecteur de l'apoD, des souris transgéniques (Tg) surexprimant l'apoD humaine (H-apoD) principalement au niveau du cerveau ont été générées. Bien que les souris Tg H-apoD résistent mieux à la neurodégénérescence, elles souffrent de stéatose hépatique et musculaire et sont résistantes à l'insuline. Le but de ce projet est de caractériser les mécanismes moléculaires associés à l'accumulation de lipides dans le foie des souris Tg H-apoD. L'expression de plusieurs gènes hépatiques impliqués dans le métabolisme lipidique ainsi que dans le stockage de ces lipides dans des gouttelettes lipidiques (GL) a été mesurée par RT-PCR semi-quantitative et par Western Blot. Notre étude a révélé une augmentation de plus de deux fois du facteur de transcription PPARyl dans le foie des souris Tg H -apoD par rapport aux souris sauvages. Plusieurs études suggèrent qu'une modulation de PPARyl peut mener à des troubles métaboliques, puisque PPARy induit la transcription de gènes impliqués dans l'accumulation de lipides et dans la formation des GL. Afin de mesurer son niveau d'activation, le niveau d'expression de ses gènes cibles a été mesuré. Le transporteur d'acides gras CD36, impliqué dans la captation des acides gras circulants par les hépatocytes, est surexprimé de 20 %. Cide a et Cide c, deux protéines impliquées dans la stabilisation des GL sont surexprimées de 50 %. Plin2, aussi localisée au niveau des GL et impliquée dans l'inhibition de la lipolyse, est aussi surexprimée (2 fois). Cela induit la formation de GL plus larges et donc la stéatose hépatique. Probablement en compensation, le récepteur nucléaire PPARα et son gène cible CPT1, enzyme limitant de la β-oxydation, sont surexprimés de 2,5 fois et de 20 % respectivement, augmentant ainsi la dégradation des lipides accumulés. L'AMPK est également activée, ce qui semble causer une diminution du niveau de lipogenèse (surtout par la phosphorylation de l'ACC) et de la néoglucogenèse. Ces résultats démontrent que la surexpression de l'apoD induit une surexpression et une activation de PPARyl. En induisant la transcription de ses gènes cibles, PPARy provoque l'accumulation de lipides, menant à une stéatose hépatique. Par contre, nos résultats démontrent qu'un mécanisme compensatoire est aussi induit (augmentation de la β-oxydation et diminution de la lipogenèse et néoglucogenèse) expliquant le phénotype peu sévère de la stéatose observée. Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de l'apoD dans le métabolisme des lipides. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : ApoD, PPARy, stéatose hépatique

L’obésité, dont la prévalence ne cesse d’augmenter, est une préoccupation majeure des services de santé. Elle est associée à de nombreuses pathologies incluant la résistance à l’insuline, le diabète de type 2, la stéatose hépatique, la dyslipidémie, et les maladies cardiovasculaires. La stéatose hépatique non-alcoolique (NAFLD), caractérisée par une accumulation excessive de gras dans le foie, est elle-même associée à la résistance à l’insuline, à l’athérosclérose, et aux maladies cardiovasculaires. En contexte pathologique, le foie sécrète des facteurs nommés hépatokines, qui ont la capacité d’affecter le foie lui-même et les tissus périphériques. Ces facteurs représentent de potentiels biomarqueurs de la santé hépatique et/ou de potentielles cibles thérapeutiques de la NAFLD et des pathologies associées. Notre objectif a été d’identifier et de caractériser de nouvelles hépatokines exprimées et sécrétées en réponse à la stéatose hépatique en contexte d’obésité. Les travaux décrits dans cette thèse identifient Tsukushi (TSK) comme une nouvelle hépatokine exprimée et sécrétée majoritairement par le foie en réponse à l’obésité dans plusieurs modèles murins. TSK est associée à la quantité de triglycérides (TG) hépatiques indépendamment de l’obésité. Le stress du réticulum endoplasmique et l’inflammation, des conditions fortement associées à la NAFLD, régulent TSK. Les études réalisées montrent que TSK n’a pas de rôle dans le développement et la sévérité de la NAFLD. En revanche, des études chez la souris ont permis de mettre en évidence que la surproduction de TSK réduit les niveaux de cholestérol plasmatique et plus particulièrement les particules de haute densité (HDL, high-density lipoprotein), la synthèse d’acides biliaires et le transport inverse de cholestérol. Chez l’humain, l’expression de Tsk est augmentée chez les individus obèses ayant une forte quantité de TG hépatiques et une plus grande inflammation. De plus, TSK est fortement présente dans le plasma de patients souffrants de défaillance hépatique sévère induite par l’acétaminophène. Nous proposons un modèle dans lequel TSK est surproduite en réponse à la NAFLD indépendamment de l’obésité, et induit une réduction du transport inverse du cholestérol probablement dans le but de protéger le foie. Bien que l’effet initial de TSK puisse être bénéfique, une action soutenue dans l’obésité et la NAFLD pourrait contribuer à l’athérosclérose en limitant le transport inverse du cholestérol. L’ensemble de ces résultats montrent que TSK pourrait représenter un nouveau biomarqueur du stress hépatique liant la NAFLD à la dyslipidémie athérogène et à l’athérosclérose. / Obesity, whose prevalence is constantly increasing, is a major concern of the health services. It is associated with many pathologies including insulin resistance, type 2 diabetes, fatty liver disease, dyslipidemia and cardiovascular diseases. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), characterized by excessive accumulation of fat in the liver, is associated with insulin resistance, atherosclerosis and cardiovascular diseases. In a pathological context, the liver secretes factors called hepatokines, which have the ability to affect the liver itself and peripheral tissues. These factors represent potential biomarkers of liver health and / or potential therapeutic targets of NAFLD and its associated pathologies. Our objective was to identify and characterize new hepatokines expressed and secreted in response to fatty liver in the context of obesity. The work described in this thesis identifies Tsukushi (TSK) as a new hepatokine expressed and secreted mainly by the liver in response to obesity in several mouse models. TSK is associated with the amount of liver triglycerides (TG) regardless of obesity. Endoplasmic reticulum stress and inflammation, conditions strongly associated with NAFLD, regulate TSK. Studies show that TSK has no role in the development and severity of NAFLD. In contrast, studies in mice have shown that the overproduction of TSK reduces plasma cholesterol levels and more particularly high density lipoprotein (HDL), bile acid synthesis and reverse cholesterol transport. In humans, the expression of Tsk is increased in obese individuals with a large amount of hepatic TG and greater inflammation. In addition, TSK is strongly present in the plasma of patients with severe acetaminophen-induced liver failure. We propose a model in which TSK is overproduced in response to NAFLD regardless of obesity, and induces a reduction in reverse cholesterol transport likely to protect the liver. While the initial effect of TSK may be beneficial, sustained action in obesity and NAFLD may contribute to atherosclerosis by limiting the reverse cholesterol transport. All of these results show that TSK could represent a new biomarker of hepatic stress linking NAFLD to atherogenic dyslipidemia and atherosclerosis.

Par analyse bio-informatique, nous avons construit une liste de gènes candidats en identifiant ceux principalement exprimés par le foie et n'ayant pas de rôles connus dans le développement de la stéatose hépatique. L'expression hépatique des candidats potentiels a été validée par qPCR. Cette méthode a permis l'identification d'une nouvelle protéine plasmatique : Lrrc54. Nous avons découvert que l'expression hépatique de Lrrc54 augmente dans trois modèles d'obésité murins, dans un modèle de stéatose hépatique murin ainsi que chez des patients obèses ayant des degrés différents de stéatose. In vitro et in vivo, nous avons établi que le stress du réticulum endoplasmique induit ces hauts niveaux de Lrrc54. En induisant la stéatose hépatique dans un modèle de souris génétiquement invalidé pour Lrrc54, nous avons observé un profil de marqueurs pro-inflammatoires moins élevé que chez les souris sauvages indiquant un rôle pour Lrrc54 dans la promotion de l'inflammation par un mécanisme encore inconnu.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’infection par le virus de l’hépatite C est fréquente chez les patients infectés par le VIH. Chez les patients co-infectés VIH-VHC, les lésions hépatiques sont plus sévères et évoluent plus rapidement vers la cirrhose et ses complications. Cette thèse est consacrée à la description des patients co-infectés pris en charge, en France (2006-2008), à l’évaluation de la prévalence et des facteurs de stéatose hépatique chez ces patients, et à la question de l’évaluation non invasive de la fibrose hépatique. La prise en charge des patients co-infectés VIH-VHC devrait inclure un dépistage systématique de la stéatose hépatique. L’évaluation de la fibrose hépatique par l’utilisation de deux scores non invasifs (Fibroscan-Apri, Fibroscan-Fibrotest, par exemple) pourrait être envisagée. En cas de discordance entre les résultats de ces scores, une biopsie hépatique doit être réalisée. / Chronic hepatitis C virus (HCV) infection is common in patients with human immunodeficiency virus (HIV). HIV-HCV Co-infection is associated with more severe and more rapid progression of HCV, leading to increased incidence of fibrosis, cirrhosis, and end-stage liver disease. Our work is devoted to the description of HIV-HCV co-infected patients (2006-2008). We also evaluated the prevalence and factors associated with liver steatosis in these patients. Lastly, we addressed the issue of the non-invasive assessment of liver fibrosis. The management of HIV-HCV co-infected patients should comprise a systematic screening of liver steatosis. The assessment of liver fibrosis using two non-invasive tests (eg Fibroscan-Apri, Fibroscan-Fibrotest) should be considered. In case of discordance between the results of these tests, a liver biopsy must be performed.

La stéatose hépatocytaire, définie par l'accumulation de triglycérides dans les hépatocytes, est fréquente au cours de l'hépatite chronique C. La stéatose peut être induite par le VHC de génotype 3 et constitue alors une lésion cytopathique virale au cours de l'hépatite chronique C. Cette observation clinique suggère que la stéatose viro-induite est liée à la fonction d'une ou de plusieurs protéine(s) virale(s) du génotype 3 rarement portée par les protéines correspondantes de génotype non-3. L'objectif de ce travail a été d'identifier des déterminants viraux de la stéatose hépatocytaire viro-induite au cours de l'hépatite chronique C et entrevoir les mécanismes impliqués dans cette pathologie. Des analyses menées sur des séquences de VHC strictement sélectionnés pour leur génotype et leur capacité à induire une stéatose chez les patients atteints d'hépatite chronique C, ont permis de mettre en évidence des déterminants putatifs de la stéatose viro-induite. Des résidus associés au caractère stéatogène ou non stéatogène des séquences de VHC étudiées ont été identifiés dans les régions codant E1, E2 et NS3. Le caractère partiel de la compartimentation de ces mutations nécessite toutefois une étude fonctionnelle de ces séquences pour valider leur pertinence. Le motif FATG164-167 de la protéine de capside, qui a été impliqué dans l'accumulation spécifique de triglycérides par la protéine de capside, se révèle caractéristique du génotype 3 et non associé à un pouvoir stéatogène in vivo. Nous avons examiné, in vitro, selon le génotype de la protéine virale et son association avec une stéatose in vivo, d'une part les interactions entre les gouttelettes lipidiques et les protéines de capside, et d'autre part les changements morphologiques des gouttelettes lipidiques liés à l'expression de la protéine de Capside. Ces travaux montrent que les protéines de Capside de génotypes 1b et 3a sont localisées de manière similaire à la surface des gouttelettes lipidiques indépendamment du caractère stéatogènes de VHC dont elles sont issues. Néanmoins, l'expression de la protéine de capside de génotype 3 est associée à la formation de gouttelettes lipidiques plus grosses et plus nombreuses par rapport à celles de génotype 1b. Ces résultats suggèrent que l'interaction de la protéine de Capside avec les gouttelettes lipidiques pourrait jouer un rôle dans l'induction d'une stéatose par le VHC de génotype 3. L'absence de différences génétique ou fonctionnelle entre les protéines de Capside de génotype 3 issues de VHC stéatogène ou non stéatogène in vivo suggèrent cependant que d'autres protéines virales et/ou facteurs cellulaires doivent certainement être impliqués dans le développement d'une stéatose hépatocytaire chez les patients infectés par un VHC de génotype 3a

L’objectif général de ce travail était de mieux définir à travers des études cliniques le rôle de l’inflammation hépatique dans l’histoire naturelle de la NAFLD. La première étude a montré que les lésions d’inflammation lobulaire ou de fibrose, même minimes, sont associées avec un risque de progression de la maladie à moyen terme. Souvent cette progression s’accompagnait d’une aggravation des facteurs de risque métabolique. La deuxième étude a démontré que les facteurs de risque métaboliques sont fréquents chez les patients avec une maladie alcoolique du foie et augmentent significativement le risque de carcinome hépatocellulaire au stade de cirrhose. Ces résultats permettent d’identifier un groupe des patients buveurs excessifs ayant un risque élevé de carcinome hépatocellulaire. La troisième étude a porté sur une cohorte transversale de plus de 5000 patients. La stéatose était un facteur associé avec la présence des lésions d’athérosclérose indépendamment des facteurs de risque cardiovasculaire classiques. Dans une cohorte de 1800 patients suivis en moyenne 8 ans, nous avons montré que la stéatose était associée à la survenue des lésions d’athérosclérose carotidienne. Ces résultats, suggèrent que la stéatose est non seulement un marqueur de risque mais un facteur qui intervient dans la pathogenèse de l’athérosclérose carotidienne. En conclusion, nos résultats suggèrent que l'inflammation hépatique, dans un contexte de stéatose contribue à la progression des lésions hépatiques, favorise l'expression de médiateurs pro-athérogènes et l’activation des voies de carcinogenèse ce qui aurait pour effet l'apparition des complications extrahépatiques chez les patients avec NAFLD. / The aim of this work was to analyze the role of chronic systemic inflammation into the natural history of NAFLD. We first undertook a study of NAFLD patients with repeat liver biopsies and demonstrated that mild lobular or portal inflammation or fibrosis in any location substantially increases the risk of progression to steatohepatitis or advanced fibrosis. Disease progression occurred concomitant with worsening of the metabolic conditions during follow-up. In the second study, we analyzed the prevalence and the impact of steatosis and metabolic risk factors on the risk of developing hepatocellular carcinoma in patients with alcoholic cirrhosis undergoing liver transplantation. The main finding of this study was that patients with advanced ALD have a high prevalence of NAFLD, and that this comorbid association confers a significantly increased risk of hepatocellular carcinoma. These findings are important for risk stratification of HCC in patients with ALD. In the third study we demonstrated that steatosis predicted carotid atherosclerosis independently of the association with classical cardiovascular risk factors. Second, in a subset of patients with longitudinal follow-up we demonstrated that baseline NAFLD was an independent predictor for incident carotid plaques. These results suggest that NAFLD is not only a marker but also an “active player” in the pathogenesis of atherosclerosis. In conclusion, our results suggests that low-grade chronic inflammation responsible for the production of pro-atherogenic cytokines and the activation of pro-oncogenic signaling pathways might be the link between liver fibrosis progression, hepatocellular carcinoma and cardiovascular risk.

La préservation statique à froid (SCS) est l’étalon-or de la préservation des organes après une greffe. En raison de la pénurie d’organes et de l’augmentation du nombre de patients figurant sur la liste d’attente, le recours aux organes provenant des donneurs à critères élargis, lesquels sont très sensibles au syndrome d’ischémie-reperfusion (IRS), ce qui entraîne une non-fonction primaire (PNF) ou un dysfonctionnement précoce (EAD), est de plus en plus fréquent.Cette recherche avait pour but d’étudier et d’identifier de nouvelles stratégies pour améliorer la qualité de la préservation des organes - d'atténuer les séquelles de l'IRS en utilisant la machine de perfusion hépatique à différentes températures et à différentes périodes d'utilisation après le prélèvement de l'organe ou en ajoutant une hémoglobine extracellulaire en tant que transporteur d'oxygène pendant le SCS.Deux modèles différents ex-vivo ont été analysés : L’un chez le petit animal avec des foies de rats normaux et stéatosiques, pour la perfusion hypothermique (HMP) et SCS avec le transporteur d'oxygène et au niveau préclinique, des foies humains stéatosiques récusés, pour la perfusion normothermique (NMP).Les résultats ont confirmé de manière significative l'intérêt de l’HMP dans la phase pré-ischémique du SCS et celui de l'utilisation de l'hémoglobine extracellulaire en améliorant la fonction hépatique, le maintien de l'anatomie des hépatocytes et en réduisant des marqueurs du stress oxydatif, de l'apoptose et de l'inflammation. Egalement, l'utilisation de NMP a permis d'analyser les foies sévèrement stéatosiques pouvant être récupérés pour une transplantation dans un avenir très proche.Cette recherche met en évidence de nouvelles approches en matière de préservation d'organes susceptibles d'augmenter le pool d'organes et d'améliorer les résultats en transplantation hépatique.Mots-clés : greffe de foie, stockage froid dans le froid, perfusion dans une machine à foie, lésion de reperfusion par ischémie, transporteur d'oxygène. / Static cold storage (SCS) is the gold standard of organ preservation after being procured for transplantation. Due to the organ shortage and the increase of number of patients in the waiting list have pushed the use organs from extended criteria donors which are very susceptible to the ischemia reperfusion syndrome (IRS) leading to primary non-function (PNF) or to early allograft dysfunction (EAD).This research was aimed to study and identify new strategies to improve the quality of organ preservation -liver, to attenuate the IRS sequels by using the liver perfusion machine (LPM) at different temperatures and times of usage after the organ procurement or by adding an extracellular hemoglobin as an oxygen carrier during SCS.Two different ex-vivo models were analyzed: small animal -normal and steatotic rat livers, for hypothermic perfusion (HMP) and SCS with the oxygen carrier and preclinical -steatotic discarded human livers, for normothermic perfusion (NMP).The results significantly confirmed the benefit of the HMP in the preischemic phase of SCS and that of the use of the extracellular hemoglobin by improving the liver function, maintenance of the hepatocytes anatomy and by a reduction of the oxidative stress, apoptosis and inflammation markers. Also, the use of NMP permitted to analyze the severely steatotic livers that can be rescued for transplantation in the very near future.This investigation unveils new approaches in organ preservation that could increase the pool of organs and improve the results in liver transplantation. Key words: liver transplantation, static cold storage, liver machine perfusion, ischemia reperfusion injury, oxygen carrier.