L'apolipoprotéine D (apoD) est une glycoprotéine sécrétée dont l'expression est modulée dans une multitude de situations incluant les cancers de différents tissus, les désordres métaboliques et les maladies neurodégénératives. Bien que la liste des conditions présentant une augmentation de l'apoD s'allonge chaque jour, les facteurs provoquant le déclenchement de son expression, de même que la fonction de celle-ci, restent inconnus. Les travaux présentés dans cette thèse ont permis de jeter un peu de lumière sur ces deux aspects. Dans un premier temps, ces travaux ont permis de déterminer que l'apoD est une protéine de stress spécifique et que son expression est déclenchée par des stress ayant une forte composante oxydante ou inflammatoire. Cependant, alors que l'expression de l'apoD en réponse au stress oxydatif est associée à un arrêt de croissance, en condition inflammatoire, elle est accompagnée d'une stimulation de la prolifération. De plus, ces stress modifient non seulement le niveau d'expression, mais aussi la localisation intracellulaire de l'apoD. L'apoD, qui est normalement sécrétée, est réinternalisée et s'accumule dans le cytoplasme et le noyau. L'entrée de l'apoD dans la cellule influence, de plus, la prolifération cellulaire. Ces travaux ont ensuite permis de mieux cerner le rôle de cette modulation de l'apoD en situations de stress chez l'animal. Pour cela, nous avons soumis des souris surexprimant l'apoD humaine dans leur système nerveux ou n'exprimant pas l'apoD à des conditions neurodégénératives. Nous avons ainsi établi que l'apoD serait impliquée dans les mécanismes régulant la protection contre diverses atteintes neurodégénératives, incluant le stress oxydatif et l'inflammation, favorisant donc la survie suite à ces atteintes. Ainsi, l'apoD joue un rôle dans la fonction neuronale basale tel que déterminé grâce à des tests comportementaux. De plus, l'apoD limite la peroxydation lipidique lors de l'exposition au paraquat, un générateur de stress oxydatif. De façon similaire, l'apoD contrôle la production de cytokines et de phospholipase A2, réduit l'infiltration de cellules T et induit l'activation gliale en réponse à l'infection par le coronavirus humain OC43, un modèle d'inflammation aiguë. Par ailleurs, la surexpression de l'apoD humaine chez la souris favorise l'accumulation de lipides dans le foie et les muscles, favorisant ainsi le développement de la résistance à l'insuline accompagnant souvent le vieillissement physiologique. Cette accumulation de lipides a été associée à une stimulation de gènes impliqués dans la synthèse d'acides gras. Les travaux présentés dans cette thèse contribuent donc à établir l'apoD comme un facteur bénéfique favorisant la survie suite à une atteinte cellulaire. Ils suggèrent aussi l'importance de contrôler les niveaux physiologiques de l'apoD afin de maintenir l'homéostasie métabolique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Apolipoprotéine D, Arrêt de croissance, Inflammation, Lipocaline, Résistance à l'insuline, Stress oxydatif.

L'apolipoprotéine D (apoD) est une glycoprotéine qui transporte plusieurs molécules hydrophobes, telles que l'acide arachidonique, le cholestérol et la progestérone. Afin d'étudier le rôle neuroprotecteur de l'apoD, des souris transgéniques (Tg) surexprimant l'apoD humaine (H-apoD) principalement au niveau du cerveau ont été générées. Bien que les souris Tg H-apoD résistent mieux à la neurodégénérescence, elles souffrent de stéatose hépatique et musculaire et sont résistantes à l'insuline. Le but de ce projet est de caractériser les mécanismes moléculaires associés à l'accumulation de lipides dans le foie des souris Tg H-apoD. L'expression de plusieurs gènes hépatiques impliqués dans le métabolisme lipidique ainsi que dans le stockage de ces lipides dans des gouttelettes lipidiques (GL) a été mesurée par RT-PCR semi-quantitative et par Western Blot. Notre étude a révélé une augmentation de plus de deux fois du facteur de transcription PPARyl dans le foie des souris Tg H -apoD par rapport aux souris sauvages. Plusieurs études suggèrent qu'une modulation de PPARyl peut mener à des troubles métaboliques, puisque PPARy induit la transcription de gènes impliqués dans l'accumulation de lipides et dans la formation des GL. Afin de mesurer son niveau d'activation, le niveau d'expression de ses gènes cibles a été mesuré. Le transporteur d'acides gras CD36, impliqué dans la captation des acides gras circulants par les hépatocytes, est surexprimé de 20 %. Cide a et Cide c, deux protéines impliquées dans la stabilisation des GL sont surexprimées de 50 %. Plin2, aussi localisée au niveau des GL et impliquée dans l'inhibition de la lipolyse, est aussi surexprimée (2 fois). Cela induit la formation de GL plus larges et donc la stéatose hépatique. Probablement en compensation, le récepteur nucléaire PPARα et son gène cible CPT1, enzyme limitant de la β-oxydation, sont surexprimés de 2,5 fois et de 20 % respectivement, augmentant ainsi la dégradation des lipides accumulés. L'AMPK est également activée, ce qui semble causer une diminution du niveau de lipogenèse (surtout par la phosphorylation de l'ACC) et de la néoglucogenèse. Ces résultats démontrent que la surexpression de l'apoD induit une surexpression et une activation de PPARyl. En induisant la transcription de ses gènes cibles, PPARy provoque l'accumulation de lipides, menant à une stéatose hépatique. Par contre, nos résultats démontrent qu'un mécanisme compensatoire est aussi induit (augmentation de la β-oxydation et diminution de la lipogenèse et néoglucogenèse) expliquant le phénotype peu sévère de la stéatose observée. Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de l'apoD dans le métabolisme des lipides. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : ApoD, PPARy, stéatose hépatique

De nombreuses pathologies du système nerveux sont associées à une augmentation de l'apolipoprotéineD (apoD), une lipocaline également exprimée au cours du développement normal et du vieillissement. Un gène homologue de l'apoD chez la drosophile a un rôle protecteur dans les situations de stress et son absence réduit la résistance au stress oxydatif et accélère la neurodégénerescence. Notre équipe a été la première à démontrer le rôle protecteur de l'apoD chez les vertèbrés (souris) face à l'encéphalite induite par le cornavirus humain OC43 et aussi face au stress oxydatif induit par le paraquat. Afin de démontrer davantage l'effet bénéfique de l'apoD dans les situations pathologiques du système nerveux central, on a induit la neurodégénerescence en injectant l'acide kaïnique chez des souris transgéniques qui surexpriment l'apoD et des souris témoins non-transgéniques. L'acide kaïnique (analogue du glutamate) est un acide aminé excitateur dont l'activation des récepteurs dans le cerveau cause la dépolarisation des neurones et finalement la mort neuronale par apoptose (mimant la maladie d'Alzheimer). Ainsi ce modèle nous permettra de mesurer l'effet protecteur de l'apoD contre l'apoptose. Suite à l'injection intrapéritonéale, nous avons observé que l'acide kaïnique provoque des crises épileptiques chez les deux groupes de souris peu après l'injection; une légère différence concernant le taux et la gravité des convulsions entre les transgéniques et les non-transgéniques a été détectée. Cependant nous avons démontré par des analyses de type Northern, des immunobuvardages et par RT-PCR semi-quantitatif que l'acide kaïnique induit la surexpression de l'apoD endogène et provoque l'activation des cellules gliales (GFAP) dans l'hippocampe et le cervelet des souris au troisième jour après l'injection. Par contre, on a remarqué la présence de la cyclooxygénase-2 (inflammation) seulement dans l'hippocampe et le cortex de certaines souris (les souris ayant des très fortes convulsions) et son absence totale dans le cervelet. Nous avons aussi montré par la méthode TUNEL que l'acide kaïnique induit l'apoptose dans le cortex, le cervelet et surtout dans l'hippocampe, la zone la plus endommagée dans la maladie d'Alzheimer. Chez les souris transgéniques surexprimant l'apoD, dans les mêmes conditions, il y a moins d'apoptose comparativement aux souris de type sauvage, donc l'apoD pourrait jouer un rôle en modulant l'apoptose ainsi que protéger les neurones en prévenant l'apoptose. Les résultats obtenus au cours de différentes étapes de ce projet, tout d'abord mettent au point un modèle animal de neurodégénérescence associé à une surexpression de l'apoD et ensuite révèlent un autre aspect mal connu de rôle protecteur de l'apoD dans la régulation d'apoptose induite par l'acide kaïnique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Apolipoprotéine D, Neurodégénérescence, Acide kaïnique, Transgénique, TUNEL, Alzheimer, Apoptose.

Des études antérieures sur le promoteur du gène de l'apolipoprotéine D (apoD) ont montré qu'un élément cis, appelé élément de réponse au sérum (SRE) et contenant une boîte CArG, était spécifiquement impliqué dans la surexpression de l'apoD dans des cellules en arrêt de croissance. L'induction de la synthèse de l'apoD est aussi observable in vivo dans des tumeurs à faible taux de prolifération et serait associée à la régression tumorale. Cette régulation serait effectuée par des facteurs de transcription liant de façon spécifique ces éléments cis situés sur le promoteur. La présente étude a pour but de purifier et d'identifier ces protéines nucléaires ayant des propriétés de liaison spécifique, en condition normale et d'arrêt de croissance, et qui seraient liées à une activité transcriptionnelle. La purification des protéines nucléaires a été effectuée sur des billes de streptavidine couplées aux séquences promotrices biotinylées et correspondant à la région -514 à -475 du promoteur. Le séquençage par spectrométrie de masse des protéines éluées a permis d'identifier plusieurs protéines, dont deux membres de la famille des «Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins» ; le hnRNP-U et le hnRNP-A/B, aussi connu sous le nom de « CArG-Box binding Factor A» (CBF-A), le PARP-1 de la famille des «Poly (ADP-ribose) polymerase », le BUB3 (« Budding uninhibited by benzimidazoles 3 ») qui est un composant du point de contrôle de l'axe mitotique ainsi que le Kif4, une protéine faisant partie de la famille des kinésines. Les protéines hnRNP U et PARP-1 seraient directement impliquées dans J'induction de l'apoD lorsqu'elles lient son promoteur uniquement lors de l'arrêt de croissance, comparativement aux CBF-A et BUB3 qui sont présents dans les deux conditions. Le Kif4 est une protéine associée aux microtubules et spécialisée dans le transport de complexes de protéines et d'ARNms et a été purifiée uniquement en croissance cellulaire. De plus, les membres de la famille des hnRNPs sont connus pour jouer des rôles spécifiques dans la stabilité, l'épissage et le transport des ARNs entre le noyau et le cytoplasme. Plusieurs études rapportent aussi leur rôle de modulateur transcriptionnel. En accord avec ces résultats, certains membres de la famille des hnRNPs ont récemment été identifiés comme une nouvelle classe de protéines liant le poly (ADP-ribose) (pADPr), produit naturel du PARP-1. Finalement, ces résultats mettent en perspective les rôles inhabituels de ces protéines dans la modulation de l'expression génique de l'apoD et ultérieurement nous renseigneront sur la fonction physiologique de cette protéine. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Apolipoprotéine D (apoD), arrêt de croissance, «Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins» (hnRNP), «Poly (ADP-ribose) polymerase 1» (PARP-1), «CArG-Box binding Factor A» (CBF-A), «Budding uninhibited by benzimidazoles 3» (BUB3), «Kinesin superfamily protein 4 » (Kif4), spectrométrie de masse.

Depuis la découverte de l'apolipoprotéine D (ApoD) en 1973 par McConathy et Alaupovic et malgré de grandes avancées, la fonction et les mécanismes de régulation de cette protéine demeurent toujours inconnus. Quoi qu'il en soit, toutes les études faites jusqu'à présent semblent montrer qu'elle serait une protéine importante et bénéfique tant en situation normale que pathologique. Son expression génique est détectée chez presque tous les mammifères de même que chez les plantes, les insectes et certaines espèces d'oiseaux. Chez l'humain, elle est exprimée dans plusieurs tissus et hautement exprimée dans les glandes surrénales, la rate, les poumons, le cerveau, le placenta, et les reins. Par contre, chez le rat et la souris, l'expression est limitée au système nerveux central (SNC), ce qui en fait un bon modèle d'étude de la régulation génique d'ApoD. En effet, l'APOD est induite dans plusieurs cas de neuropathologies chez l'humain tel que les maladies d'Alzheimer et de Parkinson, la sclérose en plaques, la schizophrénie ainsi que dans certains cancers. L'ApoD est également induite dans plusieurs modèles de neurodégénérescence chez la souris et sa surexpression confère une neuroprotection. En corrélation avec ces faits, il est suggéré que l'APOD soit une protéine de stress pouvant être considérée comme marqueur de pathologies d'ordre neurologique d'où l'importance d'une étude plus approfondie. Les travaux présentés dans cette thèse ont permis d'éclaircir un tant soit peu les mécanismes régulant l'expression génique d'APOD lors de divers stress cellulaires. Effectivement, ces travaux présentent la purification et la caractérisation des facteurs nucléaires Parp-1, HnRNP-U, CBF-A, BUB-3, Kif4, APEX-1 et Ifi204 liant les éléments régulateurs SRE, EBS et GRE du promoteur d'APOD lors de l'arrêt de croissance par déprivation de sérum. L'activité enzymatique des protéines Parp-1, APEX-1 et ERK1/2 semble être importante dans l'induction de l'expression génique d'APOD. Sachant que l'expression d'APOD et la prolifération cellulaire sont inversement corrélées dans plusieurs types de cellules, ces résultats permettent d'éclaircir les mécanismes impliqués. Dans un même ordre d'idée, les résultats présentés dans cette thèse montrent l'identification de plusieurs centaines de protéines liant le promoteur d'APOD, dans la région -816 à +64, provenant de cortex de souris saines ou infectées par un coronavirus humain causant une neurodégénérescence. Parmi ces protéines, l'ApoE et la protéine non-structurale Ns2 du coronavirus lient le promoteur d'APOD. Ces résultats suggèrent aussi que les isoformes E3 et E4 d'APOE humaines soient des répresseurs tandis que Ns2 activerait le promoteur in vivo. De plus, il est mis en évidence une corrélation inverse entre l'expression d'ApoD et d'ApoE notamment au niveau du cortex de souris. Considérant que l'allèle E4 est un facteur génétique important dans le développement de la maladie d'Alzheimer et que les coronavirus sont associés à des désordres neurologiques tels que la sclérose en plaques, ces résultats ouvrent une porte permettant d'investiguer plus en profondeur, et vers une nouvelle direction, les mécanismes impliqués non seulement dans la régulation du gène d'APOD mais aussi dans les maladies neurodégénératives. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Apolipoprotéine D, arrêt de croissance, inflammation, facteur de transcription, coronavirus OC43, spectrométrie de masse