Nous avons étudié l'association des déterminants génétiques et nutritionnels du métabolisme de l’homocystéine aux maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, et analysé l’implication possible d’une hyperhomocystéinemie dans la pathogénie de la maladie de Crohn via un stress oxydatif accru mesuré par l’activité de la superoxyde dismutase (SOD). La vitamine B12 (p=0,0187) et le génotype MTHFR 677 TT (p=0,0048) étaient les deux seuls facteurs prédictifs indépendants d’une hyperhomocystéinémie >15 µmol/L chez des sujets avec une maladie de Crohn. Les patients avec un antécédent de résection iléale ou de colectomie, ou avec une iléite avaient des taux de vitamine B12 significativement plus bas. L’association entre vitamine B12 et homocystéine restait significative uniquement chez les patients présentant les taux les plus élevés de SOD (p<0,0001). Le génotype MTRR AA était le seul facteur prédictif de risque de maladie de Crohn (odds ratio 3.7, 95% CI 1.218– 11.649, P = 0.0213). Le niveau de SOD était plus élevé (p = 0.0143) et corrélé à l’activité de la maladie de Crohn (score CDAI) (p= 0.0276) chez les sujets porteurs du génotype MTRR AA. Dans la cohorte chinoise, la fréquence de l’allèle 2756G de la méthionine synthase était plus élevée chez les sujets avec une rectocolite hémorragique que chez les contrôles (0,09 (IC à 95 % :0,07-0,12) versus 0,15 (IC à 95% :0,11-0,19), P=0,0137) et était un facteur facteur prédictif de risque de rectocolite hémorragique (Odds ratio = 1,8, IC à 95% :1,09-2,99, P=0,0222). Le génotype MTHFR 677TT était 2,7 plus fréquent chez les patients avec une atteinte pancolique (27,3%, IC à 95% :16,4-42,0 et 10,5%, IC à 95 % :6,3-17,1, P= 0.0123). / We investigated the association of genetic and nutritional determinants of homocysteine metabolism with inflammatory bowel diseases and the possible implication of hyperhomocysteinemia in the pathogenesis of Crohn’s disease via an increased oxidative stress measured by superoxide dismutase activity. In multivariate analysis, vitamin B12 and MTHFR 677 TT carriers were the two significant independent factors of plasma homocysteine >15 µmol/L in CD patients (P = 0.0187 and 0.0048, respectively). Patients with a personal history of ileal resection, ileitis, or colectomy had significantly lower vitamin B12 levels.The significant association between homocysteine and vitamin B12 levels remained significant only in patients with the highest superoxide dismutase values (P < 0.0001). The MTRR AA genotype was a significant independent predictor of CD risk (odds ratio 3.7, 95% CI 1.218– 11.649, P = 0.0213). The level of superoxide dismutase was significantly higher (P = 0.0143) and was correlated with Crohn’s Disease Activity Index (CDAI) scores (P for trend = 0.0276) in patients carrying MTRR AA genotype. In The Chinese cohort, methionine synthase 2756G allele frequency was higher in ulcerative colitis than in controls (0.09 (95% C.I. 0.07 – 0.12) vs 0.15 (95% C.I. 0.11– 0.19), P=0.0137) and predicted ulcerative colitis risk in multivariate logistic regression, with an Odds ratio at 1.8 (95 C.I. 1.09-2.99), P=0.0222. Methylenetetrahydrofolate reductase 677TT genotype was 2.7-fold more prevalent in individuals with pancolitis, with respective percentages of 27.3 (95% C.I.16.4-42.0) and 10.5 (95% C.I. 6.3-17.1) (P= 0.0123).

Les maladies inflammatoires du système nerveux central (SNC) sont caractérisées par l'altération de la barrière hémato-encéphalique induite par les cellules immunitaires et les cellules tumorales. Il est reconnu que les macrophages peuvent induire l'inflammation en infiltrant la BHE. Lors d'un dommage ou d'une infection du SNC, les macrophages dérivés du sang sont activés. Une fois activés, ceux-ci migrent au site infecté ou endommagé et libèrent des cytokines et médiateurs inflammatoires tels que IL1, TNFα, VEGF. Ces cytokines jouent un rôle essentiel dans l'inflammation du SNC puisqu'elles induisent des chimiokines tels que la sphingosine-1-phosphate (S1P), un sphingolipide fortement exprimé dans les glioblastomes et qui joue un rôle important dans la chimiotaxie et le trafic des cellules immunitaires. Nous avons étudié l'efficacité d'une molécule dérivée de notre diète possédant des propriétés chimiopréventives et anti-inflammatoires, l'épigallocatéchine gallate (EGCG), sur la régulation transcriptionnelle des récepteurs de la S1P à divers stades de différenciation des cellules promyélomonocytaires HL-60. Nous avons d'abord différencié les cellules promyélomonocytaires HL-60 en « macrophages-like » en utilisant un promoteur tumorigène et activateur de la protéine kinase C-Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA). Nous avons démontré que le PMA induit l'adhésion cellulaire et augmente l'expression des transcrits S1P1, S1P2 et S1P5. Nous avons ensuite constaté que les cellules adhérentes semblaient être sensibles à la S1P en induisant la phosphorylation d'ERK, de JNK et de P38 MAPK. Cependant, l'inclusion de l'EGCG avant la différenciation par le PMA inhibe l'induction de ces trois voies MAPK par la S1P. D'autre part, un traitement par l'EGCG au cours de la différenciation, c'est-à-dire simultanément avec le PMA, affecte seulement la voie P38 MAPK. De plus, les cellules différenciées « macrophages-like » devenaient insensibles à l'EGCG. Enfin, nous démontrons que seul le récepteur S1P2, parmi les récepteurs fortement induits par le PMA, diminue lors du prétraitement par l'EGCG. Nos résultats suggèrent que l'EGCG antagonise la réponse à la S1P dans les cellules prédifférenciées via l'inhibition de la signalisation induite par le PMA. Par conséquent, une réponse réduite à la S1P pourrait abroger la migration transendothéliale des monocytes vers le SNC, et prévenir la neuroinflammation, les infections cérébrales secondaires ou certaines pathologies cérébrales conséquentes à l'infiltration de cellules immunitaires. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Neuroinflammation, S1P, EGCG, macrophages, chimiotactisme, chimioprévention

Durant la progression tumorale cérébrale, les cellules envahissent le tissu environnant, afin de s'y infiltrer. Pour ce faire, elles sécrètent ou expriment à leur surface des métalloprotéases matriciel1es (MMPs), capables de dégrader les composants de la matrice extracellulaire. Parmi ces MMPs, la MMP membranaire de type 1 (MT1-MMP) joue un rôle crucial dans l'acquisition du potentiel invasif des cellules tumorales cérébrales. La MT1-MMP dégrade de nombreux composants de la matrice extracellulaire et des protéines de surface. Grâce à son activité protéolytique, la MT1-MMP joue ainsi un rôle important dans les différentes étapes de la progression tumorale cérébrale incluant l'angiogenèse. Le ciblage pharmacologique des fonctions de MT1-MMP serait donc une approche thérapeutique efficace dans le traitement de gliomes. Bien que l'activité protéolytique de la MT1-MMP demeure sa fonction la plus importante, plusieurs études tendent à démontrer que la portion cytoplasmique de l'enzyme contribue à l'induction de signaux intracellulaires possiblement impliqués dans la chimio et la radiorésistance à la thérapie des gliomes. Parmi les marqueurs associés à cette résistance et surexprimés dans les gliomes hautement malins, il y a la cyclooxygénase-2 (Cox-2). Toutefois, le mécanisme moléculaire reliant l'activité intracellulaire de MT1-MMP à l'expression de Cox-2 demeure incompris. La première partie de mon mémoire a pour objectif d'étudier le ciblage pharmacologique des fonctions de MT1-MMP par l'actinonine, un inhibiteur sélectif de l'aminopeptidase N/CD13 et des MMPs solubles, dans les cellules de glioblastome U87. Nous y montrons que l'actinonine inhibe l'activation de la proMMP-2 induite par la concanavaline-A (ConA), une condition expérimentale connue pour induire l'expression de MT1-MMP dans les cel1ules U87. De plus, grâce à l'analyse de l'expression génique de MT1-MMP, l'actinonine n'a pas modulé l'expression de MT1-MMP induite par la ConA, suggérant que les effets de l'actinonine sont post-transcriptionnels. Nos résultats positionnent l'actinonine comme un possible candidat thérapeutique ciblant MT1-MMP. La deuxième partie de mon mémoire s'est orientée sur l'axe MT1-MMP/Cox-2 dans les glioblastomes U87. Nos observations préalables d'une modulation conjointe de l'expression de MT1-MMP et de Cox-2 dans les cellules isolées de glioblastomes humains U87 induite par la ConA nous ont permis d'évaluer le rôle de la ConA dans le déclenchement des processus cellulaires pro-inflammatoires qui régulent l'expression de Cox-2. Nous avons trouvé que le traitement avec la ConA, ou la surexpression directe de MT1-MMP recombinante conduit à l'induction de Cox-2 via une voie de signalisation impliquant NF-kB/IKKy. Collectivement, les résultats présentés dans ce mémoire apportent de nouvelles informations quant à l'implication du domaine intracellulaire de la MT1-MMP dans le phénotype pro-inflammatoire des cellules cancéreuses cérébrales. Ceci inspirera la conception de nouvel1es stratégies de thérapie pouvant combiner l'action des inhibiteurs de MT1-MMP à celle des drogues anti-inflammatoires pour le traitement de gliomes. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : MT1-MMP, Concanavaline-A, Actinonine, Cox-2, Inflammation, Glioblastome

Le médulloblastome, un type hautement agressif de tumeur cérébrale pédiatrique, est l'un des cancers dont le pronostic est le plus sombre dû à la difficulté de s'y attaquer directement et efficacement. L'avenir de la recherche en oncologie repose sur notre capacité à mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la progression d'un néoplasme afin d'identifier les joueurs clés impliqués dans le phénotype invasif tumoral ainsi que de nouvelles cibles nous permettant de tirer profit de ces failles. L'une de celles-ci est la métalloprotéase MMP-9, qui est surexprimée de manière constitutive dans la plupart des cas de cancers et qui contribue fortement au phénomène d'angiogénèse ainsi qu'à la migration invasive des cellules tumorales. Une des voies de signalisation régulant l'expression de la MMP-9 passe par le facteur nucléaire NF-kB, qui est aussi intimement liée à la régulation de COX-2, un médiateur important de l'inflammation dans le microenvironnement tumoral. Sachant que le ciblage pharmacologique de chacune de ces fonctions contribue à la régression tumorale, il apparait pertinent d'évaluer le caractère thérapeutique in vitro de deux agents pharmacologiques, le propranolol ainsi que le lupeol, dont les potentiels anti-tumoraux et anti-inflammatoires respectifs ont été rapportés. Les mécanismes moléculaires à la base de leur activité demeurent cependant peu documentés. Nous avons donc émis l'hypothèse que, premièrement, le propranolol puisse inhiber la sécrétion de MMP-9 indispensable à la cancérogénèse en bloquant la voie de signalisation NF-kB et que, dans un deuxième temps, le lupeol modulerait négativement l'inflammation au site tumoral en bloquant la synthèse de COX-2 possiblement via la voie NF-kB. Pour ce faire, nous stimulerons in vitro la voie de signalisation NF-kB à l'aide d'un agent pro-carcinogène, le PMA, dans un modèle cellulaire tumoral de type DAOY. Les phénotypes invasifs et inflammatoires résultants seront par la suite évalués en réponse aux traitements pharmacologiques. Nos résultats démontrent que le propranolol inhibe l'activation de la voie NF-kB induite par un agent carcinogène de manière dépendante de la dose, diminuant conséquemment la sécrétion de MMP-9. Le mécanisme de notre agent affecte aussi deux autres voies de signalisation cruciales à la cancérogénèse, soit la voie des MAPK et de PI3K/AKT, sans toutefois induire l'apoptose des cellules traitées. Notre seconde hypothèse s'est cependant avérée inexacte puisque, bien que le lupeol module effectivement la voie NF-kB et l'expression de COX-2, elle le fait à la hausse en synergie avec notre agent carcinogène, le PMA. Ces recherches nous ont par contre permis de comprendre une nouvelle modulation du lupeol dans notre modèle néoplasique et d'analyser l'axe de signalisation MT1-MMP, dont la contribution était suspectée, à l'inflammation. De plus, nous avons associé une autre partie du mécanisme moléculaire du lupeol via l'expression de la protéine chaperonne HuR indispensable à la stabilisation du transcrit primaire de MMP-9. En conclusion, nous avons démontré un nouvel axe signalétique par lequel ces agents pharmacologiques affectent le développement tumoral. Ces données dénotent l'importance de cibler la voie NF-kB afin d'atténuer à plusieurs niveaux le phénotype tumoral et proposent l'implication de cibles thérapeutiques originales telles que les récepteurs β-adrénergiques dans la cancérogénèse. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Médulloblastome, MMP-9, NF-kB, propranolol, récepteurs β-adrénergiques, COX-2, inflammation, lupeol

Depuis la découverte de l'apolipoprotéine D (ApoD) en 1973 par McConathy et Alaupovic et malgré de grandes avancées, la fonction et les mécanismes de régulation de cette protéine demeurent toujours inconnus. Quoi qu'il en soit, toutes les études faites jusqu'à présent semblent montrer qu'elle serait une protéine importante et bénéfique tant en situation normale que pathologique. Son expression génique est détectée chez presque tous les mammifères de même que chez les plantes, les insectes et certaines espèces d'oiseaux. Chez l'humain, elle est exprimée dans plusieurs tissus et hautement exprimée dans les glandes surrénales, la rate, les poumons, le cerveau, le placenta, et les reins. Par contre, chez le rat et la souris, l'expression est limitée au système nerveux central (SNC), ce qui en fait un bon modèle d'étude de la régulation génique d'ApoD. En effet, l'APOD est induite dans plusieurs cas de neuropathologies chez l'humain tel que les maladies d'Alzheimer et de Parkinson, la sclérose en plaques, la schizophrénie ainsi que dans certains cancers. L'ApoD est également induite dans plusieurs modèles de neurodégénérescence chez la souris et sa surexpression confère une neuroprotection. En corrélation avec ces faits, il est suggéré que l'APOD soit une protéine de stress pouvant être considérée comme marqueur de pathologies d'ordre neurologique d'où l'importance d'une étude plus approfondie. Les travaux présentés dans cette thèse ont permis d'éclaircir un tant soit peu les mécanismes régulant l'expression génique d'APOD lors de divers stress cellulaires. Effectivement, ces travaux présentent la purification et la caractérisation des facteurs nucléaires Parp-1, HnRNP-U, CBF-A, BUB-3, Kif4, APEX-1 et Ifi204 liant les éléments régulateurs SRE, EBS et GRE du promoteur d'APOD lors de l'arrêt de croissance par déprivation de sérum. L'activité enzymatique des protéines Parp-1, APEX-1 et ERK1/2 semble être importante dans l'induction de l'expression génique d'APOD. Sachant que l'expression d'APOD et la prolifération cellulaire sont inversement corrélées dans plusieurs types de cellules, ces résultats permettent d'éclaircir les mécanismes impliqués. Dans un même ordre d'idée, les résultats présentés dans cette thèse montrent l'identification de plusieurs centaines de protéines liant le promoteur d'APOD, dans la région -816 à +64, provenant de cortex de souris saines ou infectées par un coronavirus humain causant une neurodégénérescence. Parmi ces protéines, l'ApoE et la protéine non-structurale Ns2 du coronavirus lient le promoteur d'APOD. Ces résultats suggèrent aussi que les isoformes E3 et E4 d'APOE humaines soient des répresseurs tandis que Ns2 activerait le promoteur in vivo. De plus, il est mis en évidence une corrélation inverse entre l'expression d'ApoD et d'ApoE notamment au niveau du cortex de souris. Considérant que l'allèle E4 est un facteur génétique important dans le développement de la maladie d'Alzheimer et que les coronavirus sont associés à des désordres neurologiques tels que la sclérose en plaques, ces résultats ouvrent une porte permettant d'investiguer plus en profondeur, et vers une nouvelle direction, les mécanismes impliqués non seulement dans la régulation du gène d'APOD mais aussi dans les maladies neurodégénératives. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Apolipoprotéine D, arrêt de croissance, inflammation, facteur de transcription, coronavirus OC43, spectrométrie de masse

La présente étude a pour objectif de mettre en évidence l‘intérêt du suivi thérapeutique pharmacologique (STP) des métabolites thiopuriques en vue de l‘optimisation du traitement par l‘azathioprine chez les enfants atteints de maladie inflammatoire de l‘intestin et d‘hépatite autoimmune. Les travaux réalisés nous ont permis de montrer, en utilisant une analyse multi-niveaux, une corrélation significative entre la dose d‘azathioprine et les concentrations en 6-TGN et Me6-MPN ainsi qu‘avec le ratio Me6-MPN/6-TGN confortant l‘utilisation des métabolites pour ajuster la posologie d‘azathioprine chez les enfants présentant une maladie inflammatoire de l‘intestin. Différents facteurs pouvant modifier les concentrations de métabolites thiopuriques ont été identifiés. La co-administration d‘infliximab a conduit à une augmentation significative des concentrations de 6-TGN. Des concentrations plus faibles de 6-TGN ont été observées chez les jeunes enfants suggérant l‘influence de l‘âge sur le métabolisme ou sur l‘absorption de l‘azathioprine. Nous avons également montré qu‘une concentration de 6-TGN supérieure à 405 pmol/8.108RBCs chez des patients ayant une activité TPMT normale et pour lesquels la rémission clinique n‘a pas pu être obtenue en l‘absence de stéroïdes, était prédictive d‘une résistance à l‘azathioprine. Un seuil de 250 pmol/8.108RBCs en 6-TGN est significativement associé à une meilleure réponse thérapeutique. D‘autre part, une corrélation a été observée entre les métabolites thiopuriques et la leucopénie. Chez les enfants atteints d‘hépatite autoimmune, une corrélation positive entre la dose d‘azathioprine et les concentrations de métabolites a été retrouvée. L‘importante variabilité inter-individuelle dans les concentrations en métabolites thiopuriques et dans la réponse thérapeutique a été confirmée démontrant l‘intérêt d‘une individualisation de la thérapeutique. L‘instauration d‘un STP des métabolites thiopuriques associé au suivi hématologique, à la détermination de la TPMT et au suivi clinique paraît justifié afin d‘optimiser la thérapeutique par l‘azathioprine dans la population pédiatrique / The present study aimed to investigate the usefulness of thiopurine metabolite monitoring in pediatric inflammatory bowel disease (IBD) and Autoimmune Hepatitis (AIH) for optimizing azathioprine therapy. Using multilevel analysis, we demonstrated for the first time the significant positive correlations between the weight-based azathioprine dosage and the 6-thioguanine nucleotide (6-TGN) and 6-methyl-mercaptopurine (6-MeMPN) levels as well as 6-MeMPN/6-TGN ratio, supporting the use of metabolites to adjust dosing in IBD children. Other factors affecting metabolite levels were also identified. Co-administration of infliximab resulted in a significant increase in 6-TGN levels. Younger children exhibited lower metabolite levels, suggesting the influence of age on metabolism/absorption of azathioprine. We also reported that a 6-TGN level above 405 pmol/8.108RBCs in IBD children with normal TPMT activity who did not achieve steroid-free clinical remission was predictive of azathioprine refractoriness. A cut-off of 250 pmol/8.108RBCs for 6-TGN was found to be significantly associated with higher therapeutic response. Moreover, both 6-TGN and 6-MeMPN levels were correlated with leucopenia. In AIH children, a positive correlation between azathioprine dosage and metabolite levels was also observed. The wide variability in thiopurine metabolites and therapeutic response in both IBD and AIH children was confirmed, pointing to the important role of treatment individualization. Monitoring of thiopurine metabolites combined with hematological tests, TPMT activity and clinical evaluation may be of interest for optimizing thiopurine therapy and minimizing toxicity in IBD and AIH children

Favorisant plusieurs altérations physiologiques et autres conditions telle l'instabilité génomique, l'inflammation chronique joue un rôle central de l'initiation jusqu'au développement du cancer. Cette condition requiert la contribution de plusieurs types cellulaires et de médiateurs inflammatoires telle que la protéine transductrice du signal et activatrice de la transcription 3 (STAT3). Cette dernière est un médiateur majeur dans l'induction et le maintien d'un microenvironnement tumoral inflammatoire. En effet, la phosphorylation de STAT3 est essentielle à la régulation et à la transcription de plusieurs facteurs de croissance et cytokines incluant la cyclooxygénase-2 (COX)-2 et l'interleukine-6 (IL6), mais par son rôle de transducteur, elle répond aussi à plusieurs stimuli tant endogènes qu'environnementaux. Une des voies les plus importantes à cet effet est celle de JAK/STAT3. Une boucle rétroactive d'activation de STAT3 alimente d'ailleurs les processus impliqués dans le développement tumoral comme la prolifération, l'anti-apoptose, l'angiogenèse et la métastase. Les objectifs de notre étude sont, dans un premier temps, d'évaluer les effets de 5 polyphénols connus pour leur propriété anti-angiogénique; la lutéoline (Lut), l'apigénine (Api), l'épigallocatéchine gallate (EGCG), la delphinidine (Dp) et l'acide éllagique (EA), sur différentes étapes de l'angiogenèse déclenchée par l'IL-6 et d'en déterminer le mécanisme d'action au niveau moléculaire. Dans un deuxième temps, nous avons évalué chez les cellules souches mésenchymateuses (MSC) ayant un phénotype pro-inflammatoire induit par la concanavaline A (ConA), l'implication de la métalloprotéinase membranaire matricielle de type-1 (MT1-MMP) dans l'activation de STAT3 et l'expression de COX-2. Les résultats ont montré principalement que la Lut et l'Api inhibent très significativement la prolifération, la migration et la tubulogenèse des cellules endothéliales (EC) induite par l'IL-6 via la voie JAK/STAT3. En deuxième lieu, chez les MSC, la MT1-MMP semble être un contributeur important dans le phénotype pro-inflammatoire et implique également la voie JAK/STAT3. De façon inattendue l'inactivation de STAT3 potentialise l'expression de COX-2. Étant donné que les MSC sont recrutées aux sites inflammatoires de plusieurs cancers, ces résultats confirment l'importance de la MT1-MMP dans la régulation de la signalisation intracellulaire pro-inflammatoire des MSC. L'action double de STAT3 régulé par la MT1-MMP, montre son rôle majeur comme contributeur dans l'équilibre de l'expression de COX-2. Ce mécanisme permettrait ainsi aux MSC de s'adapter au microenvironnement inflammatoire pro-tumoral. Connaissant la diversité des polyphénols d'origine alimentaire et leur potentiel anti-inflammatoire, anti-angiogénique et anticancéreux on a aussi montré dans le cadre de cette étude que le potentiel de l'activité anti -inflammatoire de la Lut et d'Api permet, en partie d'expliquer leur activité anti-angiogénique et anti-cancer. Ainsi, ces flavones pourraient non seulement servir de base de recherche d'agents thérapeutiques anti-angiogéniques minimisant la résistance aux agents chimiothérapeutiques, mais aussi mettre en lumière le rôle majeur de l'alimentation dans la prévention du cancer. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : STAT3, MT1-MMP, angiogenèse, inflammation, IL6, COX-2

Les cellules dendritiques sont des cellules du système immunitaire inné qui jouent un rôle important dans la reconnaissance immunitaire contre les agents pathogènes étrangers. Elles peuvent également prévenir les maladies auto-immunes à l'état basal. En raison de l'importance des cellules dendritiques dans la régulation immunitaire, il est important de comprendre comment le développement, l'état d'homéostasie et de quiescence des ces cellules sont contrôlées dans des conditions physiologiques et pathologiques. Cette étude permettra non seulement de mieux comprendre le contrôle de la régulation immunitaire, mais aussi de contribuer au développement de nouvelles approches pour traiter les maladies infectieuses et auto-immunes, ainsi que les cancers. Notre laboratoire a montré que C-CBL et CBL-B, deux membres de la famille CBL des ubiquitine ligases E3, jouent un rôle redondant dans la régulation négative du développement et de l'activation des cellules T et B. En l'absence de CBL dans les cellules T ou B, les souris développent des maladies auto-immunes sévères, indiquant que C-CBL et CBL-B jouent un rôle dans le système auto-immun. Partant de ces observations, nous proposons que CBL-B et C-CBL peuvent également jouer un rôle similaire dans le développement et la fonction des cellules dendritiques. Pour étudier cette possibilité, nous avons généré une souris knockout de Cbl spécifiques aux cellules dendritiques (dKO). Nous avons trouvé que cette mutation provoque une modification de l'homéostasie d'un sous-ensemble des cellules dendritiques (DC), y compris une augmentation marquée des CD8a+ cDCs et une réduction des pDC dans la rate. Cette modification est causée par la prolifération accrue des CD8a+ cDCs. Dans les CD8a+ cDCs mutantes, les voies de signalisation PKB et ERK sont constitutivement activées. Blocage de la signalisation de MTOR par la rapamycine atténue de manière significative l'hyperprolifération des CD8a+ cDCs in vitro et in vivo, indiquant que l'hyperactivation de MTOR est en partie responsable de l'augmentation CD8a+ cDCs. Les protéines CBL contrôlent l'ubiquitination et la dégradation du récepteur FLT3, suggérant que les protéines CBL contrôlent ainsi l'homéostasie de CD8a+ cDCs. Outre ces effets sur le développement des cellules dendritiques, nous avons trouvé que les souris Cbl dKO développent des inflammations sévères du foie et d'autres organes, caractérisées par une infiltration massive de leucocytes et une activation importante des cellules lymphocytes T périphériques. Les souris mutantes produisent des niveaux élevés de cytokines inflammatoires et de chimiokines, telles que le TNF-α, l'IL-6 et le CCL2. Les souris mutantes développent une maladie inflammatoire du foie. L'ensemble de ces observations montrent que les protéines CBL jouent un rôle essentiel dans le maintien de la quiescence immunitaire chez la souris. Puisque les souris dKO Cbl développent principalement une inflammation sévère du foie, il serait intéressant d'étudier si les voies contrôlées par les protéines CBL contribuent également au développement d'une inflammation du foie chez l'homme. / Dendritic cells (DCs) are innate immune cells that play an important role in immune recognition against foreign pathogens. They may also sense self-cues and prevent autoimmune diseases under the steady-state. Given the importance of DCs in immune regulation, it is conceivable that understanding how DCs development, homeostasis and functional quiescence are regulated under physiological and pathological conditions will not only bring insight into our knowledge how immune regulation is controlled but also some new approaches to treat infectious and autoimmune diseases and even cancers. Dr. Gu’s lab previously has shown that C-CBL and CBL-B, two members of the CBL family of E3 ubiquitin ligases, play a redundant negative regulatory role in both T cells and B cells development and activation. In the absence of CBL family of proteins in either T or B cells, mice develop severe autoimmune diseases, indicating that C-CBL and CBL-B restrain immune system against self. Based on these discoveries, we propose that C-CBL and CBL-B may also have a similar regulatory role in DC development and function. To study this possibility, we have generated DC-specific Cbl dKO mice. We have found that the Cbl dKO mutation results in an altered homeostasis of DC subsets, including a marked increase of CD8a+ cDCs and reduction of pDCs in the spleen (SP). This alteration is due to the enhanced proliferation of CD8a+ cDCs rather than the preferential lineage commitment to CD8a+ cDCs. In the mutant CD8a+ cDCs, both the PKB signaling pathway and ERK signaling pathways are constitutively activated. Blockage of MTOR signaling by Rapamycin significantly attenuates the hyperproliferation of CD8a+ cDCs both in vitro and in vivo, indicating that hyperactivation of MTOR is at least one of the reasons leading to CD8a+ cDC expansion. CBL proteins regulate ubiquitination and degradation of FLT3. Based on these results, we conclude that CBL proteins control CD8a+ cDC homeostasis through promoting FLT3 ubiquitination and degradation. In addition to the altered DC development, we have found that Cbl dKO mice develop severe liver and other organ inflammation characterized by massive leukocytes infiltration and profound peripheral T cell activation. Mutant mice produce high levels of inflammatory cytokines and chemokines including TNF-a, IL-6, CCL2, etc. Most strikingly, the mutant mice develop a similar liver inflammatory disease even in the absence of T and B cells. These findings together indicate that CBL proteins play an essential role in the maintenance of immune quiescence in mice. Since Cbl dKO mice mainly develop severe liver inflammation, it will be interesting to study whether the pathways controlled by CBL proteins also contribute to the development of liver inflammation in humans.

La muqueuse intestinale est exposée à des agents oxydants provenant de l’ingestion d’aliments modifiés, de cellules immuno-inflammatoires et de la flore intestinale. Une diète élevée en fruits et légumes peut diminuer le stress oxydant (SOx) ainsi que l’inflammation via plusieurs mécanismes. Ces effets bénéfiques peuvent être attribuables à leur contenu élevé en polyphénols. La première étude de mon doctorat consistait à tester l’hypothèse que les polyphénols extraits de pelures de pomme (DAPP) pouvaient diminuer le stress oxydant et l'inflammation impliqués dans les maladies inflammatoires de l'intestin (MII). Nous avons caractérisé les polyphénols des DAPP par spectrométrie de masse (LC-MS) et examiné leur potentiel antioxydant et anti-inflammatoire au niveau des cellules intestinales. L’identification des structures chimiques des polyphénols a été effectuée par LC-MS. Le SOx a été induit par l’ajout du complexe fer/ascorbate (Fe/Asc, 200 µM/2 mM) et l’inflammation par la lipopolysaccharide (LPS, 200µg/mL) à des cellules intestinales Caco-2/15 pré-incubées avec les DAPP (250 µg/mL). L’effet du SOx est déterminé par le dosage du malondialdéhyde (MDA), de la composition des acides gras polyinsaturés et de l’activité des enzymes antioxydantes endogènes (SOD et GPx). L’impact des DAPP sur l’inflammation a été testé par l’analyse de l’expression des marqueurs inflammatoires: cyclooxygénase-2 (COX-2), le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a et l’interleukine-6 (IL-6) et les facteurs de transcription NF-KB, Nrf-2 et PGC1α par immunobuvardage. Nos données ont montré que les flavonols et les flavan-3-ols constituent les composés polyphénoliques majoritaires des DAPP. L’ajout de Fer2+/Asc a provoqué une augmentation de la peroxidation lipidique comparativement aux cellules contrôles, un appauvrissement des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6, et une modulation des enzymes antioxydantes, se traduisant par une augmentation de l’activité de la SOD et une diminution de la GPx. En contrepartie, les DAPP ont exhibé leur potentiel à corriger la plupart des perturbations, y compris l’expression protéique anormalement élevée du COX-2 et la production de la prostaglandine E2 (PGE2), ainsi que l’inflammation telle que réflétée par les facteurs NF-κB, TNF-α et IL-6. Par ailleurs, les mécanismes sous-jacents à ces changements bénéfiques des DAPP ont fait intervenir les facteurs de transcription antioxydants (Nrf-2, PGC1α). Vraisemblablement, cette première étude a permis de démontrer la capacité des DAPP à amoindrir le SOx et à réduire l’inflammation, deux processus étroitement impliqués dans les MII. Dans la deuxième étape de mon doctorat, nous avons voulu comparer les résultats de DAPP à ceux des polyphénols dérivant de la canneberge qui est considérée par la communauté scientifique comme le fruit ayant le plus fort potentiel antioxydant. À cette fin, nous avons caractérisé l’effet des composés polyphénoliques de la canneberge (CPC) sur le SOx, la défense antioxydante et l’inflammation au niveau intestinal tout en définissant leur métabolisme intraluminal. Les différents CPC ont été séparés selon leur poids moléculaire par chromatographie et leurs structures chimiques ont été identifiées par LC-MS. Suite à une pré-incubation des cellules Caco-2/15 avec les extraits CPC (250 µg/mL), le Fe/Asc et la LPS ont été administrés comme inducteurs du SOx et de l’inflammation, respectivement. La caractérisation globale des CPC a révélé que les acides phénoliques composaient majoritairement l’extrait de canneberge de petit poids moléculaire (LC) alors que les flavonoïdes et les procyanidines dimériques/trimériques représentaient l’extrait de poids moléculaire moyen (MC) tout en laissant les procyanidines oligo et polymériques à l’extrait de haut poids moléculaire (HC). Les CPC ont permis de restaurer la plupart des perturbations engendrées dans les Caco-2/15 par le Fe/Asc et le LPS. Les CPC exhibaient le potentiel d’abaisser les niveaux de MDA, de corriger la composition des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6, d’augmenter l’activité des enzymes antioxydantes (SOD, GPx et CAT) et d’élever l’expression de Nrf2 et PGC1α. En outre, les CPC pouvaient aussi réduire les niveaux élevés des protéines inflammatoires COX-2, TNF-α et IL-6 ainsi que la production des PGE2 par un mécanisme impliquant le NF-κB. Au niveau mitochondrial, les procyanidines oligomériques ont réussi à corriger les dysfonctions reliées à la production d’énergie (ATP), l’apoptose (Bcl-2, Cyt C et AIF) et le statut des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). Dans le but de bien comprendre les mécanismes d’action des CPC, nous avons défini par LC-MS les composés polyphénoliques qui ont été transportés ou absorbés par l’entérocyte. Nos analyses soulignent le transport (i) des acides cinnamiques et benzoïques (LC); (ii) la quercétine glycosylée et conjuguée et les procyanidines dimériques de type A (MC); et (iii) l’épicatéchine et les procyanidines oligomériques (HC). Les processus de métabolisation (méthylation, glucuronidation et sulfatation) au niveau de l’entérocyte ont probablement permis le transport de ces CPC surtout sous leur forme conjuguée. Les procyanidines oligomériques ayant un degré de polymérisation supérieur à 2 (HC) ont semblé adhérer aux cellules Caco-2/15. L’épicatéchine suivi par les procyanidines dimériques de type A ont été trouvés majoritaires au niveau des mitochondries. Même si nous ignorons encore l’action biologique de chaque composé polyphénolique, nous pouvons suggérer que leurs effets combinatoires exercent des fonctions antioxydantes, anti-inflammatoires et mitochondriales dans le modèle intestinal Caco-2/15. Dans une troisième étape, nous avons procédé à l’évaluation des aspects préventifs et thérapeutique des DAPP tout en sondant les mécanismes sous-jacents dans une étude préclinique. À cette fin, nous avons exploité le modèle de souris avec colite expérimentale provoquée par le Dextran Sulfate de Sodium (DSS). L’induction de l’inflammation intestinale chez la souris C57BL6 a été effectuée par l’administration orale de DSS à 2.5% pendant 10 jours. Des doses physiologiques et supra-physiologiques de DAPP (200 et 400 mg/kg/j, respectivement) ont été administrées par gavage pendant 10 jours pré- et post-DSS. L’inflammation par le DSS a provoqué une perte de poids, un raccourcissement du côlon, le décollement dystrophique de l’épithélium, l’exulcération et les infiltrations de cellules mono et polynucléaires au niveau du côlon. De plus, le DSS a induit une augmentation de la peroxidation lipidique, une régulation à la baisse des enzymes antioxydantes, une expression protéique à la hausse de la myéloperoxidase (MPO), du COX-2 et de la production des PGE2. Par ailleurs, les DAPP ont permis de corriger ou du moins d’alléger la plupart de ces anomalies en situation préventive ou thérapeutique, en plus d’abaisser l’expression protéique de NF-κB et des cytokines inflammatoires (TNF-a et l’IL-6) tout en stimulant les facteurs de transcription antioxydants (Nrf-2, PGC1α). Conséquemment, les polyphénols des DAPP ont exhibé leur puissant pouvoir antioxydant et anti-inflammatoire au niveau intestinal dans un modèle in vivo. Leurs actions sont associées à la régulation des voies de signalisation cellulaire et des changements dans la composition du microbiote. Ces trois projets de recherche permettent d’envisager l’évaluation des effets préventifs et thérapeutiques des DAPP cliniquement chez les patients avec des désordres inflammatoires de l’intestin. / The intestinal mucosa is exposed to oxidizing agents from the ingestion of modified foods, immuno-inflammatory cells and intestinal flora. Diet high in fruits and vegetables may reduce oxidative stress and inflammation via several mechanisms. These beneficial effects may be due to their high polyphenol content. The first aims for my PhD was to define the nature of polyphenols extracted from dried apple peels (DAPP) and to determine their antioxidant and anti-inflammatory potential in the intestine. Caco-2/15 cells were used to study the role of DAPP preventive actions against oxidative stress (OxS) and inflammation induced by iron-ascorbate (Fe/Asc) and lipopolysaccharide (LPS), respectively. The combination of HPLC with fluorescence detection, HPLC-ESI-MS TOF and UPLC-ESI-MS/MS QQQ allowed us to characterize the phenolic compounds present in the DAPP (phenolic acids, flavonols glycosides, flavan-3-ols, procyanidins). The addition of Fe/Asc to Caco-2/15 cells induced OxS as demonstrated by the rise in malondialdehyde, depletion of n-3 polyunsaturated fatty acids, and alterations in the activity of endogenous antioxidants (SOD, GPx, G-Red). However, preincubation with DAPP prevented Fe/Asc-mediated lipid peroxidation and counteracted LPS-mediated inflammation as evidenced by the down-regulation of cytokines (TNF-α and IL-6), and prostaglandin E2. The mechanisms of action triggered by DAPP induced also a down-regulation of cyclooxygenase-2 and nuclear factor-kB, respectively. These actions were accompanied by the induction of Nrf2 (orchestrating cellular antioxidant defenses and maintaining redox homeostasis), and PGC-1α (the “master controller” of mitochondrial biogenesis). Our findings provide evidence of the capacity of DAPP to reduce OxS and inflammation, two pivotal processes involved in inflammatory bowel diseases. The cranberry fruit has been reported to have high antioxidant effectiveness that is potentially linked to its richness in diversified polyphenolic content. Therefore, the second objective was to compare the results for apple to those for the cranberry. More specifically, the aim of this study was to determine the role of cranberry polyphenolic fractions in oxidative stress, inflammation and mitochondrial functions using intestinal Caco-2/15 cells. The second aim of this work was to determine the polyphenolic species that were responsible for the observed biological activity. The combination of HPLC and UPLC-TDQ techniques allowed us to characterize the profile of low, medium and high molecular weight polyphenolic compounds in cranberry extracts. The medium molecular weight fraction was enriched with flavonoids and procyanidin dimers whereas procyanidin oligomers (degree of polymerization > 4) were the dominant class of polyphenols in the high molecular weight fraction. Pre-incubation of Caco-2/15 cells with these cranberry extracts prevented Fer/Asc-mediated lipid peroxidation and counteracted LPS-mediated inflammation as evidenced by the decrease in pro-inflammatory cytokines (TNF-α and IL-6), cyclooxygenase-2 and prostaglandin E2. Cranberry polyphenols fractions limited both NF-B activation and Nrf2 down-regulation. Consistently, cranberry procyanidins alleviated oxidative stress-dependent mitochondrial dysfunctions as showed by the rise in ATP production and the up-regulation of Bcl-2, as well as the decline of protein expression of cytochrome C and apoptotic inducing factor. These mitochondrial effects were associated with a significant stimulation of PGC1α, a central inducing factor of mitochondrial biogenesis and transcriptional co-activator of numerous downstream mediators. Finally, cranberry procyanidins forestalled the effect of Fer/Asc on the protein expression of mitochondrial transcription factors (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). The analysis of different pathways, including absorption and transport of polyphenol species revealed which species in the three cranberry fractions have been responsible for the antioxidant activity observed. Especially, the identification of flavan-3-ols and A-type procyanidins in mitochondria suggested that these polyphenol species were responsible for the antioxidant activity in this organelle. Our findings provide evidence for the capacity of cranberry polyphenols to reduce intestinal oxidative stress and inflammation while improving mitochondrial dysfunction. Subsequently, we evaluated the preventive and therapeutic aspects of DAPP polyphenols on intestinal inflammation while elucidating the underlying mechanisms and clinical benefits. Induction of intestinal inflammation in the C57BL6 mice was performed by oral administration of the inflammatory agent DSS (Dextran Sodium Sulfate, 2.5% for 10 days). Physiological and supraphysiological doses of DAPP (200 and 400 mg/ kg/day, respectively) were administered by gavage for 10 days pre- and during-DSS. DSS caused weight loss, shortening of the colon, dystrophic detachment of the epithelium, erosion and infiltration of mono- and polymorphonuclear cells in the colon. Additionally, the DSS induced an increase in lipid peroxidation, a down-regulation of antioxidant enzymes, a rise in MPO and COX-2 expression, and PGE2 production. However, the DAPP corrected or at least alleviated most of these abnormalities in preventive and therapeutic situations, in addition to lowering protein expression of NF-kB and inflammatory cytokines (TNF-a and IL-6) while stimulating antioxidant transcription factors (Nrf2, PGC1α). The supraphysiological dose of DAPP in therapeutic situation has corrected mitochondrial dysfunction, as evidenced by the raised ADP/ATP ratio, reduced apoptosis (Cyt C and AIF) and the DNA repair enzyme (OGG1) that eliminated DNA damage, caused by oxidative stress, thereby preventing the initiation of the ROS vicious cycle. The relative abundance of colitogenic bacteria was slightly decreased in DAPP-treated mice compared to DSS-induced colitis group. Conclusions: Polyphenols of DAPP exhibit a powerful anti-oxidant and anti-inflammatory power in the intestine. Their actions are associated with the regulation of cellular signaling pathways and changes in microbiota composition. Therefore, preventive and therapeutic effects of DAPP may be clinically feasible in individuals with intestinal disorders such as colonic cancer.

La douleur chronique occupe une place centrale dans les préoccupations de santé publique. En France, elle touche environ 20% de la population et a un impact négatif sur la qualité de vie des patients. Les traitements actuels sont généralement inefficaces ou associés à d’importants effets indésirables. Par conséquent, de nouvelles approches thérapeutiques sont nécessaires. Parmi les cibles potentielles, les canaux calciques voltage-dépendants de type T, en particulier l’isoforme Cav3.2, constituent des candidats d’intérêt. Aussi, l’objectif de cette thèse est de caractériser leur implication fonctionnelle dans deux types de douleur chronique : viscérale et somatique. Concernant la douleur viscérale, nous avons développé un modèle murin d’hypersensibilité colique associée à une inflammation à bas bruit, deux caractéristiques séméiologiques proches de la symptomatologie rencontrée chez la plupart des patients souffrant du syndrome de l’intestin irritable (SII) ou de maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) durant les périodes de rémission. En ce qui concerne la douleur somatique, nous avons utilisé deux modèles murins de douleur inflammatoire, l’un présentant une inflammation subaiguë et l’autre persistante. Dans ces différents modèles, une inhibition pharmacologique via l’administration d’un antagoniste des canaux Cav3.2, le TTA-A2, ou génétique grâce à des souris présentant un Knock out (KO) de Cav3.2 a induit un puissant effet antalgique, démontrant une implication fonctionnelle des canaux Cav3.2 dans le développement et le maintien de ces types de douleur. De plus, l’utilisation de souris présentant un KO conditionnel de Cav3.2, spécifiquement dans les fibres C des ganglions de la racine dorsale (DRG), ainsi que l’emploi de l’ABT-639, un agent pharmacologique bloqueur des canaux de type T à action périphérique, nous ont permis de préciser la localisation de cette implication. Ainsi, une action majoritairement spinale présynaptique des canaux Cav3.2 a été mise en évidence pour la douleur viscérale alors qu’une action plus complexe de ces canaux est mise en jeu pour la douleur somatique inflammatoire. En effet, pour cette dernière, le canal Cav3.2 présente une implication à la fois spinale et périphérique. De plus, nous avons montré un rôle des canaux Cav3.2 dans le processus inflammatoire, s’effectuant au travers d’une implication de ces derniers dans les cellules immunitaires. Enfin, dans une démarche de recherche translationnelle, nous avons évalué l’effet de l’éthosuximide (ETX), un bloqueur des canaux de type T, utilisé en clinique dans le traitement de l’épilepsie. Nous avons décrit un effet antalgique de ce dernier dans chacun des modèles étudiés ainsi qu’une action anti-inflammatoire, apportant ainsi une preuve de concept préclinique pour une évaluation d’efficacité clinique de l’ETX dans un contexte de douleurs viscérales ou somatiques inflammatoires. L’ensemble de ces résultats apporte de nouvelles connaissances concernant l’implication des canaux Cav3.2 dans la douleur chronique et permet de proposer ces canaux comme des cibles d’intérêt pour le développement de stratégies thérapeutiques innovantes visant à soulager les patients. / Chronic pain is a central concerns to public health. In France, it affects about 20% of the population and has a negative impact on the patients’ quality of life. Current treatments are generally ineffective or associated with strong adverse effects. Therefore, new therapeutic approaches are needed. Among the potential targets, the T-type voltage-dependent calcium channels, in particular the Cav3.2 isoform, constitute candidates of interest. Thus, the objective of this thesis is to characterize their functional implication in two types of chronic pain: visceral and somatic. We have developed a murine model of colonic hypersensitivity associated with low grade inflammation, two symptomatic features close to the symptomatology found in most patients suffering from irritable bowel syndrome (IBS) or with diseases inflammatory bowel disease (IBD) during remission periods. Concerning the somatic pain, we used two murine models of inflammatory pain, one with subacute inflammation and another with persistent inflammation. In these different models, a pharmacological inhibition with the administration of a Cav3.2 channel antagonist, TTA-A2, or a genetic approach using Cav3.2 knockout (KO) mice induced a robust analgesic effect demonstrating a functional implication of Cav3.2 channels in the development and maintenance of these types of pain. Moreover, the use of mice with a Cav3.2 conditional KO, specifically in the C-dorsal root ganglia (DRG) fibers, and the use of ABT-639, a peripherally acting pharmacological blocker of type T channels, allowed us to specify the localization of this implication. Thus, a pre-synaptic spinal action of the Cav3.2 channels has been demonstrated for visceral pain whereas a more complex action of these channels is involved for inflammatory somatic pain. Indeed, for the latter, Cav3.2 channels present a spinal and peripheral implication. In addition, we have shown the role of Cav3.2 channels in the inflammatory process, with an involvement located in the immune cells. Finally, with a translational research approach, we evaluated the effect of ethosuximide (ETX), a T-channel blocker, clinically used in the treatment of epilepsy. We have described an analgesic effect of the latter in both studied models as well as an anti-inflammatory action. These results constitute a pre-clinical proof of concept for a clinical efficacy evaluation of ETX in a context of visceral pain or somatic inflammatory diseases. Altogether these results provide new insight about the involvement of Cav3.2 channels in chronic pain and allow us to propose these channels as targets of interest for the development of new therapeutic strategies to relieve patients.