Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / La pancréatite aiguë (PA) constitue la principale cause d'admissions en centre hospitalier liée à des troubles gastrointestinaux dans le monde, et sa prévalence est en augmentation. La PA est associée à plusieurs comorbidités dont la prévalence mondiale est également en augmentation, comme le syndrome métabolique et le diabète de type 2. L'architecture génétique de la PA demeure toutefois peu caractérisée et peu ou pas d'options thérapeutiques existent présentement pour sa prévention ou son traitement. Notre hypothèse était qu'il est possible d'identifier de nouveaux gènes associés à la PA à l'aide d'études d'association pangénomiques et d'identifier des protéines circulantes associées à la PA à l'aide de la randomisation mendélienne à l'échelle du proteome sanguine humain, et que les résultats de ces analyses pouvaient permettre d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour la PA. Nos résultats ont non seulement confirmé des associations connues entre certains genes et la PA, mais également mis en évidence de nouveaux gènes potentiellement impliqués dans la maladie. Nous avons également pu identifier plusieurs protéines sanguines causalement impliquées dans la pathophysiologie de la PA dont plusieurs sont des cibles thérapeutiques potentielles pour la PA. En outre, nous avons identifié des médicaments ciblant ces protéines, dont l'effet est cohérent avec celui obtenu grâce aux analyses de randomisation mendélienne et qui pourraient être réutilisés dans le cadre de la prevention ou du traitement de la PA. / Acute pancreatitis (AP) is the leading cause of hospital admissions related to gastrointestinal disorders worldwide, and its prevalence is increasing. AP is associated with several comorbidities whose global prevalence is also increasing, such as metabolic syndrome and type 2 diabetes. Despite this, its genetic architecture remains poorly characterized and few or no therapeutic options currently exist for its prevention or his treatment. Our hypothesis was that it is possible to identify novel genes associated with AP using genome-wide association studies and to identify circulating proteins associated with AP using blood proteome-wide Mendelian randomization, and that the results of these analyzes could help identify potential therapeutic targets for AP. Our results not only confirmed known associations between known genes and AP, but also highlighted new genes potentially involved in the disease. We were also able to identify several blood proteins causally involved in the pathophysiology of AP, several of which are potential therapeutic targets for AP. In addition, we identified drugs target those proteins, whose effect is consistent with that obtained through Mendelian randomization analyzes and which could be reused in the context of the prevention or treatment of AP.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdorales, 2015-2016 / La microfiltration (MF) est un procédé membranaire permettant de séparer les micelles de caséines (CN) des protéines sériques (PS) du lait grâce à des pores ayant un diamètre de 0,1 μm. Le rétentat obtenu est enrichi en CN, tandis que le perméat contient des PS sous forme native. La membrane céramique à gradient de perméabilité (GP) a été développée récemment dans le but de réduire l’encrassement à long terme, ce qui permet des flux de perméation élevés et une meilleure séparation des protéines. À ce jour, les conditions opératoires les plus efficientes pour réaliser la MF du lait n’ont pas été déterminées pour ce type de membrane. L’objectif de cette étude était donc de caractériser l’effet de différentes pressions transmembranaires (PTM), différents facteurs de concentration volumique (FCV) et de la diafiltration (DF) sur l’efficience du procédé. Un bilan de matière a été réalisé à la suite du dosage des solides totaux, ainsi que de l’azote total, non caséique et non protéique. La consommation énergétique du système de MF a également été mesurée in situ. Les résultats obtenus démontrent qu’un FCV de 1,5X permet d’obtenir la meilleure séparation des protéines, tout en ayant un flux de perméation plus élevé et une plus faible consommation énergétique. Lorsque le FCV est plus élevé, les pertes totales de CN dans le perméat et la consommation énergétique deviennent plus importantes, ce qui réduit la rentabilité du procédé. Les étapes de DF réduisent l’efficience du procédé en augmentant la durée de filtration et la quantité de perméat généré de façon considérable, sans permettre d’obtenir une quantité satisfaisante de PS supplémentaires dans le perméat. Les résultats obtenus pourront bénéficier aux transformateurs laitiers lors de la prise de décision quant à la pertinence d’effectuer la MF du lait avec la membrane céramique GP. / Microfiltration (MF) is a membrane process used to separate casein (CN) micelles from serum proteins (SP) of milk using 0.1 μm pore diameter membranes. The resulting retentate is enriched in CN, while the permeate contains native SP. The graded permeability (GP) ceramic membrane has been recently developed to reduce long-term fouling, which improves permeation flux and protein separation. To date, the most efficient operating conditions to achieve MF of milk have not been determined for this type of membrane. The objective of this study was to characterize the effect of different transmembrane pressures (TMP), volumetric concentration factors (VCF) and diafiltration (DF) on the process efficiency. Mass balance measurements were carried out following the determination of total solids, total nitrogen, non-casein nitrogen and non-protein nitrogen. The in situ energy consumption of the MF system was also measured. Results obtained showed that a VCF of 1.5X provided the best separation of proteins, while allowing the highest permeation flux and the lowest energy consumption. When the VCF was higher, the total losses of CN in the permeate increased, as well as energy consumption, which reduces the process profitability. DF steps reduced the process efficiency by increasing the filtration time and the amount of permeate generated, without increasing significantly the transmission of additional SP in the permeate. Results will benefit dairy processors in decision making about the potential of MF of skim milk with GP membrane.

La valorisation du lactosérum par le fractionnement de molécules à hautes valeurs ajoutées est d’autant plus d’actualité au Québec, que ce sous-produit est encore considéré comme une matière résiduelle fertilisante. Bien que les concentrés de protéines sériques possèdent des propriétés nutritionnelles et fonctionnelles intéressantes, la production de protéines sous forme purifiée est davantage désirée pour leur utilisation dans des produits de qualité et très recherchés notamment dans les formulations infantiles. De manière générale, la séparation des protéines est réalisée à l’aide de technologies présentant un impact environnemental et économique non négligeable ainsi qu’une efficacité non optimale voire limitée. Dans le cas des protéines sériques majeures (alpha-lactalbumine – α-la et bêta-lactoglobuline – β-lg), la principale problématique reliée à leur récupération sélective concerne leur poids moléculaire similaire. L’utilisation de technologies émergentes et écoresponsables devient donc un incontournable, de manière à améliorer les procédés déjà existants. Cette thèse avait donc pour but de montrer que la modulation des interactions protéiques par l’utilisation des hautes pressions hydrostatiques (HPH), une technologie considérée comme éco-efficiente et émergente, et l’utilisation d’un ligand, les caséines (CN), permettrait de fractionner ces deux protéines majeures pour la génération de fractions purifiées à des rendements maximaux. Une première étude a permis de déterminer les paramètres optimaux de pressurisation (temps et niveau de pression) ainsi que le type de ligand utilisé (CN isoélectriques – CI ou micellaires – CM). De manière générale, les HPH ont permis de spécifiquement agréger la β-lg et les CN, tout en maintenant l’α-la sous sa forme monomérique. L’acidification subséquente à pH 4,6 a généré une précipitation de ces agrégats de β-lg/CN. L’augmentation du niveau de pression et de temps a permis d’augmenter l’agrégation entre la β-lg et les CN sans impacter significativement l’agrégation de l’α-la. De plus, l’utilisation de CI en comparaison aux CM n’a pas permis d’améliorer le taux de purification de l’α-la alors que le rendement de cette dernière a diminué. Une deuxième étude a porté sur l’évaluation du potentiel concentration-dépendant des CN à agir comme un ligand pour le fractionnement de l’α-la et la β-lg. De manière générale, l’augmentation de la concentration en CN n’a pas permis d’améliorer les taux de purification et les rendements en α-la. Au contraire, pour des concentrations élevées en CN, le taux d’agrégation de la β-lg diminuait, suggérant un effet chaperon des CN sur l’agrégation par les HPH de la β-lg. En outre, la pressurisation des protéines sériques sans CN a permis d’obtenir les meilleurs paramètres de purification en α-la ainsi qu’en β-lg. Finalement, une troisième étude a permis de mettre en avant l’effet chaperon de la β-CN sur l’agrégation de la β-lg en présence d’α-la. Alors que la pressurisation des protéines sériques seules ou combinées entraînait la formation d’agrégats globulaires de faibles poids moléculaires et générait des solutions turbides, l’ajout de β-CN a permis de réduire la turbidité des solutions, et ce, proportionnellement à sa concentration. En parallèle, cette limpidité corrélait avec la présence d’agrégats de types amorphes et de hauts poids moléculaires. Finalement, comme requis pour une protéine chaperonne, il a été démontré que la β-CN n’était pas impliquée dans ces agrégats. Les travaux de cette thèse ont rencontré l’ensemble des objectifs définis et contribuent significativement à l’avancement des connaissances concernant l’extension de l’application des HPH pour le fractionnement de l’α-la et la β-lg présentant ainsi des taux de purification et des rendements d’intérêt majeur pour l’industrie de transformation des produits laitiers. / Whey valorization through the better fractionation of highly valuable molecules is more than ever relevant in Quebec, as it is still used as a fertilizing residual material. Although whey protein concentrates have multiple nutritional and functional properties, the production of highly pure single proteins is more desired for their use in high quality product and in particular for infant formula. Usually, proteins separation is done using technologies with significant environmental and economic impacts as well as non-optimized effectiveness. For the major whey proteins such as alpha-lactalbumin (α-la) and beta-lactoglobulin (β-lg), the main problematic is their similar molecular weight. Consequently, the use of emerging and green technologies is crucial to improve the efficiency and productivity of existing processes. This thesis aims to demonstrate the potential of using a green and emerging technology known as high hydrostatic pressure (HHP) coupled with a ligand, caseins (CN) for the modulation of proteinprotein interactions to improve the fractionation of the two major whey proteins: α-la and β-lg with higher purity. In the first study, optimal pressurization parameters (duration and level of pressure) as well as ligand type (isoelectric CN – IC or micellar – MC) were determined. Broadly, HHP treatment induced specific aggregation of β-lg and CN, while maintaining α-la in its monomeric form. Subsequent acidification to pH 4.6 caused the precipitation of the β-lg/CN aggregates. Increase of pressure and process duration increased the β-lg/CN aggregation without significantly impacting α-la aggregation. Furthermore, the use of IC in comparison with MC improved the purification rate of α-la while decreasing its recovery rate. As part of a second study, the evaluation of concentration of CN as a ligand for the fractionation of α-la and β-lg was studied. The increase in CN concentration did not improve both the purification and recovery rates of α-la. Rather, at higher CN concentration, β-lg aggregation rate decreased, suggesting a chaperone-like effect of CN on the β-lg pressure-induced aggregation. In addition, pressurization of whey proteins in the absence of CN, resulted in a higher purification rate and recovery degree for both α-la and β-lg in soluble and insoluble fractions, respectively. Lastly, in the third study, the chaperone-like effect of β-CN on the pressure-induced aggregation of β-lg and α-la was investigated. Pressurization of single or combined whey proteins generated small globular aggregates with turbid solutions, whereas, the addition of β-CN decreased the turbidity in a concentration dependent manner. In parallel, limpidity was correlated with the presence of larger but amorphous aggregates with higher molecular weight. Furthermore, it was demonstrated that β-CN was not part of the aggregates formed, which is an important criterion of a chaperone-like protein. The present work has met all the objectives set in this thesis and contributed significantly to the advancement of knowledge concerning the application of HHP for the fractionation of α-la and β-lg with high purification and recovery rates, which is of great interest for the dairy processing industry.

Ce travail avait pour but d’améliorer les propriétés rhéologiques (fermeté, viscosité apparente) et la synérèse de yogourts brassés en ajoutant des complexes composés d’isolat de protéines sériques (IPL) et de pectine comme agent stabilisant. Les complexes ont été stabilisés par l’application d’un traitement thermique afin de résister à une remontée de pH à 7.0. Parmi les concentrations étudiées, 0.1% de complexes non chauffés a donné les meilleures propriétés rhéologiques. Les complexes traités thermiquement n’ont pas permis d’améliorer les caractéristiques du yogourt. Cet effet est possiblement relié à l’utilisation combinée de pectine et d’IPL plutôt qu’à la complexation des biopolymères. Utiliser une solution d’IPL et de pectine, non complexée, a donné des propriétés rhéologiques supérieures aux complexes non chauffés. La variation du ratio caséines-protéines totales a permis d’obtenir des résultats différents: les complexes non chauffés ont donné de meilleures propriétés rhéologiques que la solution d’IPL et de pectine non complexée. / The aim of this work was to improve the rheological properties and whey retention of stirred yoghurts by the addition of whey protein isolate (WPI) and low methoxyl pectin complexes as stabilizing agent. The developed complexes were stabilized to a pH adjustment to 7.0 by the application of heat treatment. The level of incorporation to obtain adequate finish characteristics was determined. The stabilized complexes (heat treated) were unable to enhance the rheological properties of yoghurt despite of unheated complexes did. This effect could be due to the addition of WPI and pectin without complexe formation. Using a WPI and pectin solution without complexe formation led to increase the rheological properties. Varying the casein to total protein ratios gave different results: unheated complexes permitted to obtain greater rheological properties than WPI and pectin solution without complexe formation.

Par analyse bio-informatique, nous avons construit une liste de gènes candidats en identifiant ceux principalement exprimés par le foie et n'ayant pas de rôles connus dans le développement de la stéatose hépatique. L'expression hépatique des candidats potentiels a été validée par qPCR. Cette méthode a permis l'identification d'une nouvelle protéine plasmatique : Lrrc54. Nous avons découvert que l'expression hépatique de Lrrc54 augmente dans trois modèles d'obésité murins, dans un modèle de stéatose hépatique murin ainsi que chez des patients obèses ayant des degrés différents de stéatose. In vitro et in vivo, nous avons établi que le stress du réticulum endoplasmique induit ces hauts niveaux de Lrrc54. En induisant la stéatose hépatique dans un modèle de souris génétiquement invalidé pour Lrrc54, nous avons observé un profil de marqueurs pro-inflammatoires moins élevé que chez les souris sauvages indiquant un rôle pour Lrrc54 dans la promotion de l'inflammation par un mécanisme encore inconnu.

L’ajout de concentrés protéiques de lactosérum (CPLs) dans le fromage est limité à cause de la contamination par des phages lactiques résistants à la chaleur. En outre, les protéines de lactosérum peuvent protéger les phages contre la chaleur augmentant ainsi le risque de contamination. Le but de ce travail était d’expliquer cet effet protecteur et d’identifier un déterminant génétique responsable de la résistance thermique de phages lactiques. D’abord, l'inactivation thermique du phage résistant à la chaleur P1532 (groupe Sk1virus) a été étudiée dans des CPLs et dans trois de ses composantes majeures à 95 °C, en fonction du pH et de temps de chauffage. Les changements structuraux des protéines du lactosérum ont été suivis par spectroscopie FTIR. Les résultats d’inactivation thermique ont montré que les conditions acides des CPLs favorisent la destruction des phages laitiers par traitement thermique. Également, ils ont avéré que l’effet protecteur des protéines est dépendant du pH et du temps de chauffage, mais n'est pas dû à une protéine spécifique. Les spectres de FTIR ont montré que l’effet protecteur est relié à la structure et à l'agrégation des protéines. Ensuite, une étude plus approfondie a été menée sur cet effet protecteur, en utilisant la lactoferrine (LF) comme modèle des protéines sériques en raison de ses propriétés physico-chimiques uniques. Une évaluation détaillée de la structure tertiaire/secondaire de la LF a été effectuée en utilisant la spectroscopie FTIR ainsi que le dichroïsme circulaire. Après inactivation thermique de phage P1532, aucun effet protecteur de la LF n'a été détecté au pH neutre, alors qu’à pH 5, un effet protecteur marqué de la LF a été signalé. Les données des études spectroscopiques ont clairement montré que la LF est plus stable, au niveau de la structure tertiaire et secondaire, si elle est chauffée à pH 5 qu'à pH 7. En somme, il existe une corrélation directe entre la stabilité thermique des protéines sériques et la protection conférée au phage P1532 pendant le traitement thermique. Les résultats obtenus à cet égard offrent de nouveaux outils pour minimiser l’impact de l’effet protecteur sur les phages lactiques. Afin de mieux comprendre la résistance thermique intrinsèque des phages lactiques, un déterminant génétique a été identifié. Suite à l’exposition du phage virulent de L. lactis CB14 sensible à la chaleur (groupe Sk1virus) à des températures faibles et élevées, il a été possible d’isoler deux phages qui ont acquis une résistance thermique plus élevée. Le séquençage de leur génome a révélé une délétion de 120 pb dans le gène codant pour la TMP. Les séquences de protéines de TMP de phages mutants ont été comparées avec leurs homologues dans d'autres phages de L. lactis. L'analyse comparative a montré que la même délétion semble avoir eu lieu dans la TMP de phages thermorésistants P680 et P1532. Nous proposons que la TMP soit en partie responsable de la stabilité à la chaleur de phages lactiques. L'identification d’un déterminant génétique responsable de la résistance thermique des phages de groupe Sk1virus est une première étape pour comprendre l'émergence de ce groupe de phages thermostables, et peut conduire à des meilleures stratégies de contrôle. / The incorporation of whey protein concentrates (WPC) into cheese is a risky process due to the potential contamination with thermo-resistant phages of lactic acid bacteria (LAB). Furthermore, whey proteins can protect phages during heat treatment, thereby increasing the above risk. The objectives of this work were to understand this protective effect and to identify genetic determinant(s) responsible for the thermal resistance of lactococcal phages. First, the effect of pH and time of heating on the inactivation of lactococcal thermo-resistant phage P1532 (Sk1virus/936 group) was measured, at 95 ºC, in WPC and in three individual major whey components. The molecular structure changes of the tested proteins were also monitored by Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy. Phage inactivation results indicated that acidic conditions of WPC favor the destruction of dairy phages by heat treatment. Moreover, it revealed that the protective effect of whey proteins was pH and time dependent and was not restricted to one component. FTIR spectra suggest that the protection is related to protein molecular structures and to the level of protein aggregates. Then, to further investigate this protection, we used lactoferrin (LF) as a whey protein model as a result of its unique physicochemical properties. We combined FTIR and circular dichroism (CD) spectroscopies to monitor the structural conformational changes of LF. Phage inactivation results revealed a strong protective effect of LF on P1532 phage at pH 5 but none at pH 7. Spectroscopic analysis showed that LF was unfolded after heating at pH 7, while it preserved its tertiary and secondary structures when heated at pH 5. In sum, there is a direct correlation between the thermal stability of whey proteins and their ability to protect P1532 phage from heat treatment. The results obtained in this respect offer new tools to minimize the impact of the protective effect on lactococcal phages. In order understand the thermal resistance of LAB phages, we aimed to identify genetic determinant(s) responsible for the thermal resistance of lactococcal phages. After challenging CB14 heat-sensitive phage (Sk1virus/936 group) to low and high temperatures, two phages with increased thermal resistance were selected. Sequencing of their genome revealed a 120 bp deletion in the gene coding for the tape measure protein (TMP). The TMP protein sequences of mutant phages were compared with their homologues in other wild-type L. lactis phages with a wide diversity in heat stability. Comparative analysis of TMP proteins of other lactococcal phages identified the same deletions in the extremely heat-stable phages P680 and P1532. We propose that the TMP is, in part, responsible for the heat stability of the highly predominant lactococcal phages of the Sk1virus group. Identifying this genetic determinant for Sk1virus heat stability is a first step to understand the emergence of this group of thermostable phages, and may lead to improved control strategies in the cheese industry

La variabilité pharmacocinétique liée à une élimination des médicaments par glucuronoconjugaison a été peu étudiée. Nous avons donc choisi d’étudier les caractéristiques pharmacocinétiques de deux médicaments glucuronoconjugués, l’acide mycophénolique (MPA, prodrogue, mycophénolate mofétil ou MMF) et le raltégravir, dans certaines situations cliniques spécifiques. Deux études cliniques ont été réalisées avec le MMF. En transplantation hépatique pédiatrique, des AUC0-12 de MPA supérieures à 30 mg.h/L ont été obtenues chez tous les enfants avec une dose de 600 mg/m² de MMF administrée par voie orale deux fois par jour. L’estimation de l’AUC0-12 par méthode non compartimentale étant particulièrement contraignante en pédiatrie, nous avons développé une stratégie de prélèvements limités permettant une estimation à partir de seulement trois prélèvements. Chez des patients adultes transplantés rénaux, nos travaux ont permis de caractériser le polymorphisme génétique des transporteurs ABCC2 et ABCB1 et l’albuminémie comme étant des facteurs de variabilité inter et intra-individuelle de la pharmacocinétique du MPA. Les concentrations intracellulaires moyennes de MPA dans les cellules mononuclées du sang périphérique étaient élevées et largement supérieures à la concentration de MPA inhibant 50% de l’activité de l’IMPDH. Nos premiers résultats concernant le raltégravir montrent que ses paramètres pharmacocinétiques sont caractérisés par une variabilité inter-individuelle importante chez des patients infectés par le VIH. Nous avons établi que le raltégravir ne se fixe pas du tout sur l’alpha-1-glycoprotéine acide mais se fixe à 60% sur l’albumine, cette fixation étant dépendante du pH plasmatique. Cependant, cette forte liaison du raltégravir à l’albumine n’empêche pas une bonne diffusion du médicament dans le compartiment séminal. En conclusion, les études de pharmacocinétique clinique que nous avons menées montrent que la variabilité de la pharmacocinétique de ces deux médicaments glucuronoconjugués est aussi importante que pour des médicaments métabolisés par le cytochrome P450 3A4. L’identification des facteurs de variabilité de ces médicaments contribue à l’optimisation des traitements. / Pharmacokinetic variability was poorly studied for drugs eliminated by glucuronidation. We therefore chose to study the pharmacokinetic parameters of two glucuronidated drugs, mycophenolic acid (MPA, prodrug, mycophenolate mofetil or MMF) and raltegravir, in specific clinical situations. Two clinical studies were conducted with MMF. In pediatric liver transplantation, MPA AUC0-12 above the target AUC of 30 mg.h/L were obtained in all children with a MMF dosing regimen of 600 mg/m² administered orally twice a day. As extensive AUC monitoring is laborious, especially in children, we developed a limited sampling strategy to calculate MPA AUC0-12 with only three samples. In adult renal transplantation, our work allowed us to characterize genetic polymorphism of ABCC2 and ABCB1 genes and serum albumin as factors of inter and intraindividual variability in MPA pharmacokinetics. We demonstrated that MPA concentrations in peripheral blood mononuclear cells were high and well above the concentration of MPA responsible for a 50%-inhibition of the activity of IMPDH. Our first results show that the raltegravir pharmacokinetics is characterized by a wide interindividual variability in HIV-infected patients. Raltegravir does not bind to alpha-1-acid glycoprotein but binds to 60% to albumin and this binding is pH-dependent. Despite this high protein binding, a good penetration into the seminal compartment was evidenced. In conclusion, these clinical pharmacokinetic studies demonstrated that the variability in the pharmacokinetics of these glucuronidated drugs is as important as the one exhibited by drugs metabolized by cytochrome P450 3A4. Identifying factors of variability of these glucuronidated drugs contributes to optimizing patient care.

Les nanomédecines injectées par voie intraveineuse interagissent avec les éléments biologiques qui les entourent dans le compartiment sanguin. Parmi ces interactions, celles avec les protéines sanguines se révèlent être très importantes dans le devenir de ces nanovecteurs, leur conférant une identité biologique influençant leur chemin jusqu’au tissu et aux cellules cibles. La compréhension et le contrôle de ces phénomènes reste un enjeu crucial dans le développement des nanomédecines. Des méthodes permettant une étude facilitée de ces interactions sont nécessaires à cet égard. Les travaux de cette thèse ont eu pour but de développer des méthodes, utilisables en routine, permettant une caractérisation fine des nanomédecines et de leurs interactions avec les protéines plasmatiques, applicables dans un contexte clinique. Ils s’inscrivent dans un projet intitulé « Nano Innovation for CancEr » (NICE, BPI France) regroupant un consortium de partenaires industriels en développement clinique de nanomédecines.Dans un premier temps, un travail bibliographique sur les méthodes actuellement mises en œuvre pour une telle caractérisation ont pu mettre en avant deux limitations majeures. (i) D’une part, la complexité des méthodes actuelles disponibles pour lesquelles la spécificité des équipements et l’expertise requise limitent une utilisation à large échelle. (ii) D’autre part, les propriétés aujourd’hui caractérisées en routine (taille, morphologie globale, charge) ne sont que grossières comparées à la finesse des processus biologiques qui interagissent et « analysent » les nanovecteurs une fois introduits dans le milieu biologique. Ces deux aspects limitent aujourd’hui un développement plus sûr des nanomédecines pour une bonne reproductibilité en clinique et garantir des essais de contrôle qualité fiables.Au cours de nos travaux, nous avons développé des méthodes permettant de répondre en partie à la problématique posée par la caractérisation des nanomédecines. Une méthode d’analyse à haut débit de l’activation du système du complément par immunoélectrophorèse en deux dimensions a été développée et validée. Elle permet l’analyse reproductible de l’activation de la protéine C3. Elle est applicable à l’étude de l’effet de la présence de nanoparticules dans le sérum humain et leur degré d’action sur la cascade du complément. Cette méthode a été utilisée pour mener une étude plus fondamentale du mécanisme de l’activation du système du complément en regard de l’architecture de la surface de nanoparticules.Une deuxième méthode d’étude de l’activation du complément produit par des nanomédecine a été proposée sur la base de la résonnance plasmonique de surface (SPR). Une puce permettant un screening automatisé de l’activation du complément a été développée. L’application de cette méthode comparée à d’autres méthodes d’études de l’activation du système du complément (Immunoélectrophorèse 2D, ELISA) a permis d’identifier des biais lors de leur application à l’évaluation des nanomédecines.Enfin, une approche originale de caractérisation de la surface de nanoparticules a été proposée utilisant des protéines pour sonder la capacité de la surface des nanoparticules à adsorber ou repousser ces dernières. Dans cette méthode, l’électrophorèse capillaire est utilisée comme outil analytique permettant une analyse directe de l’échantillon sans séparation préalable des nanomédecines.Les méthodes développées au cours de ces travaux peuvent être appliquées à la caractérisation de nanomédecines et proposées comme des méthodes de contrôle en routine de façon plus générale. Un développement de la caractérisation dans ce sens constitue l’un des leviers pour une translation plus fructueuse des nanomédecines entrant en phase clinique. / Nanomedicines injected intravenously interact with surrounding biological elements in the bloodstream. Among these interactions, those with blood proteins turn out to be very important regarding the becoming of the nanovectors. They acquire a biological identity upon interaction with proteins which influence their path to target tissue and cells. The understanding and mastering of these phenomena remains a crucial issue in nanomedicine development. Methods allowing an easier study of these interactions are needed. The aim of these PhD thesis was to develop such methods, usable on a routine basis in a clinical context, allowing a fine characterization of nanomedicines and their interactions with plasmatic proteins. This PhD is part of the project “Nano Innovation for CancEr” (NICE, BPI France), gathering a consortium of industrials partners developing clinical nanomedicines.In a first time, a bibliographic study about current methods used for such a characterization could identify two major limitations. (i) On one hand, the complexity of current available methods for which the equipment specificity and required expertise prevent their use at a large scale. (ii) On the other hand, properties today characterized on a daily basis (size, morphology, charge) are too rough compared to the sharpness of biological processes who interact and “analyze” the nanovectors introduced in biological media. These two aspects are limiting a safer development of nanomedicines as well as a good reproducibility of their action in clinics.During this thesis, we developed methods allowing a beginning of answer to the wide problematic of nanomedicine characterization. A method for a high throughput analysis of complement activation by nanomedicines via 2D immunoelectrophoresis was developed and validated. It allows the reproducible analysis of protein C3 fragmentation. This method is applicable to the study of the impact of nanoparticles in human serum and their degree of action on the complement cascade. This method has been used for a more fundamental study on complement activation pathways activated according to the architecture of nanoparticles surface.A second method for the study of complement activation produced by nanoparticles has been proposed using surface plasmon resonance (SPR). A chip allowing an automated screening of complement activation has been developed. This method was compared to other methods for complement activation study (2D immunoelectrophoresis, ELISA) and allowed the identification of bias during nanomedicine evaluation.Finally, an original approach for the characterization of nanomedicine’s surface architecture using proteins as molecular probes has been proposed. In this method, capillary electrophoresis has been used as analytical tool to allow a direct analysis of sample without preliminary nanoparticle removal step.Methods developed during this work can be applied to the characterization of nanomedicines and proposed as routine methods for quality control. A development of nanomedicines characterization in this direction constitute one of the lever for a more fruitful translation of nanomedicines entering in clinical phase.

La prédiction des paramètres pharmacocinétiques/toxicocinétiques (PK/TK), tels que la clairance intrinsèque (CLint) et la clairance hépatique (CLh) des médicaments, demeure un défi majeur en modélisation quantitative. Selon « l’hypothèse du médicament libre », seul le médicament libre peut traverser la membrane plasmique et la CLh de ce médicament est calculée en fonction de sa fraction libre (fup). Néanmoins, la captation hépatique facilitée par l’albumine (ALB) représente clairement une violation de « l’hypothèse du médicament libre ». Cette captation hépatique se base sur la possibilité que le complexe ALB-médicament puisse assurer un apport supplémentaire en médicament aux hépatocytes. Ainsi, cela pourrait expliquer en grande partie les sous-prédictions observées de CLh. Par ailleurs, certains médicaments peuvent se lier fortement à plusieurs protéines plasmatiques telles que l’ALB et l’alpha-1-glycoprotéine acide (AGP). Ainsi, la forte liaison d’un même médicament à l’ALB, à l’AGP, ou aux deux, pourrait avoir des répercussions bien distinctes sur la prédiction de ces paramètres PK/TK. Cependant, aucune étude n’a été faite pour simuler la différence entre leurs effets. L’objectif principal de cette thèse est donc d’évaluer (avec plus d’exactitude et de précision), pour une série de médicaments, en condition in vivo (ou in situ), ces répercussions en présence des deux protéines plasmatiques, conjointement ou séparément. En outre, il est indispensable de vérifier si une approche générique en modélisation peut être appliquée. Cette thèse est répartie en trois objectifs spécifiques. Le premier est de proposer un arbre décisionnel pour faciliter la sélection des approches prédictives appropriées de CLhin vivo pour des médicaments ayant des caractéristiques différentes. Le second est d’évaluer les répercussions de fortes liaisons aux deux protéines plasmatiques ALB et AGP sur la CLh de deux xénobiotiques choisis (perampanel (PER) et fluoxétine (FLU)) ; ces médicaments ont de fortes affinités pour les deux protéines et un métabolisme exclusif (ou prédominant) dans le foie. Et, le dernier est de développer et valider un nouveau modèle prédictif de CLh pour les xénobiotiques ayant le potentiel de se lier fortement dans le plasma, à l’ALB ainsi qu’à l’AGP. Dans un premier temps, des données in vitro rapportées chez l’humain ont été colligées pour 19 médicaments (substrats des transporteurs OAT2 et OATP1B1), et ont été ensuite utilisées dans six modèles d’extrapolation in vitro-in vivo (IVIVE) pour prédire lesdits paramètres. Après une comparaison statistique, les résultats ont montré que l’approche 2 (c’est-à-dire « fup-adjusted model ») qui se base sur la captation hépatique facilitée par l’ALB, avait la meilleure performance prédictive. Cependant, l’approche 5 (c’est-à-dire « Extended Clearance Model ») qui se base sur le transport facilité, en était une très pertinente à appliquer pour les substrats de transporteurs membranaires. Lesdits substrats seraient potentiellement moins affectés par l’ALB. Ainsi, un arbre décisionnel a été proposé pour choisir rapidement et judicieusement la meilleure approche IVIVE servant à prédire la CLhin vivo pour chaque xénobiotique en présence de l’ALB. Dans un deuxième temps, les médicaments PER et FLU ont été sélectionnés à partir d’une collecte de données (N= 1907 médicaments) en fonction de certains critères (avoir un métabolisme exclusif ou prédominant dans le foie, pas de transport facilité par les transporteurs membranaires, une haute affinité pour les deux protéines ALB et AGP, et un ratio de liaison à l’AGP sur celle à l’ALB proche de l’unité). Cette sélection a été réalisée pour faire des expériences sur des foies isolés et perfusés de rats (IPRL), en présence et en absence des protéines ALB et AGP (c’est-à-dire quatre scénarios IPRL). Les résultats IPRL ont démontré que PER est faiblement à moyennement métabolisé (extraction hépatique= 0,2-0,7), tandis que FLU est fortement métabolisé (extraction hépatique= 0,8-0,99). Le modèle Michaelis-Menten a été ajusté aux cinétiques métaboliques, et différents paramètres Vmax, Km et Km, u ont été obtenus de ce modèle. À de faibles concentrations libres pour les deux médicaments (c’est-à-dire à des concentrations thérapeutiques) et en présence des protéines plasmatiques, les valeurs de CLint non liée ont augmenté pour PER (avec l’ALB et le mélange des deux protéines (MIX)) et FLU (avec l’ALB, l’AGP et le MIX) par rapport à celles obtenues du scénario sans protéine (sauf pour PER avec AGP, lesdites valeurs ont diminué). Par ailleurs, les calculs des ratios CLint (SANS versus AVEC protéine) ont permis d’indiquer l’occurrence d’une facilitation de la captation hépatique de médicaments par l’ALB ou l’AGP. Ces ratios ont aussi permis de vérifier si la cinétique métabolique pour PER et FLU suivait soit « l’hypothèse du médicament libre » soit celle de « la captation hépatique facilitée par les protéines plasmatiques ». Dans un dernier temps, une nouvelle approche prédictive de CLh (approche WO-to-MIX) est développée en se basant sur une nouvelle notion de liaison fractionnelle et en intégrant dans le « fup-adjusted model » de nouveaux paramètres tels que la fraction liée à l’ALB (fB-ALB) et celle liée à l’AGP (fB-AGP) à partir du scénario MIX. Ce modèle est basé sur la captation facilitée par l’ALB. Contrairement à l’approche WO-to-MIX, le « well-stirred model » (ou modèle conventionnel) est basé sur l’hypothèse du médicament libre. Ensuite, les paramètres Vmax et Km obtenus in situ pour PER et FLU lors des expériences IPRL sans protéines, ont été utilisés en combinaison avec le paramètre intrant de la fraction libre ajustée (fup-adjusted) pour le « fup-adjusted model » ou avec la fraction libre (fup) pour le « well-stirred model ». Une comparaison des performances prédictives globales des deux modèles a été faite. Les performances prédictives du nouveau modèle étaient prometteuses, en particulier pour FLU qui montrait le plus haut degré de captation hépatique médiée par l’ALB, par rapport au modèle conventionnel. L’approche WO-to-MIX est une première validation d’un nouveau modèle d’extrapolation proposé pour les médicaments comme FLU qui se lient à l’ALB et à l’AGP. Néanmoins, le modèle conventionnel reste utile à utiliser pour les médicaments comme PER. L’exactitude de prédiction était inférieure pour ce dernier médicament probablement parce que la captation hépatique par l’ALB ne semble pas être maximale, et, par conséquent, l’utilisation de fup-adjusted a surestimé la CLhin vivo. Par conséquent, plus de travail est nécessaire en particulier pour PER. Cette thèse démontre qu’une seule approche générique pour prédire la CLh n’existe pas. Néanmoins, le choix d’une approche IVIVE ayant une performance prédictive satisfaisante est maintenant possible. Les résultats de cette thèse contribuent à : 1) mieux comprendre les répercussions sur les paramètres PK/TK de la forte liaison des médicaments à l’ALB et à l’AGP ; 2) choisir la meilleure approche prédictive de CLh sur la base de l’affinité du xénobiotique (médicament ou contaminant) pour chacune des protéines plasmatiques et des mécanismes impliqués dans le foie ; et 3) prédire la CLh avec précision et exactitude des xénobiotiques qui se lient aux deux protéines plasmatiques. Ces approches IVIVE pour la CLh pourront assurément être intégrées dans des modèles PK/TK à base physiologique pour les xénobiotiques afin d’améliorer la prédiction de leur pharmacocinétique et d’accélérer le processus de développement de médicaments. / The prediction of pharmacokinetic/toxicokinetic (PK/TK) parameters such as intrinsic clearance (CLint) and hepatic clearance (CLh) for highly bound drugs is a major challenge in quantitative modeling. According to the ‘free drug hypothesis’, only the free drug can pass through the plasma membrane and the CLh of this drug is calculated according to its free fraction (fup). Nevertheless, the hepatic uptake facilitated by albumin (ALB) is a violation of the ‘free drug hypothesis’. This facilitated hepatic uptake is based on the possibility that the ALB-drug complex may provide additional drug intake to the hepatocytes. Thus, this could largely explain the underpredictions of CLh. In addition, some drugs can bind extensively in plasma, and to several plasma proteins such as ALB and alpha-1-glycoprotein acid (AGP). Thus, the high binding of the same drug to either ALB or AGP, or to both, could have distinct impacts on the prediction of these PK/TK parameters. However, no study has yet explored how to simulate the difference between these impacts. The main objective of this thesis is therefore to evaluate (with accuracy and precision) for a series of drugs, in the in vivo (or in situ) condition, these impacts in the presence of the two plasma proteins, jointly or separately. Also, it is important to verify if a generic model can be applied. This thesis is divided into three specific objectives. The first is to propose a decision tree to facilitate the selection of appropriate predictive approaches of CLhin vivo for drugs with different characteristics. The second is to assess the impacts of extensive binding to the two plasma proteins ALB and AGP on the CLh of two selected xenobiotics (perampanel (PER) and fluoxetine (FLU)); these drugs have strong affinities to both proteins and an exclusive (or predominant) metabolism in the liver. And the last objective is to develop and validate a new predictive model of CLh for xenobiotics with the potential to bind extensively to ALB as well as to AGP. Firstly, in vitro data obtained in humans were collected for 19 drugs (i.e. substrates of OAT2 and OATP1B1 transporters) and were then used in six in vitro-to-in vivo (IVIVE) extrapolation models to predict these PK/TK parameters. After a statistical comparison, the results showed that the approach 2 (i.e. ‘fup-adjusted model’) that is based on the ALB-facilitated hepatic uptake, had the best predictive performance. However, the approach 5 (i.e. ‘Extended Clearance Model’) that is based on the membrane transporter-mediated uptake, was very relevant to apply for the substrates of membrane transporters. These substrates would potentially be less affected by ALB. Thus, a decision tree has been proposed to quickly and judiciously select the best IVIVE approach to predict CLhin vivo for each xenobiotic in the presence of ALB. Secondly, the PER and FLU drugs were selected from a data collection of 1907 drugs depending on certain criteria (exclusive or predominant metabolism in the liver, no transport facilitated by membrane transporters, high affinity for the two proteins ALB and AGP, and having a binding ratio between AGP and ALB close to the unity). This selection was made to conduct experiments using the isolated and perfused rat liver (IPRL) apparatus, in the presence, and in the absence of the ALB and AGP proteins (i.e. four IPRL scenarios). The IPRL results showed that PER is low to moderately metabolized (hepatic extraction= 0.2-0.7), while FLU is highly metabolized (hepatic extraction= 0.8-0.99). The Michaelis-Menten model was fitted to the obtained metabolic kinetics, and different parameters Vmax, Km and Km, u were obtained from the model. At low free concentrations for both drugs (i.e. therapeutic concentrations) and in the presence of plasma proteins, the values of unbound CLint increased for PER (with ALB and the mixture of the two proteins (MIX)) and FLU (with ALB, AGP and MIX); when compared to those obtained from the protein-free scenario (except for PER with AGP, the unbound CLint values decreased). In addition, the calculations of CLint ratios (WITHOUT versus WITH protein) indicated the occurrence of a hepatic uptake facilitated by ALB or AGP. These ratios also helped in verifying whether the metabolic kinetics for PER and FLU followed either ‘the free drug hypothesis’ or that of ‘plasma protein-facilitated hepatic uptake’. Finally, a new predictive approach of CLh (WO-to-MIX approach) was developed based on a new notion of fractional binding and incorporating new parameters such as the ALB bound fraction (fB-ALB) and the AGP bound fraction (fB-AGP) from the MIX scenario into the ‘fup-adjusted model’. This model is based on the ‘ALB-facilitated hepatic uptake’. Unlike the WO-to-MIX approach, the ‘well-stirred model’ is based on ‘the free drug hypothesis’. Then, the Vmax and Km parameters that were obtained in situ for PER and FLU from the protein-free IPRL experiments, were used in combination with the fup-adjusted input parameter for the ‘fup-adjusted model’ or with the free fraction (fup) for the ‘well-stirred model’. A comparison of the two models’ overall predictive performances was made. The predictive performances of the new model were promising for FLU, which showed the highest degree of ‘ALB-mediated hepatic uptake’, compared to the conventional model. This WO-to-MIX approach is a first validation of a novel extrapolation model suggested for drugs such as FLU that bind to both ALB and AGP. The well-stirred model remains however a useful tool to predict the clearance for drugs such as PER. The prediction accuracy was lower for the latter drug probably because the ALB-mediated hepatic uptake does not seem to be maximal, and, hence, the use of fup-adjusted has overestimated its CLhin vivo. Therefore, more work is needed particularly for PER. This thesis shows that a generic approach to predict the CLh in vivo does not exist. Nevertheless, the choice of an IVIVE approach with satisfactory predictive performances is now possible. The results of this thesis contribute to: 1) better understand the impacts on the PK/TK parameters of extensive drug binding to ALB and AGP; 2) choose the best predictive approach to CLh based on the affinity of xenobiotic (drug or contaminant) to each of the plasma proteins and the mechanisms involved in the liver; and 3) predict accurately and with precision the output CLh of xenobiotics that bind to the two plasma proteins. These IVIVE approaches for CLh can certainly be integrated into physiologically based PK/TK models for xenobiotics to improve the prediction of their pharmacokinetics and to accelerate the drug development process.