La fumée de cigarette peut endommager plusieurs organes de notre organisme, causant des maladies chroniques sévères et divers types de cancers. Elle interagit notamment avec les enzymes de métabolisme des médicaments de phase I et II, et contribue ainsi à la perturbation de la pharmacocinétique de divers médicaments chez les fumeurs. Les transporteurs membranaires sont des acteurs majeurs de l'absorption, la distribution et l'élimination de médicaments, et certains sont impliqués dans les interactions médicamenteuses. De plus, ils assurent le flux des molécules endogènes physiologiques vitales, et l'élimination de divers xénobiotiques toxiques non seulement chez les mammifères mais aussi chez les êtres unicellulaires, comme les levures. Ces transporteurs sont des cibles potentielles de la fumée de cigarette. D’où l'importance d'étudier l'interaction de la fumée de cigarette et de ses composés avec les transporteurs membranaires. Nos résultats démontrent que le condensat de fumée de cigarette (CSC) modifie l'activité fonctionnelle et/ou l'expression de plusieurs transporteurs hépatiques et rénaux in vitro dans des modèles cellulaires hépatiques et/ou non-hépatiques, notamment les OATPs (organic anion transporting polypeptide), l'OCT1 (organic cation transporter 1), la BCRP (breast cancer resistance protein) et l'OAT3 (organic anion transporter 3). Une implication remarquable du récepteur Ah (AhR) est mise en évidence dans la régulation de l'expression de certains transporteurs comme la MRP4 (multidrug resistance-associated protein), la BCRP, l'OAT2 et l'OCT1 dans des cellules HepaRG exposées au CSC. De plus, chez la levure Saccharomyces cerevisiae, le CSC inhibe l'activité d'efflux notamment des transporteurs de la rhodamine 123 et de la caféine, et induit, après trois heures, leur expression avec d'autres gènes qui sont aussi impliqués dans la résistance aux xénobiotiques comme les transporteurs de la membrane plasmique le Pdr5, le Snq2, le Pdr10, le Pdr15 et le Tpo1. Enfin, un effet inhibiteur remarquable des amines aromatiques hétérocycliques (AAH) est mis en évidence in vitro, notamment celui de Trp-P-1 et de Trp-P2 sur l'activité des transporteurs OCT1 et OCT2. De plus, les données in silico suggèrent que des descripteurs moléculaires des AAH comme l'AMW (average molecular weight), la qnmax (maximum negative charge) et le SPP (submolecular molarity parameter), sont des paramètres cruciaux de l'inhibition commune des OCT1, OCT2 et OCT3 par les AAH. Le CSC est donc un modulateur bifonctionnel, qui peut intervenir dans la régulation de l'activité et de l'expression des transporteurs membranaires hépatiques et rénaux, ainsi que ceux chez la levure. De telles interactions peuvent contribuer à l'altération de la pharmacocinétique des médicaments et des composés endogènes chez les fumeurs, d’où l'évaluation de l'exposition hépatique et rénale au CSC demeure indispensable. / Cigarette smoke can damage every part of our body, causing severe chronic diseases and various types of cancers. It also interacts with drug metabolizing enzymes of phase I and II, and thus contributes to pharmacokinetics disruption of various drugs in smokers. Membrane drug transporters are major actors involved in drugs absorption, distribution and elimination, and some are involved in drug-drug interactions. In addition, membrane drug transporters ensure the flow of vital physiological endogenous molecules, and the elimination of various toxic xenobiotics, not only in mammals but also in unicellular organisms, especially in yeasts. Therefore, this indicates the importance of studying the interaction of cigarette smoke and its contained chemicals with drug transporters. Our results demonstrate that cigarette smoke condensate (CSC) modifies the functional activity and / or expression of several hepatic and renal transporters in vitro in hepatic and / or non-hepatic cellular models, including OATPs (organic anion transporting polypeptide), OCT1 (organic cation transporter 1), BCRP (breast cancer resistance protein) and OAT3 (organic anion transporter 3). A remarkable implication of Ah receptor (AhR) was also demonstrated in MRP4 (multidrug resistance-associated protein), BCRP, OAT2 and OCT1 expression regulation in HepaRG cells exposed to CSC. In addition, in Saccharomyces cerevisiae, CSC inhibits the efflux activity of at least the rhodamine 123 and caffeine transporters, and induces, after three hours, their expression and that of others involved in xenobiotic resistance such as plasma membrane transporters Pdr5, Snq2, Pdr10, Pdr15 and Tpo1. Finally, a remarkable inhibitory effect of heterocyclic aromatic amines (HAA) is demonstrated in vitro, in particular that of Trp-P-1 and Trp-P-2 on the activity of OCT1 and OCT2. In addition, in silico data suggest that molecular descriptors of HAA such as AMW (average molecular weight), qnmax (maximum negative charge) and SPP (submolecular molarity parameter), may represent crucial parameters for common inhibition of OCT1, OCT2 and OCT3 transporters by HAA. Thus, CSC acts as bifunctional modulator, which can regulate activity and expression of hepatic and renal drug transporters as well as some membrane transporters in yeasts. Such interactions may contribute to the alteration of the pharmacokinetics of drugs and endogenous compounds in smokers, hence the evaluation of hepatic and renal exposure to CSC remains essential.

Les transporteurs membranaires jouent un rôle primordial dans la pharmacocinétique de médicaments mais aussi dans le transport de composés endogènes. La maîtrise de modèle in vitro permettant d’évaluer leur implication dans des interactions médicamenteuses, notamment au niveau hépatique, est donc primordiale. L’utilisation de ces modèles permettra aussi de déterminer l’impact potentiel de contaminants environnementaux, comme les particules diesel, sur l’expression fonctionnelle de transporteurs. Nos résultats démontrent la fiabilité de modèles hépatocytaires (hépatocytes et cellules d’hépatome HepaRG) en culture monocouche pour l’étude du transport membranaire de médicaments. Grâce à ces modèles, nous avons mis en évidence que des extraits de particules diesel (DEPe) peuvent modifier l’expression et/ou la fonction de transporteurs membranaires hépatiques, les Organic Anion Polypeptide Transporter (OATP) et les Multidrug Resistance associated Protein (MRP). Au niveau pulmonaire, les DEPe peuvent aussi augmenter l’expression du complexe LAT1/CD98hc, un complexe protéique de transport d’acides aminés souvent associé à de mauvais pronostics dans les cas de cancer du poumon. En conclusion, nos résultats mettent en évidence que les DEPe peuvent intervenir dans la régulation de l’activité et de l’expression de transporteurs membranaires tant au niveau hépatique qu’au niveau pulmonaire. / Membrane transporters play a major role in the pharmacokinetic of drugs and in the transport of endogenous compounds. The development of in vitro models for the study of their expression and activity is therefore important to consider, notably for analyzing their interactions with drugs or environmental contaminants such as diesel exhaust particles. Our results demonstrated the reliability of hepatocytic cells (hepatocytes and highly differentiated hepatoma HepaRG cells) in monolayer culture for the study of membrane transport of drugs. Using these models allowed us to demonstrate that extracts of diesel exhaust particles (DEPe) can alter the expression and / or function of major liver transporters such as organic anion transporting polypeptides (OATP) and Protein Multidrug associated Resistance (MRP). In lung cells, DEPe can increase the expression of complex LAT1 / CD98hc a protein complex, that is associated with poor prognosis in lung cancer. In conclusion, our results demonstrated that DEPe can regulate activity and expression of membrane transporters at hepatic and lung level.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les membranes cellulaires jouent un rôle important dans l’absorption des médicaments et la distribution de ceux-ci dans le corps humain. Elles contiennent différents transporteurs membranaires qui sont responsables des profils pharmacocinétiques, d’innocuité et d’efficacité des xénobiotiques. Lors du développement d’un médicament, il s’avère donc indispensable, de prédire l’interaction des nouveaux composés avec les transporteurs présents dans l’organisme. Le but du projet de recherche est de créer un nouvel outil pour étudier le comportement de la glycoprotéine-P (P-gp), un transporteur membranaire responsable du rejet de nombreux composés, sur différents médicaments. Pour cela, un modèle non cellulaire est développé en utilisant des protéoliposomes : des liposomes dans lesquels des transporteurs sont incorporés. La méthodologie consiste tout d’abord à produire, extraire et purifier la protéine d’intérêt à partir de deux systèmes d’expression : MDCK-MDR1 (cellules de chien transfectées avec le gène humain MDR1) et Pichia pastoris (levures) fin de déterminer les avantages et les limites de ces deux types cellulaires. Différentes méthodes de reconstitution dans des protéoliposomes ont ensuite été testées avec la P-gp obtenue. Puis, l’activité ATPasique de la P-gp reconstituée a été évaluée en présence de différents substrats. Les protocoles de culture cellulaire, d’extraction et de purification des deux systèmes d’expression ont été implémentés avec succès au sein du laboratoire. Les résultats montrent que les rendements obtenus sont supérieurs avec les levures qu’avec les cellules de mammifère. En outre, Pichia pastoris offre les avantages d’être facile et rapide à cultiver et peu couteux. Les premiers résultats d’activité ATPasique obtenus avec la P-gp reconstituée en protéoliposomes étaient prometteurs mais n’ont pas été reproduits en raison de la dégradation de la protéine membranaire. Les prochaines études du projet porteront sur un autre transporteur membranaire de la famille ABC, BCRP, une protéine de plus petite taille qui devrait montrer une plus grande stabilité pour mener à bien les tests. / Cellular membranes play an important role in the absorption and distribution of drugs in the human body. They contain different membrane transporters, which are responsible for the pharmacokinetic properties of drugs, as well as the safety and efficiency of their diffusion. When developing a new drug, it is thus of utmost importance to study the way that it will interact with the transporters present within the body. The aim of this study was to evaluate a new tool for measuring permeability in order to understand the function and mecanisms of P-glycoprotein (P-gp). P-gp is a transporter that is responsible for the rejection of many different compounds found in various drugs. This study thus seeks to use proteoliposomes to develop non-cellular models of membrane permeability including efflux and uptake transporters. This novel model of permeability will be utilized to study the underlying mechanisms of membrane permeability to xenobiotics. The human P-gp was produced, extracted and purified using two different expression systems: MDCK-MDR1 cells (Madin-Darby canine kidney cells transfected with the human MDR1 gene) and Pichia pastoris. Both expression systems were studied in order to compare the strengths and weaknesses of each system. We then tested different methods of reconstituting the P-gp into protéoliposomes. Finally, we measured the level of ATPase activity using different substrates. The protocols of cell culture, extraction and purification of both expression systems were accomplished in a laboratory during this study. These results demonstrated that expressing P-gp using yeast was more effective than that of mammalian cells. Furthermore, working with Pichia pastoris offers multiple advantages: expressing P-gp was easier, faster and cheaper than working with mammalian cells. The first measurements of ATPase activity using reconstituted P-gp proteoliposomes were promising, however they proved difficult to reproduce due to the possible degradation of the membrane protein.Further studies in this project will look to evaluate another ABC membrane transporter, BCRP. This smaller protein should prove to be more stable than P-gp, facilitating experimentation.

No description available.

Le phosphate inorganique (Pi) est un minéral essentiel de notre organisme, qui intervient dans la composition des acides nucléiques et des phospholipides, dans la minéralisation des os et des dents, dans la production d’énergie, et dans la régulation des voies de signalisation. L’homéostasie du Pi est étroitement régulée par différents transporteurs, et des anomalies du transport de Pi peuvent avoir des conséquences cliniques sévères. Chez l’homme, ils existent 3 transporteurs de Pi distincts de type SLC (solute carrier) avec une distribution tissulaire large et initialement identifiés en tant que récepteurs de rétrovirus : PiT1/SLC20A1, PiT2/SLC20A2, et XPR1/SLC53A1.Des mutations dans PiT2 sont associées à une maladie rare, la calcification cérébrale primaire familiale (PFBC), caractérisée par des dépôts de phosphate de calcium dans les noyaux gris centraux et par l’expression de troubles neuropsychiatriques. Alors que PiT1 ne semble pas être impliqué dans cette maladie, nous avons découvert que des mutations dans XPR1 étaient présentes chez des patients PFBC, renforçant le lien entre la maladie PFBC et les désordres de l’homéostasie du phosphate.Dans ce travail, nous avons cherché à comprendre comment PiT2 et XPR1, deux transporteurs de Pi mais de flux opposés peuvent conduire à une même maladie. Pour cela, nous avons étudié le lien entre PiT2 et XPR1 dans la régulation du Pi ainsi que les domaines de XPR1 impliqués dans le transport. Nous avons d’abord identifié de nouveaux variants PFBC dans PiT2 et XPR1 et confirmé l'effet délétère de ces mutations sur l’import et l’export. Nous avons pu distinguer des mutations qui abolissaient l’expression en surface de XPR1, et donc indirectement l’export de Pi, alors que d’autres avaient un impact fonctionnel direct sur les transporteurs pourtant présents à la membrane plasmique.L’inactivation de XPR1 dans des cellules haploïdes humaines induit une altération profonde de l’export de Pi sans effet notable sur l’import. De manière surprenante, l’inactivation de PiT2 entraine un effet modéré sur l’import, probablement dû à l'activité complémentaire de PiT1, avec une chute de l’export dépendant de XPR1. Cet effet identifie une boucle de régulation que nous avons montrée être essentielle au maintien des niveaux de phosphate et d’ATP. Ces résultats révèlent que le défaut d’export de phosphate par inactivation de PiT2 et XPR1 est susceptible d’être l’étape-clé qui conduit à une maladie commune, la PFBC.Nous nous sommes concentrés sur cette étape d‘export régulée en étudiant le domaine SPX de XPR1 dans lequel la plupart des mutations PFBC ont été retrouvées. Nous avons identifié la tankyrase (TNK) comme interactant cellulaire, et localisé son site d’interaction à la bordure carboxyle de SPX. Nous avons observé que la délétion de SPX entrainait un défaut d’export de Pi, et que la perte d’interaction de TNK à XPR1 par mutagenèse ponctuelle avait le même effet, suggérant que TNK et SPX sont 2 composants essentiels à l’export de phosphate. Enfin, nous avons identifié de nouvelles mutations de XPR1 à l'extrémité C-terminale qui abolissaient l’export de Pi, et montré que la délétion de ce domaine entrainait un défaut d’expression de XPR1 à la membrane plasmique. Nos résultats indiquent donc que les domaines N- et C-terminaux jouent un rôle clé dans l’export, et donc dans l’homéostasie du phosphate, avec le domaine C-terminal jouant plutôt un rôle dans le trafic en surface de XPR1.L’ensemble de ce travail a permis de documenter de nouvelles mutations PFBC dans les gènes PiT2 et XPR1, de démontrer que ces transporteurs étaient impliqués dans l’homéostasie intracellulaire du phosphate, en dévoilant que l’export de phosphate est vraisemblablement l’étape clé de la PFBC, ouvrant ainsi de nouvelles pistes dans la compréhension de cette maladie. Nous avons également identifié des domaines de XPR1 et un partenaire cellulaire, essentiels à l’export de Pi et/ou au trafic membranaire. / Phosphate (Pi) is a key mineral that participates directly in the synthesis of nucleic acids and membranes, bone and tooth mineralization, energy production, and signal transduction. Pi homeostasis is tightly regulated by transporter-mediated fluxes that adjust Pi concentration in real time, and defect in Pi transport has been associated with several pathologies. In humans, three Pi transporters, which belong to the solute carrier (SLC) superfamily, are widely expressed: PiT1/SLC20A1, PiT2/SLC20A2, and XPR1/SLC53A1. Interestingly, all three were initially identified as receptors for mammalian gammaretroviruses.Mutations in PiT2/SLC20A2 are responsible for a rare neurodegenerative disorder, the primary familial brain calcification (PFBC), characterized by deposits of calcium Pi in the basal ganglia and other regions of the brain, and associated with diverse neuropsychiatric clinical manifestations. While PiT1/SLC20A1 has not been involved in PFBC, we recently identified mutations in XPR1/SLC53A1 as causative for PFBC, thus linking further the disease with cellular Pi homeostasis dysfunction.In this work, we aimed to understand how defects of opposite Pi transport functions lead to PFBC, investigated the relationship between PiT2 and XPR1 in cellular Pi regulation, and studied XPR1 domains in Pi transport. We first identified several PFBC mutations in PiT2/SLC20A2 and XPR1/SLC53A1, and confirmed their impact on Pi import or export, respectively. Some of the mutations altered transporter cell surface expression, resulting in Pi transport impairment, while others did neither alter cell surface expression, nor retroviral receptor functions, confirming that Pi transport function and viral envelope glycoprotein binding can be structurally distinguished.Using single gene knock-out human haploid cells, we showed that depletion of XPR1/SLC53A1 resulted in a dramatic Pi export alteration, with no detectable effect on Pi import, in agreement with Pi exporter function of XPR1. Interestingly, depletion of PiT2/SLC20A2 had little impact on Pi uptake, most likely due to compensatory function of PiT1/SLC20A1, with, however, a surprising impact on Pi export mediated by XPR1. This effect is reminiscent to a regulation loop that we found to maintain both Pi and ATP constant. This results unveil for the first time that Pi export alteration, and not Pi import, is likely to be the common pathophysiological impact of mutations in both PiT2 and XPR1. This would explain the synonymous pathological effects of two transporters that have opposite transport activity.We further explored this regulated phosphate export by characterizing the SPX N-terminal cytoplasmic domain of XPR1, which harbors most of the PFBC mutations. We identified a cellular tankyrase (TNK) as a binding partner and mapped the TNK-binding site to the carboxyl border of SPX; furthermore, we found that mutations that abolished TNK binding resulted in loss of Pi export. Full deletion of SPX domain maintained cell surface expression but altered export, suggesting that both TNK and SPX are essential components for Pi export. Finally, during this work, we identified mutations in the XPR1 C-terminal domain as responsible for PFBC that also impaired Pi export, and showed that deletion of this domain prevented XPR1 cell surface expression. Our results therefore indicate that N- and C-terminal domains of XPR1 play a key role in phosphate homeostasis, the latter domain appearing to exert a more prominent role in XPR1 membrane trafficking and/or folding.

Les pyréthrinoïdes et les organophosphorés sont des pesticides très utilisés, à l’origine d’une imprégnation forte de la population, exposée à ces contaminants principalement via l’alimentation. De plus en plus d’études scientifiques suggèrent des liens entre l’exposition à ces composés et des maladies chroniques ou des troubles du développement de l’enfant. Paradoxalement, leur devenir biologique chez l’homme est mal connu. Certaines études suggèrent que ces insecticides sont susceptibles d’intéragir avec les transporteurs membranaires ABC et SLC, protéines localisées au niveau d’interfaces hémato-tissulaires qui prennent en charge de nombreux substrats endogènes, médicaments et contaminants de l’environnement. L’objectif de notre étude a été de caractériser les effets d’insecticides des familles des pyréthrinoïdes et des organophosphorés sur l’activité de nombreux transporteurs ABC et SLC prenant en charge des médicaments (P-gp, BCRP, MRPs, OATP-1B1,-2B1,-1B3, OCT1-3, OAT1, OAT3, MATE1 et MATE2K) par une approche in vitro. Nous nous sommes également attachés à caractériser par des expérimentations in vitro et in silico, les mécanismes des interactions et les éléments structuraux des pesticides à l’origine de ces effets. Nous avons montré que de nombreux organophosphorés et pyréthrinoïdes étaient capables d’inhiber des transporteurs d’efflux (MRP, BCRP, P-gp) et d’influx (OATP1B1, OAT3, MATE1, OCT1-2) et de stimuler l’activité de certains OATPs. Les pesticides testés inhibaient très fortement l’activité des transporteurs de cations (OCT1 et OCT2) et ont pu bloquer le transport de catécholamines médiés par ces protéines. Une approche qSAR a permis de définir des paramètres physicochimiques associés aux effets modulateurs des pesticides et une approche d’amarrage moléculaire (docking) a mise en évidence les sites de liaisons de la P-gp impliquées dans ces interactions. Les conséquences des modulations de l’activité des transporteurs, en termes d’effets toxiques et d’interactions médicamenteuses, restent à définir pour les populations exposées à de fortes doses de pesticides. Toutefois, la contribution des interactions observées aux effets toxiques de ces insecticides est peu probable car nécessitant des concentrations nettement supérieures à celles atteintes dans le cadre d’une exposition environnementale de la population générale. / The general population is chronically exposed to pyrethroids and organophosphorus insecticides, mainly through alimentation. Several epidemiological studies have found an association between non-occupational exposure to these pesticides and chronic diseases and developmental disorders. Paradoxically, their biological fate in humans is poorly understood. Some studies suggest that these insecticides could interact with ABC and SLC membrane transporters. These membrane proteins, located at blood-tissue interfaces (liver, kidney, intestine ...), handle many endogenous substrates, drugs and pollutants. The objective of our study was to characterize, using an in vitro approach, the effects of pyrethroid and organophosphorus insecticides on the activity of numerous ABC and SLC human drug-transporters (P-gp, BCRP, MRPs, OATP-1B1, -2B1, -1B3, OCT1-3, OAT1, OAT3, MATE1 and MATE2K). We have also tried to analyze the mechanisms of interactions and the structural requirements for insecticides-mediated modulation of drug transporters activities using in vitro and in silico approach. We have shown that many organophosphorus and pyrethroids are able to inhibit ABC (MRP, BCRP, P-gp) and SLC (OATP1B1, OAT3, MATE1, OCT1-2) transporters and can stimulate the activity of some OATPs. Moreover, the tested pesticides inhibited very strongly the activity of OCT1 and OCT2 and blocked catecholamine transport mediated by these transporters. A qSAR approach allowed to define physicochemical parameters associated with the modulating effects of pesticides and a molecular docking approach revealed the P-gp binding sites involved in these interactions. The consequences of transporter activitie modulation, in terms of toxic effects and drug interactions, remain to be defined for populations exposed to high doses of pesticides, occurring notably in response to poisoning. However the alterations of these transporter activities by insecticides are unlikely to contribute to organophosphorus or pyrethroids toxicities of chronic low-dose exposure.

La prédiction des paramètres pharmacocinétiques/toxicocinétiques (PK/TK), tels que la clairance intrinsèque (CLint) et la clairance hépatique (CLh) des médicaments, demeure un défi majeur en modélisation quantitative. Selon « l’hypothèse du médicament libre », seul le médicament libre peut traverser la membrane plasmique et la CLh de ce médicament est calculée en fonction de sa fraction libre (fup). Néanmoins, la captation hépatique facilitée par l’albumine (ALB) représente clairement une violation de « l’hypothèse du médicament libre ». Cette captation hépatique se base sur la possibilité que le complexe ALB-médicament puisse assurer un apport supplémentaire en médicament aux hépatocytes. Ainsi, cela pourrait expliquer en grande partie les sous-prédictions observées de CLh. Par ailleurs, certains médicaments peuvent se lier fortement à plusieurs protéines plasmatiques telles que l’ALB et l’alpha-1-glycoprotéine acide (AGP). Ainsi, la forte liaison d’un même médicament à l’ALB, à l’AGP, ou aux deux, pourrait avoir des répercussions bien distinctes sur la prédiction de ces paramètres PK/TK. Cependant, aucune étude n’a été faite pour simuler la différence entre leurs effets. L’objectif principal de cette thèse est donc d’évaluer (avec plus d’exactitude et de précision), pour une série de médicaments, en condition in vivo (ou in situ), ces répercussions en présence des deux protéines plasmatiques, conjointement ou séparément. En outre, il est indispensable de vérifier si une approche générique en modélisation peut être appliquée. Cette thèse est répartie en trois objectifs spécifiques. Le premier est de proposer un arbre décisionnel pour faciliter la sélection des approches prédictives appropriées de CLhin vivo pour des médicaments ayant des caractéristiques différentes. Le second est d’évaluer les répercussions de fortes liaisons aux deux protéines plasmatiques ALB et AGP sur la CLh de deux xénobiotiques choisis (perampanel (PER) et fluoxétine (FLU)) ; ces médicaments ont de fortes affinités pour les deux protéines et un métabolisme exclusif (ou prédominant) dans le foie. Et, le dernier est de développer et valider un nouveau modèle prédictif de CLh pour les xénobiotiques ayant le potentiel de se lier fortement dans le plasma, à l’ALB ainsi qu’à l’AGP. Dans un premier temps, des données in vitro rapportées chez l’humain ont été colligées pour 19 médicaments (substrats des transporteurs OAT2 et OATP1B1), et ont été ensuite utilisées dans six modèles d’extrapolation in vitro-in vivo (IVIVE) pour prédire lesdits paramètres. Après une comparaison statistique, les résultats ont montré que l’approche 2 (c’est-à-dire « fup-adjusted model ») qui se base sur la captation hépatique facilitée par l’ALB, avait la meilleure performance prédictive. Cependant, l’approche 5 (c’est-à-dire « Extended Clearance Model ») qui se base sur le transport facilité, en était une très pertinente à appliquer pour les substrats de transporteurs membranaires. Lesdits substrats seraient potentiellement moins affectés par l’ALB. Ainsi, un arbre décisionnel a été proposé pour choisir rapidement et judicieusement la meilleure approche IVIVE servant à prédire la CLhin vivo pour chaque xénobiotique en présence de l’ALB. Dans un deuxième temps, les médicaments PER et FLU ont été sélectionnés à partir d’une collecte de données (N= 1907 médicaments) en fonction de certains critères (avoir un métabolisme exclusif ou prédominant dans le foie, pas de transport facilité par les transporteurs membranaires, une haute affinité pour les deux protéines ALB et AGP, et un ratio de liaison à l’AGP sur celle à l’ALB proche de l’unité). Cette sélection a été réalisée pour faire des expériences sur des foies isolés et perfusés de rats (IPRL), en présence et en absence des protéines ALB et AGP (c’est-à-dire quatre scénarios IPRL). Les résultats IPRL ont démontré que PER est faiblement à moyennement métabolisé (extraction hépatique= 0,2-0,7), tandis que FLU est fortement métabolisé (extraction hépatique= 0,8-0,99). Le modèle Michaelis-Menten a été ajusté aux cinétiques métaboliques, et différents paramètres Vmax, Km et Km, u ont été obtenus de ce modèle. À de faibles concentrations libres pour les deux médicaments (c’est-à-dire à des concentrations thérapeutiques) et en présence des protéines plasmatiques, les valeurs de CLint non liée ont augmenté pour PER (avec l’ALB et le mélange des deux protéines (MIX)) et FLU (avec l’ALB, l’AGP et le MIX) par rapport à celles obtenues du scénario sans protéine (sauf pour PER avec AGP, lesdites valeurs ont diminué). Par ailleurs, les calculs des ratios CLint (SANS versus AVEC protéine) ont permis d’indiquer l’occurrence d’une facilitation de la captation hépatique de médicaments par l’ALB ou l’AGP. Ces ratios ont aussi permis de vérifier si la cinétique métabolique pour PER et FLU suivait soit « l’hypothèse du médicament libre » soit celle de « la captation hépatique facilitée par les protéines plasmatiques ». Dans un dernier temps, une nouvelle approche prédictive de CLh (approche WO-to-MIX) est développée en se basant sur une nouvelle notion de liaison fractionnelle et en intégrant dans le « fup-adjusted model » de nouveaux paramètres tels que la fraction liée à l’ALB (fB-ALB) et celle liée à l’AGP (fB-AGP) à partir du scénario MIX. Ce modèle est basé sur la captation facilitée par l’ALB. Contrairement à l’approche WO-to-MIX, le « well-stirred model » (ou modèle conventionnel) est basé sur l’hypothèse du médicament libre. Ensuite, les paramètres Vmax et Km obtenus in situ pour PER et FLU lors des expériences IPRL sans protéines, ont été utilisés en combinaison avec le paramètre intrant de la fraction libre ajustée (fup-adjusted) pour le « fup-adjusted model » ou avec la fraction libre (fup) pour le « well-stirred model ». Une comparaison des performances prédictives globales des deux modèles a été faite. Les performances prédictives du nouveau modèle étaient prometteuses, en particulier pour FLU qui montrait le plus haut degré de captation hépatique médiée par l’ALB, par rapport au modèle conventionnel. L’approche WO-to-MIX est une première validation d’un nouveau modèle d’extrapolation proposé pour les médicaments comme FLU qui se lient à l’ALB et à l’AGP. Néanmoins, le modèle conventionnel reste utile à utiliser pour les médicaments comme PER. L’exactitude de prédiction était inférieure pour ce dernier médicament probablement parce que la captation hépatique par l’ALB ne semble pas être maximale, et, par conséquent, l’utilisation de fup-adjusted a surestimé la CLhin vivo. Par conséquent, plus de travail est nécessaire en particulier pour PER. Cette thèse démontre qu’une seule approche générique pour prédire la CLh n’existe pas. Néanmoins, le choix d’une approche IVIVE ayant une performance prédictive satisfaisante est maintenant possible. Les résultats de cette thèse contribuent à : 1) mieux comprendre les répercussions sur les paramètres PK/TK de la forte liaison des médicaments à l’ALB et à l’AGP ; 2) choisir la meilleure approche prédictive de CLh sur la base de l’affinité du xénobiotique (médicament ou contaminant) pour chacune des protéines plasmatiques et des mécanismes impliqués dans le foie ; et 3) prédire la CLh avec précision et exactitude des xénobiotiques qui se lient aux deux protéines plasmatiques. Ces approches IVIVE pour la CLh pourront assurément être intégrées dans des modèles PK/TK à base physiologique pour les xénobiotiques afin d’améliorer la prédiction de leur pharmacocinétique et d’accélérer le processus de développement de médicaments. / The prediction of pharmacokinetic/toxicokinetic (PK/TK) parameters such as intrinsic clearance (CLint) and hepatic clearance (CLh) for highly bound drugs is a major challenge in quantitative modeling. According to the ‘free drug hypothesis’, only the free drug can pass through the plasma membrane and the CLh of this drug is calculated according to its free fraction (fup). Nevertheless, the hepatic uptake facilitated by albumin (ALB) is a violation of the ‘free drug hypothesis’. This facilitated hepatic uptake is based on the possibility that the ALB-drug complex may provide additional drug intake to the hepatocytes. Thus, this could largely explain the underpredictions of CLh. In addition, some drugs can bind extensively in plasma, and to several plasma proteins such as ALB and alpha-1-glycoprotein acid (AGP). Thus, the high binding of the same drug to either ALB or AGP, or to both, could have distinct impacts on the prediction of these PK/TK parameters. However, no study has yet explored how to simulate the difference between these impacts. The main objective of this thesis is therefore to evaluate (with accuracy and precision) for a series of drugs, in the in vivo (or in situ) condition, these impacts in the presence of the two plasma proteins, jointly or separately. Also, it is important to verify if a generic model can be applied. This thesis is divided into three specific objectives. The first is to propose a decision tree to facilitate the selection of appropriate predictive approaches of CLhin vivo for drugs with different characteristics. The second is to assess the impacts of extensive binding to the two plasma proteins ALB and AGP on the CLh of two selected xenobiotics (perampanel (PER) and fluoxetine (FLU)); these drugs have strong affinities to both proteins and an exclusive (or predominant) metabolism in the liver. And the last objective is to develop and validate a new predictive model of CLh for xenobiotics with the potential to bind extensively to ALB as well as to AGP. Firstly, in vitro data obtained in humans were collected for 19 drugs (i.e. substrates of OAT2 and OATP1B1 transporters) and were then used in six in vitro-to-in vivo (IVIVE) extrapolation models to predict these PK/TK parameters. After a statistical comparison, the results showed that the approach 2 (i.e. ‘fup-adjusted model’) that is based on the ALB-facilitated hepatic uptake, had the best predictive performance. However, the approach 5 (i.e. ‘Extended Clearance Model’) that is based on the membrane transporter-mediated uptake, was very relevant to apply for the substrates of membrane transporters. These substrates would potentially be less affected by ALB. Thus, a decision tree has been proposed to quickly and judiciously select the best IVIVE approach to predict CLhin vivo for each xenobiotic in the presence of ALB. Secondly, the PER and FLU drugs were selected from a data collection of 1907 drugs depending on certain criteria (exclusive or predominant metabolism in the liver, no transport facilitated by membrane transporters, high affinity for the two proteins ALB and AGP, and having a binding ratio between AGP and ALB close to the unity). This selection was made to conduct experiments using the isolated and perfused rat liver (IPRL) apparatus, in the presence, and in the absence of the ALB and AGP proteins (i.e. four IPRL scenarios). The IPRL results showed that PER is low to moderately metabolized (hepatic extraction= 0.2-0.7), while FLU is highly metabolized (hepatic extraction= 0.8-0.99). The Michaelis-Menten model was fitted to the obtained metabolic kinetics, and different parameters Vmax, Km and Km, u were obtained from the model. At low free concentrations for both drugs (i.e. therapeutic concentrations) and in the presence of plasma proteins, the values of unbound CLint increased for PER (with ALB and the mixture of the two proteins (MIX)) and FLU (with ALB, AGP and MIX); when compared to those obtained from the protein-free scenario (except for PER with AGP, the unbound CLint values decreased). In addition, the calculations of CLint ratios (WITHOUT versus WITH protein) indicated the occurrence of a hepatic uptake facilitated by ALB or AGP. These ratios also helped in verifying whether the metabolic kinetics for PER and FLU followed either ‘the free drug hypothesis’ or that of ‘plasma protein-facilitated hepatic uptake’. Finally, a new predictive approach of CLh (WO-to-MIX approach) was developed based on a new notion of fractional binding and incorporating new parameters such as the ALB bound fraction (fB-ALB) and the AGP bound fraction (fB-AGP) from the MIX scenario into the ‘fup-adjusted model’. This model is based on the ‘ALB-facilitated hepatic uptake’. Unlike the WO-to-MIX approach, the ‘well-stirred model’ is based on ‘the free drug hypothesis’. Then, the Vmax and Km parameters that were obtained in situ for PER and FLU from the protein-free IPRL experiments, were used in combination with the fup-adjusted input parameter for the ‘fup-adjusted model’ or with the free fraction (fup) for the ‘well-stirred model’. A comparison of the two models’ overall predictive performances was made. The predictive performances of the new model were promising for FLU, which showed the highest degree of ‘ALB-mediated hepatic uptake’, compared to the conventional model. This WO-to-MIX approach is a first validation of a novel extrapolation model suggested for drugs such as FLU that bind to both ALB and AGP. The well-stirred model remains however a useful tool to predict the clearance for drugs such as PER. The prediction accuracy was lower for the latter drug probably because the ALB-mediated hepatic uptake does not seem to be maximal, and, hence, the use of fup-adjusted has overestimated its CLhin vivo. Therefore, more work is needed particularly for PER. This thesis shows that a generic approach to predict the CLh in vivo does not exist. Nevertheless, the choice of an IVIVE approach with satisfactory predictive performances is now possible. The results of this thesis contribute to: 1) better understand the impacts on the PK/TK parameters of extensive drug binding to ALB and AGP; 2) choose the best predictive approach to CLh based on the affinity of xenobiotic (drug or contaminant) to each of the plasma proteins and the mechanisms involved in the liver; and 3) predict accurately and with precision the output CLh of xenobiotics that bind to the two plasma proteins. These IVIVE approaches for CLh can certainly be integrated into physiologically based PK/TK models for xenobiotics to improve the prediction of their pharmacokinetics and to accelerate the drug development process.