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Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El uso excesivo de antimicrobianos, debido a la intensificación de los sistemas productivos, ha producido un aumento en la resistencia bacteriana. Debido a esto, diferentes organizaciones intergubernamentales han solicitado el uso racional de estos fármacos en estos sistemas productivos. El mal uso de antimicrobianos se observa en diversas patologías, dentro de las cuales se encuentra la mastitis clínica del ganado lechero, cuyo principal agente etiológico en la zona sur del país es Staphylococcus aureus, resistente a múltiples fármacos. Por este motivo se han estudiado nuevas alternativas terapéuticas, como Aloe vera, por su efecto antimicrobiano. Se evaluaron los efectos inhibitorios de liofilizados de geles de A. vera comercial y extraído de plantas nacionales, asociados a cloxacilina o ceftiofur frente a S. aureus ATCC 29213 mediante el Método de Macrodilución en Caldo. Se determinó su Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) mediante turbidez y se confirmó por UFC/mL y absorbancia. Los resultados obtenidos demostraron una disminución de un 87,5% y 75% en las CMI establecidas por el CLSI de ceftiofur y cloxacilina respectivamente. Estos resultados permitirían formular un tratamiento intramamario con esta asociación para las mastitis clínicas causadas por S. aureus. Esto disminuiría la posibilidad de generar resistencia, como también reduciría los periodos de carencia definidos actualmente para estos fármacos. / Proyecto Fondef IDeA 12I10008

Um Änderungen in seiner Umwelt wahrnehmen zu können, benötigt S. aureus unterschiedliche Signaltransduktionssysteme. In dieser Arbeit wurde erstmals die Eukaryoten-ähnliche Serin/Threonin-Proteinkinase (STPK) PknB umfassend charakterisiert. Die posttranslationale Proteinmodifikation mittels Phosphorylierung spielt sowohl in Eukaryoten als auch in Prokaryoten eine wichtige Rolle. Man glaubte lange, dass die Phosphorylierung von Serin-, Threonin- und Tyrosinresten ein nur auf Eukaryoten beschränkter Regulationsmechanismus ist. Dagegen wurde die Phosphorylierung an Histidin- und Aspartatresten durch die Zweikomponenten-Systeme allein den Prokaryoten zugeordnet. Die Genomanalysen der letzten Jahre identifizierten jedoch STPKs und Serin/Threonin-Proteinphosphatasen (STPP) in nahezu allen prokaryotischen Genomen. Auch S. aureus codiert für eine STPK, die eine hohe Homologie zu den beschriebenen STPKs aufweist. In dieser Arbeit wurden mittels Microarray-Analyse einer ΔpknB-Mutante im Stamm 8325 erste Hinweise zur Funktion von PknB als Regulator der Zellwandsynthese sowie zentraler Stoffwechselwege gewonnen. Es wurden mittels Phosphopreoteom-Analysen in vivo-Substrate identifiziert und weiterhin die Kinase biochemisch charakterisiert. / S. aureus needs effective signal transduction systems to be able to sense a changing environment. In this work we characterize for the first time the regulatory ser/thr protein kinase PknB. The posttranslational protein modification via phosphorylation plays an important role in eukaryotes as well as in prokaryotes. The phosphorylation of proteins on serine, threonine, and tyrosine residues was originally thought to be a mechanism of signal sensing and translation only restricted to eukaryotes. In contrast, prokaryotes were thought to achieve signal transduction exclusively via the phosphorylation of histidine and aspartate residues by using two-component systems. However, recent bacterial genome sequencing identified STPKs and STPPs in almost all bacterial genomes. S. aureus also encodes a STPK, which shows high similarity to the described STPKs. In this study the putative function of PknB as a regulator of cell wall-synthesis as well as central metabolic pathways was analysed by a competitive microarray approach. Furthermore, a phosphoproteome analysis was used to identify in vivo substrates and a biochemical characterization was performed.

Staphylococcus aureus reagiert auf veränderte Umweltbedingungen wie Hitze, pH und Chemikalien mit Hilfe globaler Regulatoren wie dem Sae (S. aureus exoprotein expression) Zweikomponenten-System. Subinhibitorische Konzentrationen einiger Antibiotika können die Expression von Virulenzfaktoren erhöhen. In dieser Arbeit wurde die Stressantwort von S. aureus auf subletale Konzentrationen des geläufigen Desinfektionsmittels Perform® untersucht. Dazu wurden biochemische Methoden wie SDS-PAGE und Massen-Spektrometrie sowie molekularbiologische Methoden wie qRT-PCR und Promotoraktivitäts-Assays eingesetzt. Davon abhängige, funktionelle Veränderungen wurden in durchfluss-zytometrischen Invasions-Assays analysiert. Perform wirkt durch die Bildung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS). Das Wachstum von S. aureus in Medien mit subletalen Konzentrationen von Perform verringerte in den Stämmen 6850, COL und ISP479C die Expression mehrerer Proteine, wohingegen im Stamm Newman eine gesteigerte Expression mehrerer Proteine festgestellt werden konnte. In der Literatur werden diese vermehrt exprimierten Proteine als sae-abhängig beschrieben. Der Effekt von Perform konnte durch das im Desinfektionsmittel enthaltene Detergenz SDS nachgeahmt werden, jedoch nicht durch Paraquat oder weitere Detergenzien wie Triton X-100 oder Tween 20. Eine Solubilisierungsreaktion durch die Detergenz-Wirkung konnte ausgeschlossen werden, da der beobachtete Effekt von lebenden Bakterien abhängt. Für Eap (extracellular adherence protein) konnte die deutlichste Steigerung der Proteinexpression festgestellt werden und eine Transkriptionsanalyse bestätigte die gesteigerte Eap-Expression. Die Promotoraktivität des sae Promotors P1 wurde sowohl durch Perform als auch durch SDS verstärkt. Die Anwesenheit von Perform und SDS hatte auch funktionelle Änderungen zur Folge: In durchflusszytometrischen Experimenten erhöhte sich beispielsweise die Invasivität auf das 2,5- bzw. 3,2-fache und die beobachteten Unterschiede konnten durch Lysostaphin Protektions Versuche bestätigt werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die gesteigerte Invasivität in Stamm Newman von Eap und dem sae-System abhängig war, während agr, sarA, sigB und FnBPs keinen entscheidenden Einfluss auf die Invasivität hatten. In dieser Arbeit wurde außerdem aufgedeckt, dass die Besonderheit des Stammes Newman durch eine Mutation in saeS (Sensor-Histidinkinase) bedingt war. Obwohl postuliert wird, dass diese Punktmutation ein konstitutiv aktiviertes sae System zur Folge hat, konnte die hohe sae Aktivität durch Perform und SDS jedoch noch weiter gesteigert werden. Durch den Austausch des gesamten sae-Operons konnte gezeigt werden, dass sich der Stamm Newman saeISP479C wie der Stamm ISP479C, und der Stamm ISP479C saeNewman sich analog zu Stamm Newman verhielt. Zusammenfassend kann aus den vorliegenden Ergebnissen geschlussfolgert werden, dass ein Aminosäurenaustausch in der Sensor-Histidinkinase SaeS des Stammes Newman verantwortlich für die gesteigerte Expression von Eap und die daraus resultierende gesteigerte Invasivität nach der Inkubation mit subletalen Konzentrationen von Perform und SDS ist. Diese Daten können dazu beitragen, die Virulenzmechanismen im Stamm Newman, speziell die Rolle des Sae-Systems, aber auch die der generellen Regulation, besser verstehen zu können. / Staphylococcus aureus copes with changing environmental conditions like heat, pH and chemicals by utilizing global regulators such as the Sae (S. aureus exoprotein expression) two-component signaling system. Subinhibitory concentrations of some antibiotics were shown to increase virulence factor expression. Here, we investigated the S. aureus stress response to sublethal concentrations of the commonly used biocide, Perform®. Therefore biochemical methods including SDS-PAGE and mass spectrometry as well as molecular biological methods like qRT-PCR and promoter activity assays, were used. Additionally, functional differences were analyzed by flow cytometric invasion assays. Perform, acting through the production of reactive oxygen species, generally downregulated the expression of extracellular proteins in strains 6850, COL, ISP479C, but upregulated these proteins in Newman. All upregulated proteins were sae-dependent. Whereas the Perform component SDS mimicked the biocide effect, paraquat or other detergents, as Triton X-100 or Tween 20 did not. A solubilisation by the detergents could be excluded due to the effect´s requirement of live bacteria. Eap (extracellular adherence protein) was most prominently augmented. Upregulation of eap was confirmed by qRT-PCR. Promoter activity of the sae promoter P1 was increased by Perform and SDS. Flow cytometric analysis revealed that both substances enhanced cellular invasiveness 2.5-fold and 3.2-fold, respectively, and the increased invasiveness could be validated by a lysostaphin protection assay. Furthermore, the increased invasiveness was dependent on Eap and the sae system, whereas agr, sarA, sigB and FnBPs had no major effect in strain Newman. This unique response pattern was due to a point mutation in SaeS, as demonstrated by allele swapping. Newman-saeSISP479C behaved like ISP479C, whereas saeSNewman rendered ISP479C equally responsive as Newman. The point mutation is said to lead to a constitutively active sae-system, but with Perform and SDS we were able to further enhance the already high sae-activity. Taken together, an amino acid-substitution in the sensor histidine kinase SaeS of strain Newman was shown to be responsible for the increased expression of Eap upon exposure to sublethal Perform and SDS concentrations, leading to increased Eap-dependent cellular invasiveness. These data may be important for a deeper understanding and further analyzing the virulence mechanism in strain Newman, especially the role of the sae-system but also the general regulation.

Bislang inhibieren antibakterielle Substanzen in erster Linie die Zellwandsynthese, den DNA- und RNA-Stoffwechsel sowie die Proteinsynthese. In dieser Arbeit wurde ein erster Versuch unternommen, neue Zielstrukturen für die Antibiotika-Therapie in S. aureus zu finden. Insgesamt wurden 10 Gene untersucht, die Funktion von 7 dieser Gene war in S. aureus unbekannt. Zunächst sollte herausgefunden werden, ob diese 10 Zielgene: topB, polA, nusG, SA1857, SA1444, SA1063, SA0453, SA0241, SA0245, SA0367, für S. aureus essentiell sind. Es wurde versucht, jedes dieser Gene in S. aureus zu deletieren. Außer den Genen SA1444, SA0245 und nusG konnten alle Zielgene deletiert werden und waren daher für S. aureus nicht essentiell. Die Deletionsmutanten ΔtopB, ΔpolA, ΔSA1857, ΔSA1063, ΔSA0453, ΔSA0241, ΔSA0367 wurden außerdem in einem Sepsismodell in Mäusen untersucht und waren nicht attenuiert. Gene, die weder in vitro noch in vivo essentiell sind, sind nur von geringem Interesse für die Entwicklung neuer Antibiotika. Zur Untersuchung essentieller Gene in S. aureus wurden vier verschiedene konditionale Expressionssystem untersucht. Bei drei dieser Systeme wurde der wildtypische Promotor gegen einen regulierbaren Promotor ausgetauscht. Bei einem weiteren System handelte es sich um einen Antisense-RNA-Ansatz. Zur Überprüfung der konditionalen Expressionssysteme („proof-of-principle“) wurden die bekannten essentiellen Gene ligA und dnaE in S. aureus mutiert. Eines dieser konditionalen Expressionssysteme, das pLL30/Pspac/pMJ8426-System, konnte erfolgreich in S. aureus angewandt werden. Die konditionale Expression von ligA und von SA0245 wurde mit diesem System erzielt. Der Temperatur-sensitive Shuttle-Vektor pLL30 dieses konditionalen Expressionssystems enthält eine Insertionskassette, die das Antibiotikaresistenzgen cat (Chloramphenicol-Acetyltransferase) sowie den regulierbaren Promotor Pspac enthält. Ein wesentliches Merkmal des pLL30/Pspac/pMJ8426-Systems ist die stabile Integration des Resistenzmarkers cat und des Pspac-Promotors durch ein doppeltes Crossover Ereignis vor dem Zielgen. Der Temperatur-sensitive Shuttle-Vektor pLL30 kann anschließend durch mehrfaches Subkultivieren der Bakterien bei nicht permissiver Temperatur eliminiert werden. Der Repressor LacI wird auf einem Extra-Plasmid pMJ8426 kodiert und wird nach erfolgter Integration des Pspac-Promotors vor dem Zielgen in die Bakterien transformiert. Mehrere Kopien des Repressorplasmids ermöglichen eine gute Repression an Pspac. Durch die Zugabe des Induktors IPTG kann der Repressor LacI inaktiviert und die Gen-Expression induziert werden. Insbesondere konnte dieses konditionale Expressionssystem erfolgreich im Tiermodell angewandt werden. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die genetische und funktionelle Charakterisierung von SA0367. Durch biochemische Untersuchungen wurde gezeigt, dass dieses Gen für eine FMN-enthaltende Oxidoreduktase codiert. Auf Grundlage der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur Funktion des Proteins wurde das Gen SA0367, in Analogie zum orthologen Gen nfrA aus B. subtilis, in nfrA umbenannt. Die Oxidoreduktase NfrA oxidiert NADPH in Gegenwart von FMN. In Gegenwart von NADPH und FMN zeigt das Enzym NfrA außerdem Nitroreduktase- und eine leichte Disulfidreduktase-Aktivität. Induktionsexperimente im Wildtyp zeigten, dass nfrA durch oxidativen Stress, verursacht von Diamide oder Nitrofurantoin, und durch Ethanol induziert wird. Ethanol und oxidativer Stress führt zu Denaturierung von Proteinen. NfrA könnte an der Reparatur geschädigter Proteine beteiligt sein. Die Induktion von nfrA in S. aureus erfolgt unabhängig vom alternativen Sigmafaktor SigB. Durch Primer Extension-Experimente wurde eine putative PerR-Box vor dem nfrA-Gen identifiziert. Diese könnte für die Regulation von nfrA wichtig sein. Außerdem wird nfrA während des gesamten Wachstumszyklus von einem SigAabhängigen Promotor exprimiert. Die Deletionsmutante ΔnfrA zeigt nur in Gegenwart hoher Ethanolkonzentrationen von 6,5 % einen leichten Wachstumsnachteil im Vergleich zum Wildtyp. Außerdem weist die ΔnfrA-Mutante eine höhere Resistenz gegenüber Nitrofurantoin auf. In weiteren Untersuchungen wurde begonnen die Funktion der Ser/Thr-Kinase SA1063 durch Microarray-Experimente aufzuklären. Hierbei wurde deutlich, dass dieses Gen eine regulatorische Rolle bei der Zellwandsynthese in S. aureus spielen könnte. / So far, antimicrobial substances inhibit primarily the synthesis of the cell wall, DNA- and RNA as well as the synthesis of proteins. In this work, alternative targets for antibiotictherapy in S. aureus were investigated. Consequently, altogether ten different genes were analysed, seven of these genes were of unknown function in S. aureus. The ten target genes chosen were: topB, polA, nusG, SA1857, SA1444, SA1063, SA0453, SA0241, SA0245 and SA0367. First, it should be discovered whether or not these target genes are essential for bacterial survival. Therefore, deletion strains of each of these genes were constructed in S. aureus. All of these genes, except of SA1444, SA0245 and nusG, could be deleted, and were thus non-essential in S. aureus. The deletion strains ΔtopB, ΔpolA, ΔSA1857, ΔSA1063, ΔSA0453, SA0241, ΔSA0367 were analysed in a sepsis model of infection in mice. These experiments turned out that none of those strains were attenuated in this model which suggests that the factors investigated are neither in vitro nor in vivo essential for bacterial survival and virulence. Therefore, the potential of these determinants to serve as a target for the development of new antibiotics is rather low. To examine essential genes in S. aureus, four different conditional expression systems were analysed. In three of these systems the promoter of the wildtype gene was exchanged by an experimentally controllable promoter. Another approach involved antisense-RNA to counteract the transcription of the target genes. To verify that the conditional expression systems are functional in S. aureus (“proof-of-principle”), we first mutated two known essential genes, namely ligA and dnaE. One of these conditional expression systems, the pLL30/Pspac/pMJ8426-System could be applied successfully in S. aureus. Conditional mutants of ligA and SA0245 were obtained with this system. The temperature-sensitive shuttle-vector pLL30 of this expression system contains a DNA cassette for insertion in front of the target gene. This insertion-cassette encodes the resistance marker cat (chloramphenicol-acetyltransferase) as well as the Pspac promoter. One important feature of the pLL30/Pspac/pMJ8426-system is the stable integration of the resistance gene cat and the Pspac promoter in front of the target gene by a double crossover event. Following the integration of the cat-Pspac-cassette the temperature-sensitive vector can be eliminated by successive sub-culturing of the bacteria at non-permissive temperature. The repressor LacI is encoded on the Plasmid pMJ8426 which is transformed into the bacteria after integration of the cat-Pspac-cassette in front of the target gene. Several copies of the repressor-plasmid pMJ8426 give rise to high amounts of the repressor LacI and should allow tight repression of the target gene. By addition of the inductor IPTG the repressor LacI is inactivated and gene expression is induced. This conditional expression system was also successfully applied in an animal model of infection. Thus, a validated in vivo expression system is now applicable for the investigation of putative target genes in vivo. Furthermore, in the present work SA0367 was genetically and functionally characterized. Biochemical assays of the gene product revealed that it encodes a FMN-containing oxidoreductase. Based on the findings of this work about the function of the protein, the gene SA0367 was named nfrA, in analogy to the orthologous gene nfrA from B. subtilis. The oxidoreductase NfrA oxidizes NADPH in the presence of FMN. In addition, the enzyme NfrA showed nitroreductase-activity and a minor disulfidreductase-activity in the presence of FMN and NADPH. Induction experiments in the wildtype showed that nfrA is induced by oxidative stress caused by diamide or nitrofurantoin and by ethanol. Ethanol and oxidative stress cause denaturation of proteins. Therefore, NfrA could be involved in the repair of damaged proteins. The induction of nfrA is independent of the alternative sigma-factor SigB. Primer-extension experiments revealed a putative PerR-Box in front of the nfrA-gene. This PerR-Box could be important for the regulation of the expression of nfrA. Moreover, nfrA is transcribed throughout the whole life cycle of S. aureus from a SigA-dependent promoter. Growth of the deletion strain ΔnfrA was slightly reduced in the presence of 6,5 % ethanol as compared to the wildtype. The ΔnfrA-mutant also shows a higher resistance towards nitrofurantoin. In addition, the function of the Ser/Thr-kinase SA1063 was investigated by DNAmicroarray- experiments. Several genes were differentially regulated when comparing transcription of the wildtype and its isogenic ΔSA1063-mutant. The results of these experiments implicate a regulatory role of that SA1063 in the cell wall synthesis in S. aureus.

Der Gram-positive Erreger Staphylococcus aureus ist ein Bestandteil der normalen Haut und Schleimhautflora des Menschen, kann aber auch ein weites Spektrum von Krankheitsbildern hervorrufen. Ein besonderes Charakteristikum dieses Pathogens besteht in der Expression von Oberflächenstrukturen, welche eine hohe Affinität für Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) von eukaryontischen Organismen aufweisen und die kollektiv als MSCRAMM (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) bezeichnet werden. Das auf der Bakterienoberfläche gebundene Fn kann in der Folge als eine Art molekulare Brücke zwischen FnBP exprimierenden S. aureus und dem Fn-Rezeptor auf der Wirtszellseite, dem Integrin 51, dienen. Neben der Anheftung an das Wirtsgewebe kann die indirekte Assoziation mit Integrin 51 die Aufnahme der Bakterien durch die eukaryontische Zelle auslösen. Wie die bakterielle Adhäsion an Integrin 51 und die Aggregation der Integrine durch die mit Fn-beschichteten Bakterien in ein Signal zur Aufnahme der Pathogene durch die Zelle umgesetzt wird, ist nicht vollständig geklärt und sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde ein neues und effektives Protokoll zur fluoreszenzmikroskopischen Differenzierung von extra- und intrazellulären Bakterien entwickelt. Diese Methode besitzt den Vorteil, von Bakterien-spezifischen Antikörpern unabhängig zu sein. Dadurch bietet sich die Möglichkeit, Bakterien, gegen die es noch keine spezifischen Antiseren gibt, dennoch auf ihre zelluläre Lokalisation und Invasivität mittels mikrobiologischer Methoden untersuchen zu können. Im Hinblick auf die nähere Untersuchung der Signaltransduktion bei der Invasion von S. aureus war die kritische Rolle von Tyrosinkinasen für die Integrin-vermittelte Invasion ein erster wichtiger Hinweis. Diese Befunde führten zu weiteren spezifischeren Untersuchungen, wobei eine wichtige Rolle für Kinasen der Src Familie gezeigt werden konnte. Ein weiterer Hinweis auf die Bedeutung der Src-Kinasen für die Internalisierung von S. aureus war ein dramatischer Rückgang der Aufnahmerate in Src/Yes/Fyn-defizienten Maus-Fibroblasten, verglichen mit Src-rekonstituierten Zellen. Auf biochemischer Ebene konnte eine deutliche Aktivierung der Src-Kinase nach einer Infektion mit S. aureus, nicht aber nach Infektion mit dem nicht-pathogenen S. carnosus festgestellt werden. Integrin-reiche fokale Kontakte (FK) sind angereichert mit Proteinen wie Talin, Vinculin, Paxillin, Tensin, -Actinin oder Zyxin sowie Signalenzymen wie der Fokalen Adhäsions Kinase (FAK) oder Kinasen der Src Familie. Die Protein Tyrosin Kinase (PTK) FAK ist nach Integrinstimulierung eines der Schlüsselenzyme in FK. Dies war der Anlass nach der Bedeutung von FAK für die Integrin-vermittelte Internalisierung von S. aureus zu fragen. Ebenfalls ein wichtiger Hinweis waren die starken Rekrutierungen von Markerproteinen von fokalen Komplexen zum Ort von zellgebunden S. aureus nicht aber von S. carnosus. Daraufhin wurde mittels dominant-negativer FAK-Mutanten und FAKdefizienter Mausfibroblasten der Einfluss von FAK für die Internalisierung von S. aureus untersucht. Bei beiden Versuchsansätzen konnte ein starker Rückgang der Aufnahme beobachtet werden. Zusammengefasst bestätigten diese Ergebnisse die essentielle Rolle von FAK für die Integrin vermittelte Aufnahme der pathogenen S. aureus. Bei der Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts spielen eine Reihe von Proteinen eine wichtige Rolle, darunter auch Cortactin. Cortactin ist ein bekanntes Substrat der Src-Kinasen und es lag nahe, nach einer funktionellen Verbindung von Src, FAK und Cortactin zu suchen. Dominant-negative Cortactin-Mutanten, die keine Assoziation mit dem Arp2/3 Komplex oder mit Dynamin aufweisen, oder welche die von Src-vermittelte Phosphorylierung am C-Terminus verhindern, blockierten die Aufnahme von S. aureus. Mikroskopisch konnte eine starke Rekrutierung von Cortactin zu zellgebundenen S. aureus beobachtet werden, jedoch wurde die Rekrutierung nicht von FAK beeinflusst. Die Phosphorylierung von Cortactin aufgrund S. aureus-Infektion war allerdings FAK- und Src-abhängig. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ine bisher unbeschriebene FAK/Src Cortactin Signalachse für die Regulation der Integrin-Internalisierung verantwortlich ist. Die detaillierten Untersuchungen der rezeptorvermittelten Aufnahme und der dabei induzierten Signaltransduktion in Wirtszellen gaben neue Erkenntnisse über die Pathogenitätsstrategien von S. aureus. Darüber hinaus ermöglichen diese Arbeiten neue Einblicke in die molekularen Vorgänge, welche die Internalisierung von Integrinen steuern. / The gram-positive bacterium S. aureus is part of the normal skin and mucosal flora of humans, but it can also give rise to a wide spectrum of infectious diseases. Virulence-associated features of this pathogen include surface structures that interact with extracellular matrix (ECM) proteins of eukaryotic organisms. These adhesins have been collectively termed MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules). Fibronectin (Fn) binding to bacterial FnBPs functions as a molecular bridge linking the pathogen to the principal cellular Fn receptor, the integrin 51. In addition to allowing adherence of the bacteria to the host cell surface, the clustering of integrins also leads to the internalization of the microorganisms. How the integrin engagement by the fibronectin-coated bacteria is transduced into the cell and how this signal initiates bacterial engulfment is poorly characterized. Therefore, the major aim of this work was to identify host components that regulate integrin-dependent internalization of pathogenic S. aureus. As a first step, a novel and elegant microscopic method for the evaluation of bacterial invasiveness into eukaryotic cells was developed. The protocol is based on differential fluorescent staining of extracellular and intracellular bacteria and allows quantification of bacterial invasiveness using a fluorescence microscope. The most important advance of this method is the fact, that the bacteria are covalently labeled and therefore, robust and invariant staining of the total bacterial population is achieved. In addition, the protocol does not rely on bacteria-specific antibodies making this the method of choice in case specific antisera against the pathogen are not available. Functional analysis of signaling pathways involved in the uptake process revealed an important role for protein tyrosine kinases (PTKs) during integrin-mediated internalisation of S. aureus. The important function of Src PTKs was further corroborated by the dramatic decrease of S. aureus uptake by Src/Yes/Fyn-deficient cells compared to Src-expressing cells. Biochemically, a significant activation of Src PTKs was observed in human epithelial cells in response to infection with S. aureus, whereas there was no activation after an infection with the non-pathogenic S. carnosus. Integrin-initiated focal contacts (FC) are enriched in specific marker proteins such as vinculin, paxillin, tensin, actinin, or zyxin as well as signaling enzymes including the focal adhesion kinase (FAK) or Src PTKs. In contrast to S. carnosus, contact of S. aureus with the eukaryotic host cell membrane resulted in strong recruitment of FC marker proteins to the site of adherent bacteria. To investigate the role of FAK for the internalization of S. aureus, dominantnegative FAK-mutants and FAK-deficient mouse cells were infected with the pathogen. In all cases, a major reduction in the number of internalized S. aureus was observed. Taken together these results demonstrated an essential role of FAK for the integrin-mediated uptake of S. aureus and suggested that an active FAK/Src complex regulates bacterial internalization via integrins. In a further approach, effectors of the FAK/Src complex and potential regulators of actin cytoskeleton dynamics during internalization of S. aureus were investigated. Biochemical analysis of infected cells revealed the actin-binding protein cortactin as a major tyrosine phosphorylated protein in response to pathogenic staphylococci. Furthermore, cortactin was recruited to the vicinity of cell-bound S. aureus, but not to S. carnosus. Various dominant-negative cortactin mutants that were either compromised in their association with the Arp2/3 complex or dynamin-2, or that lacked critical tyrosine phosphorylation sites in the C-terminal domain interfered with the uptake of S. aureus. As both FAK and cortactin are substrates of active Src kinases and both are responsive to integrin stimulation, it was hypothesized that there is a functional link between FAK, Src, and cortactin. Though the recruitment of cortacin to the vicinity of cell-bound S. aureus was not influenced by the presence of FAK, the phosphorylation status of cortactin after infection with S. aureus or after integrin stimulation by a fibronectin matrix was dependent on both FAK and Src. Together, these results reveal a novel FAK/Src-cortactin signalling axis regulating integrin internalisation. The detailed examination of the FnBP-triggered, integrin-mediated bacterial uptake offers new insight into the pathogenicity strategies of S. aureus and might open up novel avenues for therapeutic intervention. In addition, this work furthers our understanding of the molecular processes regulating the internalisation of integrins.

Staphylococcus aureus ist ein bedeutender opportunistischer Krankheitserreger, der eine Vielzahl von Infektionen in Menschen und Tieren hervorrufen kann. Das Krankheitsbild reicht von leichten Hautinfektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Endokarditis, Sepsis oder Pneumonien. S. aureus ist ein Haupterreger nosokomialer Infektionen. Besonders die Antibiotikaresistenzentwicklung von S. aureus–Stämmen ist problematisch. Als wirksame Antibiotika können zur Zeit oft nur noch Vancomycin, Synercid oder Linezolid zur Therapie eingesetzt werden. Die alarmierende Resistenzentwicklung in S. aureus verdeutlicht, dass die Entwicklung neuer Antibiotika und die Identifizierung neuer bakterieller Angriffsstrukturen dringend erforderlich ist. Gängige antiinfektive Therapeutika sind gegen die bakterielle Zellwandsynthese, den DNA- und RNA-Stoffwechsel oder die Proteinbiosynthese gerichtet. In dieser Arbeit sollten Virulenz-relevante Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Antibiotika untersucht werden. Insgesamt wurden sieben Gene analysiert, von denen vier zu Anfang dieser Arbeit in S. aureus noch nicht charakterisiert waren. Die Zielgene (clpP, purH, ssrA und smpB) in S. aureus sollten deletiert werden, um ihre Überlebensnotwendigkeit in vitro- und in vivo zu überprüfen. Eine Deletion gelang bei den Genen clpP und purH, die somit als nicht essenziell in S. aureus zu betrachten sind. Die bereits zuvor als nicht-essenziell charakterisierten Gene arlR, arlS und putP wurden deletiert und die Mutanten dclpP, darlR, darlS, dpurH und dputP wurden phänotypisch in Hinsicht auf ihren Einfluss auf die Pathogenität in S. aureus analysiert. Die differenzielle Genexpression der Mutanten dclpP und darlR wurde mit Hilfe von Microarray-Hybridisierungsexperimenten untersucht. Die ∆clpP-Mutante zeigte einen starken Wachstumsdefekt bei verschiedenen Temperaturen (30, 37, 42°C) und war nicht mehr in der Lage bei 20°C zu wachsen. Ebenso war das Wachstum unter anaeroben Bedingungen stark beeinträchtigt. Der Stamm dclpP wies eine verringerte hämolytische Aktivität sowie eine verminderte Adhärenz an Polystyren auf. Außerdem konnte eine stark erhöhte autolytische Aktivität in einem Triton X-100-Assay beobachtet werden. In einem Invasions-Zellkulturassay mit 293T-Epithelzellen konnte eine ~10-fach erhöhte Invasivität im Vergleich zu dem isogenen Wildtyp festgestellt werden. Die Komplementierung der ∆clpP-Mutante durch Einführung eines clpP-Expressionsvektors führte nahezu bei allen getesteten Bedingungen zur Wiederherstellung des wildtypischen Phänotyps. Die Transkriptomanalyse der dclpP-Mutante ergab eine deutliche Veränderung in der Genexpression (15 % aller Gene). Eine computerunterstützte Analyse der Upstreambereiche der deregulierten Gene führte zu der Identifizierung verschiedener Regulons, die bei der bakteriellen Antwort auf verschiedene Stressbedingungen eine Rolle spielen. Die clpP-Deletion betrifft besonders Regulatoren, deren Aktivität in Abhängigkeit zu veränderten Redox-Bedingungen reguliert wird, wie z. B. verschiedenen Stressbedingungen und Anaerobiose. Die Konstruktion der darlR- und darlS-Mutanten führte zu einer gesteigerten hämolytischen Aktivität, einer erhöhten Adhärenz an Polystyren sowie einer erhöhten autolytischen Aktivität in Triton X-100-Assays. Die Internalisierungsrate durch 293T-Epithelzellen war vermindert. Die darlR-Mutante wurde in einem Katheter-assoziierten Infektionsmodell in Ratten eingesetzt. Die kompetitive Infektion mit Mutante und Wildtyp ergab einen deutlichen Nachteil bei der Etablierung einer Infektion durch die Mutante. Die Transkriptomanalyse der 8325darlR-Mutante in der exponenziellen und in der stationären Phase unterstreicht den großen Einfluss des ArlRS-Zwei-Komponenten-Systems auf die Regulation der Genexpression in S. aureus. In der exponenziellen Phase wurden insgesamt 5 % und in der stationären Phase 15 % der Gene differenziell exprimiert. dpurH- und dputP-Mutanten wiesen in vitro keine Veränderungen im Wachstums-verhalten, der Biofilmbildung oder hämolytischen Aktivität auf. In einem Infektionsmodell in Ratten führte die Deletion von purH in dem S. aureus-Stamm MA12 zu einer signifikanten Verminderung der Virulenz. Die Herstellung von smpB- und ssrA-Deletionsmutanten verlief ohne Erfolg. Es wurde versucht, einen direkten Nachweis für den essenziellen Charakter dieser Gene durch den Einsatz konditional letaler Expressionssysteme zu erbringen. Weder der Austausch des wildtypischen durch einen regulierbaren Promotor noch eine Antisense-RNA-Strategie war für eine eindeutige Klärung dieser Frage ausreichend. Es konnte durch diese Arbeit jedoch gezeigt werden, dass die Antisense-RNA-Strategie eine Beeinträchtigung des Wachstums von S. aureus bewirkt. / Staphylococcus aureus is an important opportunistic pathogen that can cause a wide range of diseases in humans and animals. The outcome of an infection can range from mild skin infections to life-threatening infections, like endocarditis, bacteraemia and pneumonia. Currently, methicillin-resistant S. aureus strains (MRSA) that have acquired numerous additional resistances towards several antibiotics have established in the hospital-setting. Therefore, the treatment of hospital-acquired infections with S. aureus in a rising number of patients is becoming increasingly complicated. The remaining effective antibiotics to treat infections with multi-resistant MRSA are vancomycin, synercid, and linezolid. However, MRSA isolates with intermediate and high resistance towards vancomycin have been described recently, as well as synercid- and linezolid-resistant strains. The emergence and spreading of multi-resistant S. aureus is alarming and emphasises the need to develop new antibiotics. Currently, well-established therapeutics targeting processes of cell wall biosynthesis, DNA and RNA metabolism, and protein biosynthesis. This study comprises the investigation of putative targets of novel antibiotics. Therefore, seven target genes were selected and functionally characterised in vitro and in vivo. Four of these genes have not been characterised in S. aureus at the beginnig of this study. A deletion mutagenesis approach for these genes (clpP, purH, ssrA and smpB) should provide an indication of their essientiallity for the organism. clpP and purH could be successfully inactivated, supporting their non-essential role in S. aureus. The non-essential genes arlR, arlS and putP were inactivated and different phenotypic studies of the S. aureus deletion mutants ∆clpP, ∆arlR, ∆arlS, ∆purH and ∆putP were performed. Whole genome microarray analysis was applied on ∆clpP and ∆arlR mutants to study the manifold transcriptional changes by the inactivation of these two regulators in S. aureus. The growth rate of ∆clpP was strongly reduced at different temperatures (30°C, 37°C, 42°C) and completely inhibited at 20°C. Growth was highly impaired under anaerobic conditions. Moreover, ClpP deficiency resulted in a reduced hemolytic activity and diminished adherence to polystyren as well as a strongly enhanced autolytic activity. The invasiveness of ∆clpP was significantly elevated (~10-fold) compared to the isogenic wildtype as shown in an invasion assay with the 293T epithelial cell line. All these effects could be successfully reverted by complementation of the mutant strain with a vector expressing the native clpP sequence. The microarray analysis of ∆clpP revaeled a strong shift of the bacterial transcriptome (15 % of all genes were differentially regulated). Especially regulators and genes which reply to varying redox conditions, for example as a result of different stresses or anaerobiosis, were shown to be affected at the transcriptional level. Deletion mutants of the virulence-associated two component system genes arlR and arlS caused a higher hemolytical activity, enhanced adherence to polystyrene and an enhanced autolytic activity in a Triton X-100 assay. Furthermore, internalisation of arlRS bacteria by 293T epithelial cells was diminished, and ∆arlR was significantly less infectious than the wildtype in a catheter-related infection model in rats. The microarray analysis of ∆arlR in the exponential and stationary growth phase revealed a strong influence of the ArlRS-system on gene expression in S. aureus. In the exponential phase a total of 5 %, and in the stationary phase 15 % of all genes were differentially regulated. ∆purH and ∆putP showed no alterations of growth, biofilm formation or hemolytic properties compared to the wild type strain. Inactivation of purH, however, caused a significant attenuation of S. aureus MA12 in a rat-infection model. Since the construction of ssrA and smpB deletion mutants have failed, conditional lethal expression systems should be utilised to address the question of essentiality of these genes. It could be shown by this study that neither the genetic exchange of the wildtype promoter with an in vitro adjustable promoter nor an antisense RNA-based approach were sufficient to clearify the status of ssrA and smpB as essential genes in S. aureus. Importantly, the expression of antisense RNAs for both genes resulted in a growth defect of S. aureus

MMed (Clinical Microbiology), Faculty of Health Sciences, University of the Witwatersrand, 2009 / Introduction: The clinical laboratory is required to rapidly identify Staphylococcus aureus as a cause of bacteraemia, and in particular, to detect methicillin resistance amongst bacteraemic isolates, to facilitate prompt initiation of appropriate therapy which may directly impact on patient survival, and to allow for implementation of appropriate infection control measures. Hence, the laboratory needs to choose tests to detect methicillin-resistant S. aureus (MRSA) bacteraemia which are rapid, accurate, simple, cost-effective and appropriate for the setting. Primary study objective: To determine the accuracy of four phenotypic susceptibility tests to directly detect MRSA from blood culture specimens (BC) compared with detection of the mecA gene by the polymerase chain reaction (PCR) from S. aureus cultured from the same BC. Materials and Methods: BCs were selected from patients with incident, S. aureus bacteraemic episodes at two hospitals, during January and February 2006. S. aureus was identified by standard phenotypic tests, including the presence of a deoxyribonuclease (DNAse). Direct susceptibility tests (DST) were performed (oxacillin (1μg) and cefoxitin (30μg) disk diffusion (DD), oxacillin Etest® (AB bioMérieux) and CHROMagar®-MRSA (CHROMagar® Microbiology)), and repeated on stored cultures. Detection of nuc and mecA genes by PCR confirmed S. aureus and methicillin resistance respectively. The sensitivity and specificity of the DST were calculated with reference to the mecA PCR result, to fulfil the primary study objective. Results: During the two-month study period, 9,400 BC were submitted to the clinical laboratories at the 2 hospitals; S. aureus was isolated from 156 specimens. Of these, 89 BC from 89 incident cases were included in the study, and 65 were subjected to all tests, including PCR. Of the 65 nuc-positive S. aureus isolates from 65 BC, all were positive with the direct DNAse test, and 25 (38%) were mecA positive. Compared to PCR, sensitivity and specificity for the direct oxacillin DD, cefoxitin DD, oxacillin Etest® and CHROMagar®- MRSA was 100% and 90%, 98% and 100%, 100% and 100%, and 96% and 42% respectively. Discussion: In this study, we found that, compared to PCR for the nuc and mecA genes, the combination of a direct DNAse test and oxacillin Etest®, facilitated accurate detection of MRSA bacteraemia. The direct oxacillin Etest® result did not appear to be influenced by a non-standardised inoculum, in contrast to the other direct tests, and provided an oxacillin minimum inhibitory concentration. The direct cefoxitin DD test produced more accurate results than the direct oxacillin DD test, was easier to read and distinguished MRSA from MSSA with zone diameters clustering into more clearly defined susceptibility categories. Although the chromogenic agar performed well when used to identify methicillin resistance amongst cultured S. aureus isolates, it was apparent that this test, read at 24 hours, could not be used reliably as a DST. Since the Etest® is more costly than the DD test; its use should be reserved for BC from patients in “high-risk” hospital areas, e.g. intensive care units. The direct cefoxitin DD could be used for all BC positive for GPCC, and could be used without a direct identification test because of its lower cost; it is further recommended that the direct cefoxitin DD test replace the direct oxacillin test.

Séculos de relatos históricos dedicados à reverência por distintas civilizações emergem dos últimos 25 anos de estudos científicos sobre abelhas sem ferrão, espécies nativas eusociais de habitat tropical e subtropical, em contraste com a extensão das pesquisas voltadas aos atributos comerciais de Apis mellifera. Diferenças das abelhas melíferas incluem arquiteturas de ninhos peculiares, contendo a estrutura comum em cera e resinas vegetais, reforçadas com amálgamas de pólen, sementes ou so lo para produzir o geoprópolis, que compartilha a mesma atividade prevalente de própolis contra bactérias gram- positivas, atribuível a derivados terpênicos. O trabalho teve como objetivo empregar um esquema de técnicas aplicadas ao fracionamento bioguiado, para obtenção de compostos ativos contra Staphylococcus aureus de geoprópolis da abelha sem ferrão Melipona scutellaris. Entre os extratos etanólicos de seis lotes de geoprópolis coletados, aleatoriamente, de um meliponário da Bahia durante um ano, a variedade “marrom-escura” destacou-se pelo poder antiestafilocócico com a mesma atividade apresentada por sua fração acetato de etila (C IM 62,5-31,25 µg/mL), a qual revelou 6 compostos-alvo através da bioautografia, na medida em que conservou o perfil cromatográfico por CLAE-FR-DAD durante a etapa de purificação, motivando o fracionamento do extrato por cromatografia em coluna de sílica, que levou, em vista da baixa eficiência de separação verificada para a fração F1 selecionada (C IM 1,95- 0,98 μg/mL), às sub-frações SF2 (3,90-1,95 µg/mL) e SF3 (7,81-3,90 µg/mL) por CLAE-FR-DAD semi-preparativa. Apesar da resistência ao isolamento, os perfis de fragmentação dos compostos em frações, sub-frações e extratos de geoprópolis, determinados por CLAE-FR-ESI-TQ-EMn, revelaram componentes intimamente relacionados à estrutura comum de um núcleo diterpênico ligado a um resíduo de ácido cinâmico, coerente com as varreduras espectrais no UV homólogas e ao espectro de 1H-RMN da fração F2 (7,81-3,90 µg/mL), relativamente mais purificada. Amostras de geoprópolis consistiram, ao contrário, na variabilidade dos espectros de massas, ressaltando características das abelhas nativas, ao mimetizar as Apis mellifera, quanto aos comportamentos de coleta heterogêneos relacionados às fontes de resi nas disponíveis. Ensaios antibacterianos envolvendo bioautografias e determinações da concentração inibitória/bactericida mínima (CIM/CBM) por microdiluição e revelação com resazuri na biomonitoraram as etapas do fracionamento, enquanto triagens por CIM/CBM comporam o perfil antimicrobiano do extrato “marrom-escuro” e seus derivados mais ativos contra S. aureus, em que um painel de linhagens bacterianas patogênicas padronizadas delineou espécies gram- positivas, em especial de Micrococcus, Bacillus e Staphylococcus, inclusive MRSA, como altamente susceptíveis, em detrimento das gram-negativas, demonstrando o potencial promissor de geoprópolis como repositório de produtos naturais indeléveis aos desafios precursores de fármacos na terapêutica. / Long historical records of reverence by distinct ci vilizations emerge from the last 25 years of scientific studies on stingless bees, native eusocial species inhabiting the tropical and subtropical areas of the world, over extensive documentation devoted to the globally widespread Apis mellifera. Differences from the honeybees include peculiar nest strengthened arquictetures built in beeswax and plant resi ns, amalgamated with pollen, seeds or soil material to produce geopropolis, compositionally dissociated of traditional propolis, even sharing a prevailing activity against gram-positi ve bacteria, attributable to terpenic derivatives. A bioassay-guided fractionation technique was aimed to separate active compounds against Staphylococcus aureus in geopropolis from Melipona scutellaris, concerni ng its potential biological relevance. Among the ethanolic extracts of the six lots of geopropolis ramdomly collected from a meliponary settled in the Bahia State of Brazil, during a year, the “dark-brown” variety was highlighted by the same antistaphylococcal acti vity of ethyl acetate fraction (MIC 62,5-31,25µg/mL), which unveiled at least si x target compounds from bioautography in the purification step, even because their chromatographic profiles by RP-HPLC-PDA remained equivalent to the original extract, motivating its chromatographic fractionation by Low-Pressure Silica Gel Column Chromatography, followed by preparative RP-HPLC-PDA of the poorly resolved fraction F1 (MIC 1,95 – 0,98 μg/mL), yelding sub-fractions SF2 (3,90- 1,95 µg/mL) and SF3 (7,81-3,90 µg/mL). Although escaping from the isolation purpose, the fragmentation profiles of compounds in fractions, sub-fractions and extracts, determined by RP-HPLC-ESI-TQ-MSn, allowed propositions of components closely related to the structure of a diterpenic core bonded to a cinnamic acid group, consistent with the homologous UV spectral scans, associated to the 1H-NMR spectra of fraction F2 (7,81-3,90 µg/mL), relatively the most purified one available. Differing extracts consisted, in contrast, of the variability of mass spectra, suggesting mimics of Apis mellifera heterogeneous collecting behavior in the choice for resin sources by native bees. Antibacterial assays involving bioautography and resazurin microtitre plate-based minimum inhibitory, followed by bactericidal, concentrations (MIC/MBC) methods conducted the fractionation process, whilst the screening by MIC/MBC composed the antimicrobial profile of “dark brown” extract and its most active derivatives against S. aureus, displaying a panel of standardized human pathogenic bacterial strains, recongni zed as highly susceptible gram-positive species, in particular Micrococcus, Bacillus and Staphylococcus, includi ng the selected MRSA isolate, over the gram-negative ones, demonstrating the promising potential of geopropolis as a repository of natural products candidates to the challenges of drugs development in the course of health claims. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES