The effect of the new peptolide LY146032 (LY) was studied in a hamster model of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) pneumonia. In vivo, after infection with one of two well-encapsulated strains of MRSA, A83 and A116 (type 8 and type 5), LY was protective only in A116 pneumonia. An in vitro assay of the effect of subinhibitory concentrations of LY on opsonophagocytic killing by pulmonary phagocytes demonstrated marked enhancement of killing of A116 (92.6 and 63.8% kill with 1/10 MIC and 1/50 MIC LY; no kill in the absence of LY). This effect was dependent on the presence of fresh serum. LY in subinhibitory concentrations produces a surface effect that may allow complement binding and activation and subsequent phagocytosis and killing to take place. The opsonizing effect of subinhibitory concentrations of LY was not demonstrable for the A83 strain. Differences in capsular types may be determinants of response to therapy of MRSA infections.

Background This study assessed the impact of infectious diseases consultation (IDC) on 30-day readmission rates in patients with Staphylococcus aureus bacteremia (SAB). Furthermore, this study also evaluated the effect of IDC on adherence to guideline-directed therapy. Methods This retrospective cohort study enrolled 149 adult patients with SAB. Cohort 1 included 28 patients without IDC. Cohort 2 included 121 patients with IDC. Primary end point was all-cause 30-day readmission rates. Secondary outcomes included adherence to guideline-directed therapy and hospital length of stay (LOS). Guideline-directed therapy included repeat blood cultures until blood sterility, assessment for an echocardiogram, and appropriateness of antimicrobial therapy (including antibiotic, dose, and duration). Results Readmission rates were 46.4% (13/28) without IDC and 19% (23/121) with IDC (P = 0.006). Guideline-directed therapy occurred in 21.4% (6/28) without IDC versus 96.7% (117/121) with IDC (P = 0.0001). The average LOS was shorter without IDC than with IDC (5.6 vs 7.8 days, respectively; P = 0.01). The most common reasons for lack of guideline adherence in the control group were lack of echocardiogram (72.4%) and lack of repeat blood cultures (51.7%). Multivariate analysis demonstrated that only lack of IDC significantly affected readmission rates (odds ratio, 3.51; 95% confidence interval, 1.48-8.52; P = 0.0048). Conclusions Consultation with infectious diseases reduces 30-day readmission rates in patients with SAB and increases adherence to guideline-directed therapy; however, LOS was increased. Infectious diseases consultation should be considered for all patients with SAB.

Methionine is the first amino acid of every newly synthesised protein. In combination with its role as precursor for the vital methyl-group donor S-adenosylmethionine, methionine is essential for every living cell. The opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is capable of synthesising methionine de novo, when it becomes scarce in the environment. All genes required for the de novo biosynthesis are encoded by the metICFE-mdh operon, except for metX. Expression is controlled by a hierarchical network with a methionyl-tRNA-specific T-box riboswitch (MET-TBRS) as centrepiece, that is also referred to as met leader (RNA). T-box riboswitches (TBRS) are regulatory RNA elements located in the 5’-untranslated region (5’-UTR) of genes. The effector molecule of T-box riboswitches is uncharged cognate tRNA. The prevailing mechanism of action is premature termination of transcription of the nascent RNA in the absence of the effector (i.e. uncharged cognate tRNA) due to formation of a hairpin structure, the Terminator stem. In presence of the effector, a transient stabilisation of the alternative structure, the Antiterminator, enables transcription of the downstream genes (‘read-through’). Albeit, after the read-through the thermodynamically more stable Terminator eventually forms. The Terminator and the Antiterminator are two mutually exclusive structures. Previous work of the research group showed that in staphylococci the MET-TBRS ensures strictly methionine-dependent control of met operon expression. Uncharged methionyl-tRNA that activates the system is only present in sufficient amounts under methionine-deprived conditions. In contrast to other bacterial TBRS, the staphylococcal MET-TBRS has some characteristic features regarding its length and predicted secondary structure whose relevance for the function are yet unkown. Aim of the present thesis was to experimentally determine the structure of the met leader RNA and to investigate the stability of the met operon-specific transcripts in the context of methionine biosynthesis control. Furthermore, the yet unknown function of the mdh gene within the met operon was to be determined. In the context of this thesis, the secondary structure of the met leader was determined employing in-line probing. The structural analysis revealed the presence of almost all highly conserved T-box riboswitch structural characteristics. Furthermore, three additional stems, absent in all T-box riboswitches analysed to date, could be identified. Particularly remarkable is the above average length of the Terminator stem which renders it a potential target of the double-strand-specific endoribonuclease III (RNase III). The RNase III-dependent cleavage of the met leader could be experimentally verified by the use of suitable mutants. Moreover, the exact cleavage site within the Terminator was determined. The unusual immediate separation of the met leader from the met operon mRNA via the RNase III cleavage within the Terminator stem induces the rapid degradation of the met leader RNA and, most likely, that of the 5’-region of the met mRNA. The met mRNA is degraded from its 5’-end by the exoribonuclease RNase J. The stability of the met mRNA was found to vary over the length of the transcript with an instable 5’-end (metI and metC) and a longer half-life towards the 3’-end (metE and mdh). The varying transcript stability is reflected by differences in the available cellular protein levels. The obtained data suggest that programmed mRNA degradation is another level of regulation in the complex network of staphylococcal de novo methionine biosynthesis control. In addition, the MET-TBRS was studied with regard to a future use as a drug target for novel antimicrobial agents. To this end, effects of a dysregulated methionine biosynthesis on bacterial growth and survival were investigated in met leader mutants that either caused permanent transcription of the met operon (‘ON’) or prevented operon transcription (‘OFF’), irrespective of the methionine status in the cell. Methionine deprivation turned out to be a strong selection pressure, as ‘OFF’ mutants acquired adaptive mutations within the met leader to restore met operon expression that subsequently re-enabled growth. The second part of the thesis was dedicated to the characterisation of the Mdh protein that is encoded by the last gene of the met operon and whose function is unknown yet. At first, co-transcription and -expression with the met operon could be demonstrated. Next, the Mdh protein was overexpressed and purified and the crystal structure of Mdh was solved to high resolution by the Kisker research group (Rudolf-Virchow-Zentrum Würzburg). Analysis of the structure revealed the amino acid residues crucial for catalytic activity, and zinc was identified as a co-factor of Mdh. Also, Mdh was shown to exist as a dimer. However, identification of the Mdh substrate was, in the context of this thesis, (still) unsuccessful. Nevertheless, interactions of Mdh with enzymes of the met operon could be demonstrated by employing the bacterial two-hybrid system. This fact and the high conservation of mdh/Mdh on nucleotide and amino acid level among numerous staphylococcal species suggests an important role of Mdh within the methionine metabolism that should be a worthwhile subject of future research. / Methionin ist die erste Aminosäure in jedem neu gebildeten Protein. Zusammen mit seiner Funktion als Vorläufermolekül für die Synthese des essenziellen Methylgruppendonors S-Adenosylmethionin ist Methionin damit für jede lebende Zelle unverzichtbar. Staphylococcus aureus, ein opportunistisches Humanpathogen, ist in der Lage, Methionin de novo zu synthetisieren, wenn es nicht in ausreichender Menge in der Umgebung vorhanden ist. Mit Ausnahme von MetX sind alle für die Methioninsynthese benötigten Enzyme im metICFE-mdh-Operon kodiert. Die Expression des Operons wird durch ein komplexes hierarchisches Netzwerk reguliert, dessen zentrales Steuerelement ein Methionyl-tRNA-spezifischer T-Box-Riboswitch (MET-TBRS) ist, der auch als met-leader (RNA) bezeichnet wird. T-Box Riboswitches (TBRS) sind regulatorische RNA-Elemente, die in der untranslatierten Region am 5'-Ende (5'-UTR) ihrer zu kontrollierenden Gene liegen. Sie nutzen unbeladene tRNAs als Effektormoleküle. Die Funktionsweise der meisten TBRS beruht auf dem vorzeitigen Abbruch der Transkription der naszierenden mRNA, der durch die Ausbildung einer Haarnadelstruktur (Terminator) im Transkript herbeigeführt wird, wenn das Effektormolekül (i.e. unbeladene tRNA) fehlt. Sobald passende unbeladene tRNA verfügbar ist und bindet, wird eine alternative Struktur, der Antiterminator, kurzzeitig stabilisiert, der die Transkription und damit ein "Durchlesen" in die stromabwärtsliegenden Gene ermöglicht. Terminator und Antiterminator sind zwei sich gegenseitig ausschließende Strukturen, wobei der Terminator die thermodynamisch deutlich stabilere Struktur des TBRS ist, die sich dementsprechend auch in den vollständigen Transkripten erneut ausbildet. Bisherige Vorarbeiten der Arbeitsgruppe zeigten, dass in Staphylokokken der MET-TBRS die Kontrolle der Methioninsynthese in strikter Abhängigkeit von Methionin gewährleistet. Unbeladene Methionyl-tRNA, die nur unter Methioninmangelbedingungen in ausreichenden Konzentrationen vorliegt, aktiviert das System. Im Unterschied zu anderen bakteriellen TBRS weist der Staphylokokken-MET-TBRS (met-leader) hinsichtlich seiner Länge und vorhergesagten Struktur einige Besonderheiten auf, deren Bedeutung für die Funktion bislang unklar sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Struktur der met-leader-RNA experimentell zu bestimmen und die Stabilität met-Operon-spezifischer Transkripte im Kontext der Methioninbiosynthesekontrolle zu untersuchen. Ebenso sollte die bisher unbekannte Funktion des mdh-Genes im Operon aufgeklärt werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Sekundärstruktur der met-leader-RNA mit Hilfe des so genannten In-line Probings bestimmt. Die Sekundärstruktur weist neben fast allen hochkonservierten Strukturmerkmalen eines T-Box-Riboswitches auch drei zusätzliche Haarnadelstrukturen auf, die bisher in keinem anderen T-Box-Riboswitch gefunden wurden. Besonders auffällig ist die überdurchschnittliche Länge des met-leader-Terminators, der dadurch zur potentiellen Zielstruktur für die Doppelstrang-spezifische Endoribonuklease RNase III wird. Mittels geeigneter Mutanten konnte die RNase III-abhängige Prozessierung der met-leader-RNA experimentell bewiesen werden. Ebenso wurde die exakte Schnittstelle im Terminator bestimmt. Die ungewöhnliche Prozessierung des Terminators durch die RNase III spaltet die met-leader-RNA von der met-mRNA ab, was den raschen weiteren Abbau der met-leader-RNA und sehr wahrscheinlich auch den der met-mRNA einleitet. So wird die met-mRNA durch die Exoribonuklease RNase J vom 5'-Ende her abgebaut, wobei die Stabilität bezogen auf die Gesamtheit des Moleküls stark variiert: Das 5'-Ende mit den Genen metI und metC wird äußerst schnell degradiert, während das 3'-Ende mit metE und mdh deutlich stabiler ist. Die variierende mRNA-Stabilität spiegelt sich auch in Unterschieden hinsichtlich der verfügbaren zellulären Proteinmengen wider. Die Daten legen daher nahe, dass programmierte mRNA-Degradation eine weitere Ebene im komplexen Kontrollnetzwerk darstellt, durch die in Staphylokokken die Methioninbiosynthese sehr exakt den jeweiligen Bedürfnissen angepasst wird. Des Weiteren wurde der MET-TBRS im Hinblick auf eine zukünftige Nutzung als Angriffspunkt für neue antibakterielle Wirkstoffe untersucht. Dazu wurden die Auswirkungen einer dysregulierten Methioninbiosynthese auf das bakterielle Wachstum und Überleben mit Hilfe von met-leader-Mutanten analysiert, die entweder zu einer permanenten Aktivierung („ON“) oder Deaktivierung („OFF“) der met-Operon-Transkription, unabhängig vom Methioninstatus in der Zelle, führten. Es zeigte sich, dass Methioninmangel einen starken Selektionsdruck darstellt, da die „OFF“-Mutanten in der Lage waren, durch den Erwerb von adaptiven Mutationen innerhalb der met-leader-Sequenz, das met-Operon erneut zu aktivieren und wieder zu wachsen. Der zweite Teil dieser Arbeit widmete sich der Charakterisierung des Mdh-Proteins, das im letzten Gen des met-Operons kodiert ist und dessen Funktion derzeit gänzlich unbekannt ist. Zunächst konnte die Kotranskription und -expression von mdh mit dem met-Operon gezeigt werden. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Kisker (Rudolf-Virchow-Zentrum Würzburg) wurden anhand von Kristallstrukturanalysen die Aminosäuren identifiziert, die entscheidend für die katalytische Aktivität des Mdh-Enzyms sind, wobei Zink als ein Kofaktor fungiert. Ebenso zeigte sich, dass Mdh als Dimer vorliegt. Allerdings ist die Identifizierung des Mdh-Substrates im Rahmen dieser Arbeit (noch) nicht gelungen. Mittels eines bakteriellen Zwei-Hybridsystems wurde jedoch nachgewiesen, dass Mdh mit den anderen Enzymen des met-Operons interagiert. Dies und die hohe Konservierung von mdh/Mdh auf Nukleotid- und Aminosäureebene in verschiedenen Staphylokokkenarten legt eine wichtige Funktion von Mdh im Methioninstoffwechsel nahe, die lohnenswerter Gegendstand weiterer Untersuchungen sein sollte.

The genus Staphylococcus is a member of the family Micrococcaceae which includes three other general Micrococcus, Planococcus and Aerococcus. The four which have the same morphology and gram reaction may be distinguished from each other on the basis of arrangement, the utilization of glucose, the presence or abscence of cytochromes, oxygen requirements, motility and the G + C content of DNA. (Table I), The genus Staphylococcus includes three species; S. aureus, S. epidermidis and S. saprophyticus. These may be distinguished from each other on the basis of coagulase production, mannitol utilization, production of alpha toxin, presence of heat resistant endonucleases, requirement of biotin for growth, sensitivity to novobiocin and cell wall composition (Table II). In the early studies involving phages types and antibiotic susceptibilities, dilution methods (MIC) were used to determine susceptibility. With the adoption of the Kirby-Bauer technique, its wide clinical use, and the dynamic changes occurring in the staphylococci with respect to antibiotic susceptibility and phage patterns. Reexamination of these relationships becomes important and essential. Since no studies of this kind have ever been attempted on staphylococci from this community, it was decided to investigate the problem with respect to enzymatic activity, antibiogram and phage type and compare the findings with those from other geographic locations.

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En milieu hospitalier, des mesures de prévention et contrôle des infections sont mises en place. Dans le cas du SARM, l'isolement sur une unité dédiée où les patients ne sont pas confinés à leur chambre semble bénéfique. Une étude qualitative d'inspiration naturaliste a été réalisée afin de décrire l'effet de l'acquisition de la bactérie SARM et de l'isolement sur une unité dédiée. Les résultats ont mis en évidence que l'unité dédiée, par son mode de fonctionnement, n'entraine pas les effets négatifs attendus et décrits dans la littérature. Ces conclusions guident le choix d'interventions cliniques et structurelles permettant de limiter les effets de l'isolement relié à la colonisation par une bactérie dont l'acquisition est avant tout nosocomiale. Ainsi, les milieux de soins pourront, en contrepartie, offrir un milieu de soins moins contraignant à cette clientèle.

Staphylococcal scalded skin syndrome (SSSS) is a life-threatening skin condition caused by Staphylococcus aureus (SA) strains producing exfoliative toxin. Most SSSS cases are associated with Exfoliative Toxin A, encoded by the eta gene and carried by a temperate bacteriophage phiETA (ΦETA). An estimated ~10% of strains containing ΦETA are methicillin-resistant SA (MRSA), raising questions about the factors associated with ΦETA susceptibility. Our study investigates the lysogenization susceptibility of ΦETA in a set of SA strains through lysogenic challenges. To this end, we first isolate phage lysates from a known epidemic strain containing eta. In lysogenic challenge assays, we demonstrate that MRSA strains are resistant to ΦETA acquisition. All the 4/89 (4.5%) strains that were successfully lysogenized with ΦETA were characterized as methicillin-susceptible SA (MSSA). While lysogenic conversion did not modify other phenotypic markers, it increased the biofilm production, indicating potential fitness advantages conferred by ΦETA lysogenization. We also hypothesized that phage sequences in challenged strains may provide immunity against ΦETA, thus prophage presence and diversity may correlate with ΦETA susceptibility. Among the 89 strains tested, we bioinformatically identified that 54 of them contained at least one intact prophage sequence. Interestingly, all successfully lysogenized strains lacked intact prophages in their native state which contradicts the poly-lysogenic nature of SA. Additionally, the enhancement of biofilm formation after lysogenic conversion by ΦETA could be associated with pathogenesis of SSSS, increased invasiveness and even emergence of clinically relevant strains. Further studies are needed to explain the genetic and transcriptional basis of phenotypic changes. Together, our results underscore the vital role of ΦETA prophages in shaping SA diversity and clinical outcomes. This study highlights the necessity of investigating the molecular mechanisms associated with bacteriophage lysogenization and host range expansion.

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