Les toxi-infections alimentaires collectives staphylococciques représentent ces dernières années en France la seconde cause de toxi-infections alimentaires bactériennes. Ces dernières sont dues à l'ingestion de toxines préformées dans les aliments : les entérotoxines. Actuellement, une vingtaine d'entérotoxines (SEA àSElV) ont été décrites dans la littérature ; parmi celles-ci, toutes possédent une activité superantigéniques mais seules quelques unes possèdent une activité émétique prouvée et présentent donc un risque sanitaire pour le consommateur. Deux problèmes majeurs se posent pour confirmer le diagnostic des épisodes toxiques à staphylocoques. D'une part, les staphylocoques sont sensibles aux traitements thermiques appliqués aux aliments alors que les entérotoxines ne le sont pas, et d'autre part les méthodes de détection des entérotoxines staphylococciques actuellement disponibles ne couvrent pas l'ensemble des entérotoxines décrites à ce jour. Ainsi, et afin de proposer une alternative innovante aux tests immuno-enzymatiques utilisés pour la recherche des entérotoxines staphylococciques dans les matrices alimentaires, nous avons mis en place une démarche intégrée « du gène à la protéine » utilisant des outils de biologie moléculaire, d'immunochimie et de physisco-chimie des protéines pour caractériser, comprendre et élucider les toxi-infections alimentaires collectives à staphylocoques.

Le biofilm bactérien est une communauté de bactéries qui s’agrègent en un amas structuré recouvert d’une matrice polymérique et adhèrent sur une surface biotique ou abiotique. Ce mode de vie permet à ces bactéries de survivre dans un environnement hostile et cela entre autres grâce à une plus grande résistance aux antibiotiques que les bactéries sous forme libre ou planctonique. Les bactéries ayant la capacité de former des biofilms constituent donc un grave problème de santé tout aussi bien pour l’homme que pour l’animal comme par exemple dans le cas de la mammite bovine (MB). La MB est une inflammation de la glande mammaire de la vache induisant des dommages des tissus du pis et de ce fait, une réduction de la production de lait ainsi qu’une altération du bien-être de l’animal. Il est donc important de développer de nouvelles stratégies prophylactiques et thérapeutiques contre la MB. Des résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire avaient mis en évidence la capacité de certaines souches de staphylocoques à coagulase négative (SCN) produisant peu ou pas de biofilm à inhiber la formation de biofilm par d’autres bactéries responsables de MB. Notre hypothèse était donc que certaines souches faibles productrices de biofilm produisaient une ou plusieurs molécule(s) capable(s) d’inhiber de façon significative la formation de biofilm par d’autres SCN mais également par Staphylococcus aureus et possiblement d’autres agents pathogènes de la MB. Le but de ce projet fut donc de caractériser des molécules antibiofilm produites par des souches de SCN. Pour cela, 30 souches de staphylocoques (cinq espèces de SCN et S. aureus) fortes productrices de biofilm et 10 souches de SCN (Staphylococcus chromogenes et Staphylococcus simulans) faibles productrices de biofilm ont été utilisées. Nos résultats ont montré que certaines souches de SCN présentant un phénotype de faible production de biofilm réduisaient significativement la formation de biofilm chez plusieurs espèces de staphylocoques dont S. aureus. De plus, quatre souches de SCN (S. chromogenes C et E et S. simulans F et H) ont été capables d'inhiber de façon significative (p < 0,05) la formation de biofilm de 80% des souches testées. Cette activité antibiofilm a été également visualisée par microscopie confocale ainsi que dans des conditions dynamiques en utilisant un système de microfluidique. En parallèle, il a été démontré que les souches de SCN présentant un phénotype de faible production de biofilm n'inhibaient pas significativement la croissance des souches ayant un phénotype de forte production de biofilm. Par conséquent, l’activité antibiofilm observée ne semblait pas être due à une activité bactéricide. De plus, nos résultats ont montré que les surnageants de ces quatre souches présentaient également une activité antibiofilm et qu’ils possédaient un spectre d’activité étendu suggérant ainsi que les souches excrétaient une molécule antibiofilm dans son environnement extérieur. La caractérisation de ces surnageants a permis de mettre en évidence que l’activité inhibitrice était notamment conservée dans la fraction des surnageants < 3kDa et qu’une des molécules responsables de cette activité était hydrophile, thermorésistante et sensible à l’action de la RNase A. Enfin, nous avons pu observer que ces surnageants avaient la capacité de réduire voir même de prévenir la colonisation de la glande mammaire par une souche de S. aureus résistante à la méthicilline dans un modèle murin de mammite. Ces surnageants semblent être une alternative prometteuse dans le contrôle de la MB pour prévenir et/ou traiter cette infection que ce soit seul ou en association avec un traitement antibiotique. / Bacterial biofilms are structured communities of bacteria cells enclosed in a selfproduced polymeric matrix which is adherent to a biotic or abiotic surface. This lifestyle allows these bacteria to survive in hostile environments. For example, bacteria having the ability to form biofilms are significantly less susceptible to antibiotics than bacteria in planktonic form. Bacteria within biofilms pose a serious risk to human and animal health such as during bovine mastitis (BM). BM is an inflammation of the mammary gland of dairy cows which causes udder damages and reduces milk production. Therefore, it is important to develop new prophylactic and therapeutic strategies to control and treat BM. Preliminary results have demonstrated the ability of some coagulase-negative staphylococci (CNS) producing a weak biofilm to inhibit biofilm formation by other bacteria associated with BM. Our hypothesis is that some of CNS isolates having the ability to form a weak biofilm produce one or more molecule(s) able to significantly inhibit biofilm formation by other CNS, Staphylococcus aureus or other BM pathogens. The purpose of this project was to characterize antibiofilm molecules produced by CNS isolates. A total of 30 staphylococcal isolates (five species of CNS and S. aureus) with a strong biofilm phenotype and 10 CNS (Staphylococcus chromogenes and Staphylococcus simulans) isolates with a weak biofilm phenotype were used. Our results indicated that some CNS isolates with a weak biofilm phenotype significantly reduced biofilm formation of several staphylococcal species including S. aureus. Importantly, four isolates of CNS (S. chromogenes C and E and S. simulans F and H) were able to significantly inhibit biofilm formation (p < 0.05) of 80% of staphylococcal isolates tested. This activity was confirmed using confocal microscopy but also in dynamic conditions using a microfluidic system. Additionally, CNS with a weak biofilm phenotype did not significantly inhibit the growth of isolates with a strong biofilm phenotype. Therefore, the biofilm inhibition does not seem to be due to a bactericidal activity. The results also showed that the culture supernatants from these four bacteria still have an antibiofilm activity and own a broad spectrum of activity suggesting that the strains release an antibiofilm molecule into the external environment. The characterization of these supernatants indicated that the inhibitory activity was conserved in the < 3kDa fraction of the supernatants. Furthermore, one of the molecules responsible for the antibiofilm activity appears hydrophilic, heat-resistant and sensitive to the action of the RNase A. Finally, we observed that culture supernatants of these bacteria had the ability to reduce or even prevent colonization of the mammary gland by a strain of methicillin-resistant S. aureus in a murine model of mastitis. These supernatants appear to be a promising alternative alone or in combination with antibiotics in the control of BM.

Certaines espèces de Staphylocoques à Coagulase Négative (SCN) sont naturellement présentes ou employées comme ferments de salaison. La diversité de cette flore au niveau des ateliers de salaisons reste mal connue en raison notamment de la difficulté à identifier les espèces de SCN. Nous avons développé une PCR spécifique pour identifier Staphylococcus xylosus, principale espèce présente dans les produits carnés fermentés. Une PCR multiplex ciblant S. xylosus et trois espèces de staphylocoques pathogènes opportunistes a été développée permettant l'identification de ces espèces et du genre Staphylococcus. Ces méthodes et des méthodes complémentaires basées sur la caractérisation des souches par analyse en PFGE après restriction de l'ADN, par séquençage du gène sodA et par hybridation avec des sondes spécifiques ont permis l'étude de la diversité des SCN d'ateliers de salaisons traditionnelles, artisanales ou industrielles. Nous avons pu montrer que, dans un atelier traditionnel n'utilisant aucun ferment, S. equorum et S. succinus ont colonisé majoritairement les produits et l'environnement alors que les espèces S. xylosus et S. carnosus habituellement utilisées comme ferments sont minoritaires et n'ont pas été retrouvées au niveau des produits finis. Le suivi de S. carnosus et S. xylosus, utilisés comme ferments dans un atelier artisanal et un industriel, a révélé qu'ils ne colonisent pas l'environnement et que S. xylosus devient dominant dans les produits. Il pourrait être intéressant de développer de nouveaux ferments appartenant aux espèces S. equorum ou S. succinus qui semblent adaptées à l'environnement carné.

Les staphylocoques à coagulase négative (SCN) sont des bactéries fréquemment isolées de viandes et de produits carnés. Parmi les SCN, seules les deux espèces S. xylosus et S. carnosus sont utilisées comme ferments dans les produits carnés. Dans ces produits, il est d’usage d’ajouter du nitrate/nitrite pour le développement de la couleur typique des salaisons. Les staphylocoques participent au développement et à la stabilité de la couleur en réduisant le nitrate en nitrite via leur activité nitrate réductase. Le nitrite est chimiquement réduit en monoxyde d’azote (NO), qui se lie au fer de l’hème de la myoglobine pour former la nitrosomyoglobine, un pigment rouge et stable. Le contexte actuel vise à réduire l’utilisation du nitrate/nitrite afin de limiter le risque de formation de composés N-nitrosés tels que les nitrosamines. Il a été montré que les bactéries pouvaient synthétiser du NO à partir d’une oxyde nitrique synthase (NOS). Le gène nos a été identifié dans une collection de souches de SCN isolées de viande. La séquence protéique de la NOS est fortement conservée entre les espèces. Pour mettre en évidence la production de NO, un test basé sur la conversion de metmyoglobine en pigments rouges, l’oxymyoglobine et la nitrosomyoglobine, a été utilisé. Le nitrosohème contenu dans la nitrosomyoglobine a été extrait. La formation du nitrosohème, chez un mutant de délétion du gène nos de la souche S. xylosus C2a, est fortement réduite en condition limitée en oxygène et abolie en condition aérobie. De plus, la NOS de S. xylosus C2a est impliquée dans la réponse à un stress oxydant. Afin de déterminer le potentiel de production de NO de souches de S. xylosus et d’autres espèces de SCN, leur capacité à former de la nitrosomyoglobine a été évaluée. Cette formation est espèce- et souche-dépendante. Les souches de S. xylosus ont un potentiel de production de NO plus élevé que les souches des autres espèces. Ce test a également révélé que certaines souches de SCN sont capables de former de l’oxymyoglobine à partir de la metmyoglobine.Cette étude a permis de mettre en évidence l’implication de la NOS dans la production de NO chez S. xylosus et la capacité de formation de nitrosomyoglobine chez d’autres souches de SCN isolées de viande. / Coagulase Negative Staphylococci (CNS) are usually isolated from meat and meat products. In meat products, S. xylosus and S. carnosus are the only CNS species used as meat starter cultures. In these products, nitrate and nitrite are used as additives where they contribute to the development of the typical red coloration. Staphylococci contribute to the development and stability of colour through their nitrate reductase activity that reduces nitrate to nitrite. Nitrite is chemically reduced to nitric oxide (NO) which is able to bind the ferrous-heme iron to form the stable bright red nitrosomyoglobin pigment. However, the safety regarding the use of these additives on meat products has been questioned as nitrite is able to form N-nitroso compounds such as nitrosamines. Some bacteria are able to synthesize NO by nitric oxide synthase (NOS). The nos gene was identified in a collection of CNS isolated from meat. The NOS sequence is well conserved between species. NO production has been investigated based on the formation of red myoglobin derivatives from metmyoglobin such as oxymyoglobin and nitrosomyoglobin. Subsequently, the nitrosoheme was extracted from nitrosomyoglobin. Nitrosoheme formation was reduced under limited oxygenated condition while it was abolished under aerobic condition in a S. xylosus C2a nos deleted mutant. Moreover, NOS is involved in oxidative stress resistance in S. xylosus C2a. In order to determine the potential of NO production among other strains of S. xylosus and other CNS species, their potential to form nitrosomyoglobin was evaluated. Nitrosomyoglobin formation is strain- and species-dependent. This assay has also revealed that several CNS strains are able to form oxymyoglobin from metmyoglobin.This study has demonstrated NOS-dependent NO production in S. xylosus and the ability of CNS isolated from meat to form nitrosomyoglobin.