Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les staphylocoques à coagulase négative (SCN) sont des bactéries fréquemment isolées de viandes et de produits carnés. Parmi les SCN, seules les deux espèces S. xylosus et S. carnosus sont utilisées comme ferments dans les produits carnés. Dans ces produits, il est d’usage d’ajouter du nitrate/nitrite pour le développement de la couleur typique des salaisons. Les staphylocoques participent au développement et à la stabilité de la couleur en réduisant le nitrate en nitrite via leur activité nitrate réductase. Le nitrite est chimiquement réduit en monoxyde d’azote (NO), qui se lie au fer de l’hème de la myoglobine pour former la nitrosomyoglobine, un pigment rouge et stable. Le contexte actuel vise à réduire l’utilisation du nitrate/nitrite afin de limiter le risque de formation de composés N-nitrosés tels que les nitrosamines. Il a été montré que les bactéries pouvaient synthétiser du NO à partir d’une oxyde nitrique synthase (NOS). Le gène nos a été identifié dans une collection de souches de SCN isolées de viande. La séquence protéique de la NOS est fortement conservée entre les espèces. Pour mettre en évidence la production de NO, un test basé sur la conversion de metmyoglobine en pigments rouges, l’oxymyoglobine et la nitrosomyoglobine, a été utilisé. Le nitrosohème contenu dans la nitrosomyoglobine a été extrait. La formation du nitrosohème, chez un mutant de délétion du gène nos de la souche S. xylosus C2a, est fortement réduite en condition limitée en oxygène et abolie en condition aérobie. De plus, la NOS de S. xylosus C2a est impliquée dans la réponse à un stress oxydant. Afin de déterminer le potentiel de production de NO de souches de S. xylosus et d’autres espèces de SCN, leur capacité à former de la nitrosomyoglobine a été évaluée. Cette formation est espèce- et souche-dépendante. Les souches de S. xylosus ont un potentiel de production de NO plus élevé que les souches des autres espèces. Ce test a également révélé que certaines souches de SCN sont capables de former de l’oxymyoglobine à partir de la metmyoglobine.Cette étude a permis de mettre en évidence l’implication de la NOS dans la production de NO chez S. xylosus et la capacité de formation de nitrosomyoglobine chez d’autres souches de SCN isolées de viande. / Coagulase Negative Staphylococci (CNS) are usually isolated from meat and meat products. In meat products, S. xylosus and S. carnosus are the only CNS species used as meat starter cultures. In these products, nitrate and nitrite are used as additives where they contribute to the development of the typical red coloration. Staphylococci contribute to the development and stability of colour through their nitrate reductase activity that reduces nitrate to nitrite. Nitrite is chemically reduced to nitric oxide (NO) which is able to bind the ferrous-heme iron to form the stable bright red nitrosomyoglobin pigment. However, the safety regarding the use of these additives on meat products has been questioned as nitrite is able to form N-nitroso compounds such as nitrosamines. Some bacteria are able to synthesize NO by nitric oxide synthase (NOS). The nos gene was identified in a collection of CNS isolated from meat. The NOS sequence is well conserved between species. NO production has been investigated based on the formation of red myoglobin derivatives from metmyoglobin such as oxymyoglobin and nitrosomyoglobin. Subsequently, the nitrosoheme was extracted from nitrosomyoglobin. Nitrosoheme formation was reduced under limited oxygenated condition while it was abolished under aerobic condition in a S. xylosus C2a nos deleted mutant. Moreover, NOS is involved in oxidative stress resistance in S. xylosus C2a. In order to determine the potential of NO production among other strains of S. xylosus and other CNS species, their potential to form nitrosomyoglobin was evaluated. Nitrosomyoglobin formation is strain- and species-dependent. This assay has also revealed that several CNS strains are able to form oxymyoglobin from metmyoglobin.This study has demonstrated NOS-dependent NO production in S. xylosus and the ability of CNS isolated from meat to form nitrosomyoglobin.

La palourde japonaise, Ruditapes philippinarum, a été introduite en France en 1972 suite à une volonté de diversification de la production aquacole des bivalves. A la fin des années 1980, des épisodes de mortalité massive ont été observés dans les parcs vénéricoles du pays des Abers (Finistère, France). La mortalité massive des palourdes a été associée à la maladie de l’anneau brun (MAB), une vibriose dont l’agent étiologique est Vibrio tapetis. Le développement de la MAB en milieu naturel a été associé à la modulation de certains facteurs environnementaux tels que la température ou la présence de ressource trophique. Dans le cadre de ce travail et dans un premier temps, des infections expérimentales de palourdes avec différentes souches de V. tapetis ont été effectuées conjointement à une acclimatation des animaux à deux températures contrastées. L’augmentation de la température de 15 à 22 °C a été associée à de plus fortes activités enzymatiques de la superoxyde dismutase (SOD), impliquée dans le système antioxydant, et de la phénoloxydase (PO), impliquée dans le système immunitaire inné. L’augmentation de la température a également conduit à une diminution de la virulence de Vibrio tapetis. Ensemble, ces résultats permettent d’expliquer la baisse de la prévalence et de l’intensité de la MAB à 22 °C. Dans un second temps, des palourdes sexuellement matures nourries avec deux algues contrastées en termes de composition lipidique ont été infectées par V. tapetis. Si la qualité des microalgues n’a pas conduit à des différences de prévalence et d’intensité de la MAB, le statut de reproduction des animaux a eu une influence sur l’intensité de la maladie. Les réponses métaboliques de R. philippinarum exposée à V. tapetis n’ont pas été influencées par la qualité de la nourriture mais par le développement de la MAB. Ces réponses consistaient en une modulation de l’activité d’enzymes antioxydantes (SOD, catalase, glutathion peroxydase, glutathion réductase,glutathion-S-transférase) et d’enzymes reliées au système immunitaire inné (PO et oxyde nitrique synthase inductible) en fonction de la présence de signes cliniques de la MAB. Finalement, l’utilisation de ces indicateurs biochimiques pourrait permettre d’établir des critères de sélection d’individus résistants à la MAB. / The Manila clam, Ruditapes philippinarum, was introduced in France in 1972 following the willingness of bivalve aquaculture diversification. In the late 1980s, episodic mass mortality events were observed in ponds of the “Pays des Abers” region (Finistère, France). The massive mortality of clams was associated brown ring disease (BRD), a vibriosis which causative agent is Vibrio tapetis. BRD development in field has been associated with the modulation of environmental factors such as temperature or the presence of trophic resource. Firstly in the frame of the present work, experimental infections of clams with different strains of V. tapetis were performed together with animal acclimation at two contrasted temperatures. The increase of temperature from 15 to 22 ° C was associated with higher enzymatic activities of superoxide dismutase (SOD), involved in the antioxidant system, and the phenoloxidase (PO), involved in the innate immune system. Temperature increase also led to a decrease in virulence of V. tapetis. Together, these results might explain the decline in BRD prevalence and intensity observed at 22 ° C. Secondly, sexually mature clams fed with two microalgal diets contrasted in terms of lipid composition were infected with V. tapetis. Although microalgae quality did not lead to any difference in BRD prevalence and intensity, the reproductive status of clams influenced BRD intensity. Metabolic responses of R. philippinarum exposed to V. tapetis were not influenced by the food quality but mainly by BRD development. These responses consisted in a modulation of the activity of antioxidant enzymes (SOD, catalase, glutathione peroxidase, glutathione reductase, glutathione S-transferase) and enzymes related to innate immune system (PO and inducible nitric oxide synthase) according to the presence of BRD clinical signs. Finally, the use of these biochemical indicators could allow for new criteria for selection of BRD resistant clams.

Le syndrome de Wernicke-Korsakoff (SWK) est un désordre neuropsychiatrique causé par la déficience en thiamine (DT). Dans la DT expérimentale comme dans le SWK, on observe une mort neuronale et des hémorragies dans certaines régions précises du diencéphale et du tronc cérébral. Les lésions diencéphaliques du SWK sont particulièrement sévères et entraînent souvent des séquelles amnésiques permanentes. Le lien entre la dysfonction métabolique induite par la DT et la mort neuronale n’est pas connu. Des rapports précédents ont démontré que la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) était altérée et ce, précédant l’apparition du dommage neuronal, suggérant un rôle critique de la dysfonction vasculaire. Les jonctions serrées (JS) interendothéliales, la base anatomique de la BHE, constituent un réseau moléculaire incluant l’occludin et les zonula occludens (ZOs). Cette thèse démontre une perte d’expression et une altération de la morphologie de ces protéines en relation avec la dysfonction de la BHE dans le thalamus de souris déficientes en thiamine, fournissant une explication pour la présence d’hémorragies. Le stress oxydatif peut entraîner des dommages directs aux protéines des JS et interférer avec leurs mécanismes de régulation. De plus, l’oxyde nitrique (NO) peut induire la métalloprotéinase matricielle-9 (MMP-9) impliquée dans la dégradation de ces protéines. L’endothélium vasculaire cérébral (EVC) semble être une source importante de NO dans la DT, l’expression de l’oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS) étant sélectivement induite dans les régions vulnérables. Le NO peut réagir avec les espèces réactives oxygénées et former du peroxynitrite, entraînant un stress oxydatif/nitrosatif endothélial. Les résultats présentés démontrent que la délétion du gène de eNOS prévient le stress oxydatif/nitrosatif cérébrovasculaire, l’extravasation des immunoglobulins G (IgGs) et l’altération de l’occludin et des ZOs dans le thalamus de souris déficientes en thiamine. De plus, cette délétion prévient l’induction de l’expression de MMP-9 dans l’EVC. Des résultats similaires ont été obtenus avec l’antioxydant N-acétylcystéine (NAC). Les mécanismes précis par lesquels les espèces réactives altèrent les protéines des JS sont inconnus. Caveolin-1, une composante majeure du caveolæ de l’EVC, est impliquée dans la régulation de l’expression des protéines des JS, et celle-ci est modulée par le stress oxydatif/nitrosatif; l’altération de l’expression de caveolin-1 a été récemment associée à la rupture de la BHE. Les résultats présentés démontrent que l’expression de caveolin-1 est sélectivement altérée dans l’EVC du thalamus de souris déficientes en thiamine, coïcidant avec la rupture de la BHE, et démontrent que la normalisation de l’expression de caveolin-1 par le NAC est associée avec l’atténuation du dommage à la BHE. Pris ensemble, ces résultats démontrent un rôle central du stress oxydatif/nitrosatif cérébrovasculaire, particulièrement celui provenant de eNOS, dans l’altération des JS de la BHE via des dommages directs et via l’induction de MMP-9 et de caveolin-1. Cette rupture de la BHE contribue par conséquent à la mort neuronale dans le thalamus, puisque la prévention des altérations cérébrovasculaires par la délétion du gène de eNOS et le NAC atténue significativement la mort neuronale. L’administration précoce d’antioxydants en combinaison avec la thiamine devrait donc être une considération importante pour le traitement du SWK. / Wernicke-Korsakoff syndrome (WKS) is a neuropsychiatric disorder caused by thiamine deficiency (TD). In experimental TD as in WKS, neuronal cell death and hemorrhages are observed in specific diencephalic and brainstem areas. Diencephalic lesions in WKS are especially severe and often lead to permanent amnesic symptoms. The link between TD-induced metabolic dysfunction and neuronal cell death is unknown. Previous reports have shown that blood-brain barrier (BBB) permeability was impaired and that this occurred prior to the onset of neuronal damage, suggesting a critical role for vascular dysfunction. Interendothelial tight junctions (TJs), the anatomical basis of the BBB, constitute a molecular network comprising occludin and zonula occludens (ZOs). This thesis shows a loss of expression and alterations in the morphology of these proteins in relation to BBB dysfunction in the thalamus of thiamine-deficient mice, providing an explanation for the presence of hemorrhages. Oxidative stress can lead to direct oxidative damage to TJ proteins and interfere with their regulation mechanisms. Also, nitric oxide (NO) can induce matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) involved in the degradation of these proteins. Cerebral vascular endothelium (CVE) seems to be an important source of NO in TD, since endothelial nitric oxide synthase (eNOS) expression is selectively induced in vulnerable areas. NO can react with reactive oxygen species and form peroxynitrite, leading to endothelial oxidative/nitrosative stress. Results have show that eNOS gene deletion prevents cerebrovascular oxidative/nitrosative stress, immunoglobulins G (IgGs) extravasation and occludin and ZOs alterations in the thalamus of thiamine-deficient mice. Also, eNOS gene deletion prevents the induction of MMP-9 in CVE. Similar results have been obtained with the antioxidant N-acetylcysteine (NAC). Precise mechanisms by which reactive species alter TJ proteins are unknown. Caveolin-1, a major component of CVE caveolæ, is involved in the regulation of TJ protein expression, and is modulated by oxidative/nitrosative stress; alteration in caveolin-1 expression has been recently associated with BBB breakdown. The present results show that caveolin-1 expression is selectively altered in CVE of the thalamus of thiamine-deficient mice, and show that normalization of caveolin-1 expression by NAC is associated with the attenuation of BBB damage. Taken together, these results demonstrate a central role for cerebrovascular oxidative/nitrosative stress, especially coming from eNOS, in BBB TJ protein alterations via direct damage and via induction of MMP-9 and caveolin-1. As a result, BBB breakdown contributes to neuronal cell death in the thalamus, since prevention of cerebrovascular alterations by eNOS gene deletion and NAC significantly attenuates neuronal cell death. Early administration of antioxidants combined with thiamine should therefore be an important consideration for the treatment of WKS.

Le syndrome de Wernicke-Korsakoff (SWK) est un désordre neuropsychiatrique causé par la déficience en thiamine (DT). Dans la DT expérimentale comme dans le SWK, on observe une mort neuronale et des hémorragies dans certaines régions précises du diencéphale et du tronc cérébral. Les lésions diencéphaliques du SWK sont particulièrement sévères et entraînent souvent des séquelles amnésiques permanentes. Le lien entre la dysfonction métabolique induite par la DT et la mort neuronale n’est pas connu. Des rapports précédents ont démontré que la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) était altérée et ce, précédant l’apparition du dommage neuronal, suggérant un rôle critique de la dysfonction vasculaire. Les jonctions serrées (JS) interendothéliales, la base anatomique de la BHE, constituent un réseau moléculaire incluant l’occludin et les zonula occludens (ZOs). Cette thèse démontre une perte d’expression et une altération de la morphologie de ces protéines en relation avec la dysfonction de la BHE dans le thalamus de souris déficientes en thiamine, fournissant une explication pour la présence d’hémorragies. Le stress oxydatif peut entraîner des dommages directs aux protéines des JS et interférer avec leurs mécanismes de régulation. De plus, l’oxyde nitrique (NO) peut induire la métalloprotéinase matricielle-9 (MMP-9) impliquée dans la dégradation de ces protéines. L’endothélium vasculaire cérébral (EVC) semble être une source importante de NO dans la DT, l’expression de l’oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS) étant sélectivement induite dans les régions vulnérables. Le NO peut réagir avec les espèces réactives oxygénées et former du peroxynitrite, entraînant un stress oxydatif/nitrosatif endothélial. Les résultats présentés démontrent que la délétion du gène de eNOS prévient le stress oxydatif/nitrosatif cérébrovasculaire, l’extravasation des immunoglobulins G (IgGs) et l’altération de l’occludin et des ZOs dans le thalamus de souris déficientes en thiamine. De plus, cette délétion prévient l’induction de l’expression de MMP-9 dans l’EVC. Des résultats similaires ont été obtenus avec l’antioxydant N-acétylcystéine (NAC). Les mécanismes précis par lesquels les espèces réactives altèrent les protéines des JS sont inconnus. Caveolin-1, une composante majeure du caveolæ de l’EVC, est impliquée dans la régulation de l’expression des protéines des JS, et celle-ci est modulée par le stress oxydatif/nitrosatif; l’altération de l’expression de caveolin-1 a été récemment associée à la rupture de la BHE. Les résultats présentés démontrent que l’expression de caveolin-1 est sélectivement altérée dans l’EVC du thalamus de souris déficientes en thiamine, coïcidant avec la rupture de la BHE, et démontrent que la normalisation de l’expression de caveolin-1 par le NAC est associée avec l’atténuation du dommage à la BHE. Pris ensemble, ces résultats démontrent un rôle central du stress oxydatif/nitrosatif cérébrovasculaire, particulièrement celui provenant de eNOS, dans l’altération des JS de la BHE via des dommages directs et via l’induction de MMP-9 et de caveolin-1. Cette rupture de la BHE contribue par conséquent à la mort neuronale dans le thalamus, puisque la prévention des altérations cérébrovasculaires par la délétion du gène de eNOS et le NAC atténue significativement la mort neuronale. L’administration précoce d’antioxydants en combinaison avec la thiamine devrait donc être une considération importante pour le traitement du SWK. / Wernicke-Korsakoff syndrome (WKS) is a neuropsychiatric disorder caused by thiamine deficiency (TD). In experimental TD as in WKS, neuronal cell death and hemorrhages are observed in specific diencephalic and brainstem areas. Diencephalic lesions in WKS are especially severe and often lead to permanent amnesic symptoms. The link between TD-induced metabolic dysfunction and neuronal cell death is unknown. Previous reports have shown that blood-brain barrier (BBB) permeability was impaired and that this occurred prior to the onset of neuronal damage, suggesting a critical role for vascular dysfunction. Interendothelial tight junctions (TJs), the anatomical basis of the BBB, constitute a molecular network comprising occludin and zonula occludens (ZOs). This thesis shows a loss of expression and alterations in the morphology of these proteins in relation to BBB dysfunction in the thalamus of thiamine-deficient mice, providing an explanation for the presence of hemorrhages. Oxidative stress can lead to direct oxidative damage to TJ proteins and interfere with their regulation mechanisms. Also, nitric oxide (NO) can induce matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) involved in the degradation of these proteins. Cerebral vascular endothelium (CVE) seems to be an important source of NO in TD, since endothelial nitric oxide synthase (eNOS) expression is selectively induced in vulnerable areas. NO can react with reactive oxygen species and form peroxynitrite, leading to endothelial oxidative/nitrosative stress. Results have show that eNOS gene deletion prevents cerebrovascular oxidative/nitrosative stress, immunoglobulins G (IgGs) extravasation and occludin and ZOs alterations in the thalamus of thiamine-deficient mice. Also, eNOS gene deletion prevents the induction of MMP-9 in CVE. Similar results have been obtained with the antioxidant N-acetylcysteine (NAC). Precise mechanisms by which reactive species alter TJ proteins are unknown. Caveolin-1, a major component of CVE caveolæ, is involved in the regulation of TJ protein expression, and is modulated by oxidative/nitrosative stress; alteration in caveolin-1 expression has been recently associated with BBB breakdown. The present results show that caveolin-1 expression is selectively altered in CVE of the thalamus of thiamine-deficient mice, and show that normalization of caveolin-1 expression by NAC is associated with the attenuation of BBB damage. Taken together, these results demonstrate a central role for cerebrovascular oxidative/nitrosative stress, especially coming from eNOS, in BBB TJ protein alterations via direct damage and via induction of MMP-9 and caveolin-1. As a result, BBB breakdown contributes to neuronal cell death in the thalamus, since prevention of cerebrovascular alterations by eNOS gene deletion and NAC significantly attenuates neuronal cell death. Early administration of antioxidants combined with thiamine should therefore be an important consideration for the treatment of WKS.