Bochum, Univ., Diss., 2004. / Computerdatei im Fernzugriff.

Bochum, Universiẗat, Diss., 2004.

Une partie conséquente de mon travail a été d'effectuer un crible génétique en utilisant une bibliothèque de mutants générés par insertion aléatoire de Tn5-Sm, un minitransposon bactérien. Le crible a été réalisé dans un contexte défini: celui de mouches-hôtes auxquelles manquait le gène Eater, lequel code un récepteur de phagocytose (Kocks et al., 2005). Dans ces mouches, l'infection n'est plus contrôlée dans l'hémocoele par les hémocytes et les drosophiles mutantes succombent rapidement à une bactériémie. Plusieurs phénotypes bactériens étaient attendus à l'issue de ce crible. Une première catégorie de phénotype prévisible était une virulence accrue, par exemple si les bactéries mutantes devenaientcapables de traverser plus rapidement ou efficacement la barrière intestinale conséquemment à la perte d'un régulateur négatif. Un deuxième type de phénotype attendu était une virulence atténuée pouvant s'expliquer de plusieurs manières: 1- perte de résistance à l'environnement existant dans le lumen intestinal (enzymes digestives et lysozyme, radicaux libres et peptides antimicrobiens induits au niveau de l'épithélium intestinal dans le cadre d'une réponse immunitaire locale de l'hôte); 2- incapacité à traverser la matrice péritrophique; 3-incapacité à envahir les cellules épithéliales (adhésion, pénétration); 4- incapacité à résister aux défenses intracellulaires potentielles; 5- incapacité à sortir du côté basal des entérocytes 6- incapacité à proliférer dans l'hémolymphe ou perte de la résistance à l'action de la réponse immunitairesystémique qui est, quant à elle, fortement induite en l'absence de phagocytose, laquelle empêche chez les mouches sauvages la prolifération des bactéries ayant traversé la paroi intestinale. [...] Dans le cadre d'une infection intestinale, les mouches sauvages (et imd) succombaient en six jours alors que, de manière surprenante, les mouches mutantes de la voie Toll périssaient plus lentement, une situation opposée à celle du modèle de la piqûre septique. Quelques bactéries sont capables de traverser la paroi intestinale mais sont incapables de proliférer à moins que la réponse cellulaire ait été préalablement bloquée. L'épithélium intestinal apparaissait normal à la dissection et la presque totalité des bactéries ingérées étaient tuées dans l'intestin. Après avoir exclu l'hypothèse d'une toxine sécrétée dans le surnageant des bactéries adsorbées sur le filtre sur lequel viennent se nourrir les mouches, nous avons testé l'hypothèse qu'une suractivation de la réponse immunitaire était à l'origine du décès des mouches. La génétique mettant hors de cause les peptides antimicrobiens, la voie Toll n'étant apparemment pas activée dans l'épithélium intestinal, nous avons alors étudié laréponse oxydative induite par l'ingestion de bactéries (Ha et al., 2009), laquelle est capable de tuer les mouches lorsqu'elle n'est pas régulée correctement. Là-aussi, le résultat s'est avéré négatif. En fin de compte, j'ai pu établir que la mort des mouches était due à un état de famine, confirmé par des mesures des réserves métaboliques. Mes travaux ont permis d'établir un nouveau rôle de la voie Toll dans la résistance à la famine, en présence ou absence d'infection, qui sera peut-être à mettre en relation avec un rôle métabolique de la voie Toll consistant à bloquer la voie de réponse à l'insuline lors d'une infection. En conclusion, mes travaux permettent de mieux comprendre les relations hôte-pathogènequi s'établissent lors d'une infection intestinale. / For the systematic study of bacteri al virulence factors, we initially planned to screen the 12,000 mutant strains of the miniTn5-Sm tranposon-induced mutant bank in a wild-type S. marcescens strain Db10. Phagocytosis-deficient eater mutant flies (Kocks et al., 2005) were used in this screen to isolate the bacterial strains mutated for virulence factors and the genes responsible for crossing the gut barrier. In the eater mutant background, flies succumb to septicemia caused by the rapid proliferation of the bacteria in the hemolymph. Out of 1348 mutant strains screened, 58 candidate mutants have been isolated. Only 20% percent of the potential mutant strains displayed an increased virulence indicating that there are very few factor(s) that negatively control the virulence program of the bacterium. The fly survival phenotypes induced by the candidate mutants isolated in the first round of screen were retested. Only those bacterial strains that were consistent with the phenotype were chosen for the molecular identification of the transposon insertion sites using one primer PCR (Karlyshev et al., 2000). Once the genes impaired in each case had been identified, they were knocked off in the S. marcescens Db10 by site specific plasmid insertion mutagenesis. A mutant strain with the transposon inserted into the fliR gene, a component of the type III flagellar protein export system, exhibited attenuation of virulence. The plasmid insertionmutant strain generated to interrupt the gene fliR reproduced the fly survival phenotyp, indicating that the fliR gene is important for the virulence of S. marcescens. The fliR mutants are able to cross the peritrophic matrix, functionally similar to the human mucus. The bacteria were found in the vicinity of the epithelial cells but were not able to efficiently invade the intestinal epithelium as compared to the wild-type strain. Consequently lower titer of FliR mutants was found in the hemolymph. The inefficiency of the FliR mutants to invade cells was also confirmed in ex-vivo assay using insect cells.I thus demonstrated that the fliR gene which is important in the motility apparatus is also required by S. marcescens for the crossing of the epithelial barrier of D. melanogaster.[...]A strong oxidative response is triggered by D. melanogaster in the midgut against commensals and pathogens (Ha et al., 2009). In order to check whether the strong oxidative immune response is eventually killing the flies themselves, hydrogen peroxide was chemically neutralized in the midgut during the S. xylosus A. oral infection. No difference inthe fly survivals was observed with or without neutralization of the oxidative response indicating that over-production of reactive oxygen species (ROS) does not seem to be responsible for the fly death caused by a very low number of bacteria. Flies could efficiently survive to killed bacteria and filtered supernatant solution from overnight bacterial culture indicating that they do not die to the toxins released by the bacteria. Most surprisingly MyD88-, the Toll pathway-, mutant flies were surviving better to S. xylosus A. oral infection. A series of experiments lead us to the finding that the flies actually succumbed to starvation when orally infected with S. xylosus and that the MyD88 is required for the starvation susceptibility in microbiota-mediated manner. In conclusion my work has lead us to the better understanding of the host-bacterial interactions in the intestine.

Due to the risk for human health associated to the presence of polychlorinated biphenyl (PCB) residues in foods, there is an interest in knowing the different factors that could reduce such contamination. Previous research has demonstrated that food processing modifies both qualitative and quantitatively, the organochlorine contamination, specially PCBs, of the raw material. Further, microorganisms of technological interest in food industry could play an important role in the degradation process. The growth of the meat starter Staphylococcus xylosus in liquid media containing PCBs (10, 28, 52, 138, 153 and 180), and its ability to degrade PCBs during 168 h of incubation in liquid media and meat mixture was investigated. PCBs did not affect the growth of the starter microorganism in nutritive (brain heart infusion, BHI) or mineral salt medium (MSM) when compared to control (no PCB). The microorganism was able to degrade some of the PCB congeners tested. PCBs 138 and 153 were degraded both in BHI (78% and 68%, respectively; p<0.05) and in MSM (71% and 66%, respectively; p<0.05), with maximal being observed within 24 hours. Highly significant negative exponential relationships were observed between incubation time and PCB 28 and 180 in BHI, as well as to PCBs 52 and 180 in MSM. In the meat mixture highly significant negative exponential relationships were observed between incubation time and the concentration of PCB 10. These results indicate that fermentation by Staphylococcus xylosus in meat products can reduce some PCB residues and the meat starter can be used to obtain foods with lower toxicological risk. / É de grande importância o conhecimento dos diversos fatores que podem reduzir a contaminação causada por bifenilos policlorados (PCBs) em alimentos, já que resíduos destes compostos podem trazer graves riscos à saúde humana. Diversas investigações têm demonstrado que o processamento dos alimentos modifica, tanto qualitativa quanto quantitativamente, a contaminação organoclorada, especialmente de PCBs, presente na matéria prima. Além disso, os microrganismos de interesse tecnológico na indústria alimentícia poderiam ser de grande importância no processo de degradação. Investigou-se o crescimento do microrganismo starter Staphylococcus xylosus em meio de cultura líquido contendo PCBs (10, 28, 52, 138, 153 e 180), e sua capacidade degradativa em meio liquido e massa cárnea durante 168 horas de incubação. A presença de PCBs não afetou o crescimento do microrganismo em meio de cultura nutritivo (BHI) ou meio de cultura salino (MSM) quando comparados com o controle (sem a presença de PCBs). O microrganismo demonstrou capacidade de degradar alguns dos congêneres de PCBs testados. Os PCBs 138 e 153 foram degradados em meio nutritivo (78% e 68%, respectivamente; p<0,05) e em meio salino (71% e 66%, respectivamente; p<0,05), sendo observada uma máxima degradação nas primeiras 24 horas de incubação. Relação exponencial significativa foi observada entre o período de incubação e os PCBs 28 e 180 em BHI, assim como para os PCBs 52 e 180 em meio salino. Relação exponencial significativa foi observada entre o período de incubação e as concentrações do PCB 10 em massa cárnea. Estes resultados indicam que a fermentação realizada por Staphylococcus xylosus em produtos cárneos pode reduzir resíduos de PCBs e o microrganismo starter pode ser usado na obtenção de alimentos com menor risco toxicológico.

Darbo tikslas: ištirti apsauginių kultūrų panaudojimo mėsos pusgaminių gamyboje galimybes, gerinant saugą ir kokybę. Darbo uždaviniai: įsisavinti apsauginių kultūrų panaudojimo mėsos pusgaminių gamyboje būdus, pusgaminių kokybinių ir saugos rodiklių nustatymo metodus; ištirti apsauginių bakterijų kultūrų: Lactobacillus spp. Staphylococcus xylosus, poveikį mėsos pusgaminių mikrobiologiniams ir fizikiniams cheminiams rodikliams, įvertinti jų saugą ir kokybę; ištirti termiškai apdorotų mėsos pusgaminių su apsauginėmis bakterinėmis kultūromis Lactobacillus spp., Staphylococcus xylosus juslines savybes; palyginti įprastų ir gautų mėsos pusgaminių su apsauginėmis kultūromis kokybę ir saugą, juslines savybes, vartojimo terminą; apdoroti statistiškai gautus duomenis, apibendrinti rezultatus ir pateikti išvadas. Rezultatai: priedas su apsauginėmis kultūromis Lactobacillus spp., Staphylococcus xylosus visiškai išnaikino E. Coli jautienos farše, supakuotame į vakuuminę pakuotę (p ≤ 0,01), modifikuotų dujų atmosferą (p ≤ 0,01), laikomo aerobinėmis sąlygomis (p ≤ 0,001) lyginant su kontrole. Apsauginių kultūros ženkliai sumažino bendrą aerobinių mikroorganizmų skaičių lyginant su kontrole (p ≤ 0,001). Apsauginių kultūrų įterpimas sumažino biogeninių aminų tiramino, spermidino ir spermino kiekius iki mažesnių už aptikimo ribą kiekių (< 5 mg/kg), tačiau mėginiuose su apsauginių kultūrų priedu, laikomuose aerobinėmis sąlygomis, nustatytas padidėjęs fenilalanino kiekis, lyginant su kontrole... [toliau žr. visą tekstą] / The aim of the work was to investigate the possibilities of using protective cultures in the manufacture of semi-finished meat in improving safety and quality. The tasks of the work were to master ways of using protective cultures in production of semi-finished meat; methods for determining quality and safety indicators of semi – finished meat; to investigate the impact of protective bacterial cultures: Lactobacillus spp., Staphylococcus xylosus to microbiological and physico-chemical parameters of semi – finished meat in order to ensure their safety and quality; to investigate organoleptic properties of the heat-treated semi – finished meat with a protective bacterial cultures Lactobacillus spp., Staphylococcus xylosus; to compare quality and safety, organoleptic characteristics, expiry date of conventional and meat preparations with protective cultures; to process statistically obtained data, summarize the results and present findings. Results: • Additive with protective cultures Lactobacillus spp., Staphylococcus xylosus completely destroyed E. coli in vacuum packed minced beef (p ≤ 0,01), in modified gas atmosphere (p ≤ 0,01), stored under aerobic conditions (p ≤ 0,001) compare with the controls. • Protective cultures significantly reduced the total number of aerobic microorganisms compare with controls (p ≤ 0,001). • Insertion of protective cultures reduced biogenic amines tyramine, spermidine and spermine below the detection limit (<5 mg / kg), however, samples... [to full text]

Les staphylocoques à coagulase négative (SCN) sont des bactéries fréquemment isolées de viandes et de produits carnés. Parmi les SCN, seules les deux espèces S. xylosus et S. carnosus sont utilisées comme ferments dans les produits carnés. Dans ces produits, il est d’usage d’ajouter du nitrate/nitrite pour le développement de la couleur typique des salaisons. Les staphylocoques participent au développement et à la stabilité de la couleur en réduisant le nitrate en nitrite via leur activité nitrate réductase. Le nitrite est chimiquement réduit en monoxyde d’azote (NO), qui se lie au fer de l’hème de la myoglobine pour former la nitrosomyoglobine, un pigment rouge et stable. Le contexte actuel vise à réduire l’utilisation du nitrate/nitrite afin de limiter le risque de formation de composés N-nitrosés tels que les nitrosamines. Il a été montré que les bactéries pouvaient synthétiser du NO à partir d’une oxyde nitrique synthase (NOS). Le gène nos a été identifié dans une collection de souches de SCN isolées de viande. La séquence protéique de la NOS est fortement conservée entre les espèces. Pour mettre en évidence la production de NO, un test basé sur la conversion de metmyoglobine en pigments rouges, l’oxymyoglobine et la nitrosomyoglobine, a été utilisé. Le nitrosohème contenu dans la nitrosomyoglobine a été extrait. La formation du nitrosohème, chez un mutant de délétion du gène nos de la souche S. xylosus C2a, est fortement réduite en condition limitée en oxygène et abolie en condition aérobie. De plus, la NOS de S. xylosus C2a est impliquée dans la réponse à un stress oxydant. Afin de déterminer le potentiel de production de NO de souches de S. xylosus et d’autres espèces de SCN, leur capacité à former de la nitrosomyoglobine a été évaluée. Cette formation est espèce- et souche-dépendante. Les souches de S. xylosus ont un potentiel de production de NO plus élevé que les souches des autres espèces. Ce test a également révélé que certaines souches de SCN sont capables de former de l’oxymyoglobine à partir de la metmyoglobine.Cette étude a permis de mettre en évidence l’implication de la NOS dans la production de NO chez S. xylosus et la capacité de formation de nitrosomyoglobine chez d’autres souches de SCN isolées de viande. / Coagulase Negative Staphylococci (CNS) are usually isolated from meat and meat products. In meat products, S. xylosus and S. carnosus are the only CNS species used as meat starter cultures. In these products, nitrate and nitrite are used as additives where they contribute to the development of the typical red coloration. Staphylococci contribute to the development and stability of colour through their nitrate reductase activity that reduces nitrate to nitrite. Nitrite is chemically reduced to nitric oxide (NO) which is able to bind the ferrous-heme iron to form the stable bright red nitrosomyoglobin pigment. However, the safety regarding the use of these additives on meat products has been questioned as nitrite is able to form N-nitroso compounds such as nitrosamines. Some bacteria are able to synthesize NO by nitric oxide synthase (NOS). The nos gene was identified in a collection of CNS isolated from meat. The NOS sequence is well conserved between species. NO production has been investigated based on the formation of red myoglobin derivatives from metmyoglobin such as oxymyoglobin and nitrosomyoglobin. Subsequently, the nitrosoheme was extracted from nitrosomyoglobin. Nitrosoheme formation was reduced under limited oxygenated condition while it was abolished under aerobic condition in a S. xylosus C2a nos deleted mutant. Moreover, NOS is involved in oxidative stress resistance in S. xylosus C2a. In order to determine the potential of NO production among other strains of S. xylosus and other CNS species, their potential to form nitrosomyoglobin was evaluated. Nitrosomyoglobin formation is strain- and species-dependent. This assay has also revealed that several CNS strains are able to form oxymyoglobin from metmyoglobin.This study has demonstrated NOS-dependent NO production in S. xylosus and the ability of CNS isolated from meat to form nitrosomyoglobin.

Staphylococcus xylosus et Staphylococcus carnosus sont utilisés comme ferments de salaisons. S. xylosus est fréquemment isolé dans l'environnement des ateliers de transformation alimentaire alors que S. carnosus l'est rarement. Ainsi, nous avons étudié la capacité de ces deux espèces à former des biofilms sur divers supports abiotiques. Les souches de S. carnosus sont hydrophiles, adhèrent à des supports hydrophiles mais ne forment pas de biofilms. Certaines souches de S. xylosus sont hydrophiles, d'autres moyennement hydrophobes et elles forment des biofilms quelque soit le support. S. xylosus C2a, choisie comme souche d'étude, forme des biofilms denses avec des agrégats intercelluaires séparés par des canaux et englués dans une matrice constituée de polysaccharides dont la synthèse ne semble pas liée au gène icaA. Nous avons mis en evidence les gènes atl et bap codant des protèines de surface impliquées dans la formation de biofilm chez S. aureus. Pour étudier l'ensemble des protéines de surface impliquées, nous avons développé une méthode d'analyse des protéines pariétales et membranaires. Un total de 101 protéines a été identifié dont 51 sont prédites comme protéines de surface et seulement 9 sont cmmunes aux deux fractions. La comparaison des profils protéiques des fractions pariétales, membranaires et intracellulaires a révélé une expression différentielle de 115 protéines dont 74 sont surexprimées en mode sessile et 41 en planctonique. Cette étude a révélé la modification de nombreuses voies métabolliques. Leur analyse permettra de mieux appréhender les mécanismes mis en jeu par S. xylosus lors de sa croissance en biofilm

Une partie conséquente de mon travail a été d'effectuer un crible génétique en utilisant une bibliothèque de mutants générés par insertion aléatoire de Tn5-Sm, un minitransposon bactérien. Le crible a été réalisé dans un contexte défini: celui de mouches-hôtes auxquelles manquait le gène Eater, lequel code un récepteur de phagocytose (Kocks et al., 2005). Dans ces mouches, l'infection n'est plus contrôlée dans l'hémocoele par les hémocytes et les drosophiles mutantes succombent rapidement à une bactériémie. Plusieurs phénotypes bactériens étaient attendus à l'issue de ce crible. Une première catégorie de phénotype prévisible était une virulence accrue, par exemple si les bactéries mutantes devenaientcapables de traverser plus rapidement ou efficacement la barrière intestinale conséquemment à la perte d'un régulateur négatif. Un deuxième type de phénotype attendu était une virulence atténuée pouvant s'expliquer de plusieurs manières: 1- perte de résistance à l'environnement existant dans le lumen intestinal (enzymes digestives et lysozyme, radicaux libres et peptides antimicrobiens induits au niveau de l'épithélium intestinal dans le cadre d'une réponse immunitaire locale de l'hôte); 2- incapacité à traverser la matrice péritrophique; 3-incapacité à envahir les cellules épithéliales (adhésion, pénétration); 4- incapacité à résister aux défenses intracellulaires potentielles; 5- incapacité à sortir du côté basal des entérocytes 6- incapacité à proliférer dans l'hémolymphe ou perte de la résistance à l'action de la réponse immunitairesystémique qui est, quant à elle, fortement induite en l'absence de phagocytose, laquelle empêche chez les mouches sauvages la prolifération des bactéries ayant traversé la paroi intestinale. [...] Dans le cadre d'une infection intestinale, les mouches sauvages (et imd) succombaient en six jours alors que, de manière surprenante, les mouches mutantes de la voie Toll périssaient plus lentement, une situation opposée à celle du modèle de la piqûre septique. Quelques bactéries sont capables de traverser la paroi intestinale mais sont incapables de proliférer à moins que la réponse cellulaire ait été préalablement bloquée. L'épithélium intestinal apparaissait normal à la dissection et la presque totalité des bactéries ingérées étaient tuées dans l'intestin. Après avoir exclu l'hypothèse d'une toxine sécrétée dans le surnageant des bactéries adsorbées sur le filtre sur lequel viennent se nourrir les mouches, nous avons testé l'hypothèse qu'une suractivation de la réponse immunitaire était à l'origine du décès des mouches. La génétique mettant hors de cause les peptides antimicrobiens, la voie Toll n'étant apparemment pas activée dans l'épithélium intestinal, nous avons alors étudié laréponse oxydative induite par l'ingestion de bactéries (Ha et al., 2009), laquelle est capable de tuer les mouches lorsqu'elle n'est pas régulée correctement. Là-aussi, le résultat s'est avéré négatif. En fin de compte, j'ai pu établir que la mort des mouches était due à un état de famine, confirmé par des mesures des réserves métaboliques. Mes travaux ont permis d'établir un nouveau rôle de la voie Toll dans la résistance à la famine, en présence ou absence d'infection, qui sera peut-être à mettre en relation avec un rôle métabolique de la voie Toll consistant à bloquer la voie de réponse à l'insuline lors d'une infection. En conclusion, mes travaux permettent de mieux comprendre les relations hôte-pathogènequi s'établissent lors d'une infection intestinale.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T00:02:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 277525.pdf: 903897 bytes, checksum: 7d856e166a29a1927236c8c628ced144 (MD5) / As lipases e esterases pertencem ao grupo das hidrolases e são enzimas capazes de catalisar a clivagem e formação de ligações ésteres. Essas enzimas são empregadas em diferentes ramos industriais, principalmente na indústria química, farmacêutica e de alimentos. A lipase (AF208229) de Staphylococcus xylosus foi previamente isolada, clonada, seqüenciada e caracterizada. O objetivo deste trabalho foi avaliar a importância do resíduo de aminoácido valina 309 para atividade enzimática desta lipase, modificando a valina 309 por aspartato ou lisina através da PCR mutagênese sitio dirigida. A mutação foi realizada com sucesso e os mutantes (Mut-Asp e Mut-Lys) apresentaram características diferentes da lipase recombinante selvagem (WT-Val) em relação a hidrólise do butirato de p-nitrofenila. Foi observado que a substituição do aminoácido 309 aumentou a atividade das lipases mutantes, principalmente com a presença do aminoácido básico (Mut-Lys). No entanto, a afinidade da enzima ao substrato diminui após a substituição do aminoácido valina, ocasionando aumento em duas vezes do valor de Km para as enzimas mutantes. A atividade ótima para as três lipases recombinantes foi observada em pH 9,0 e a 42°C, sendo que, a Mut-Lys apresentou a maior atividade no pH alcalino. A lipase recombinante selvagem (WT-Val) e as lipases mutantes Mut-Asp e Mut-Lys mostraram ser termoestáveis após incubação a 80°C, visto que não foi observada perda na atividade nos períodos de incubação analisados (10, 20 e 30 min), fato observado pela primeira vez para lipases do gênero Staphylococcus. A imobilização de enzimas é uma estratégia bastante utilizada para modificar a atividade enzimática e propiciar o uso de biocatalisadores nos processos industriais. A esterase de Lactobacillus plantarum foi previamente isolada, clonada, seqüenciada e caracterizada. Neste trabalho, esta esterase foi expressa em E. coli e o lisado celular foi imobilizado no suporte hidrofóbico polipropileno (Accurel MP1000) pelo método de adsorção e apresentou eficiência de 68,7%. A enzima imobilizada mostrou ser mais estável nas diferentes temperaturas testadas, como também, apontou ser mais termoestável que o lisado celular de enzima livre, mostrando que o processo de imobilização ocasiona restrição na mobilidade conformacional e maior rigidez na estrutura da enzima, impedindo a desnaturação e a perda da capacidade catalítica. A enzima imobilizada apresentou menor atividade específica e menor afinidade pelo substrato em relação a enzima livre, frente a hidrólise do butirato de p-nitrofenila. Não foi observado desprendimento de proteína do suporte após 3 ciclos contínuos e a atividade de hidrolise da enzima imobilizada foi estável até a terceira semana após ser imobilizada. / The lipases and esterases belong to the group of hydrolases and these enzymes are capable of catalyzing the cleavage and formation of ester bonds. These enzymes are used in different industrial fields, mainly in the chemical, pharmaceutical and food industries. Lipase (AF208229) of Staphylococcus xylosus was previously isolated, cloned, sequenced and characterized. The objective of this study was to evaluate the importance of the amino acid valine 309 for activity of lipase, changing valine 309 to aspartate or lysine by PCR site directed mutagenesis. The mutation was successfully performed and the mutant (Mut and Mut-Asp-Lys) had different characteristics from recombinant lipase wild (WT-Val) for the hydrolysis of butyrate p-nitrophenyl. It was observed that the substitution of amino acid 309 increased the activity of lipase mutants, especially with the presence of basic amino acid (Mut-Lys). However, the affinity of the enzyme to the substrate decreases after substitution of the amino acid valine, leading to increased at twice the value of Km for mutant enzymes. The optimum activities for the three recombinant lipases were observed at pH 9.0 and 42° C, and the Mut-Lys showed the highest activity at alkaline pH. Recombinant lipase wild-type (WT-Val) and the mutants Mut-Asp and Mut-Lys proved to be heat-stable after incubation at 80°C, whereas there was no loss of activity in the incubation periods examined (10, 20 and 30 min ). This result was first observed for lipases of Staphylococcus. The immobilization of enzymes is a strategy often used to modify the enzymatic activity and promote the use of biocatalysts in industrial processes. The esterase of Lactobacillus plantarum was previously isolated, cloned, sequenced and characterized. In this work, this esterase was expressed in E. coli and the cell lysate was immobilized on the support hydrophobic polypropylene (Accurel MP1000) by the method of adsorption and presented efficiency of 68.7%. The immobilized enzyme was more stable at different temperatures, and also was more thermostable than the cell lysate of free enzyme, showing that the immobilization process can causes restricted mobility and greater rigidity in the structure of the enzyme, preventing the denaturation and loss of catalytic ability. The immobilized enzyme showed a lower specific activity and a lower affinity by the substrate than the free enzyme for hydrolysis of butyrate p-nitrophenyl. It was not observed detachment of protein support after 3 continuous cycles and the hydrolysis activity of immobilized enzyme was stable until the third week after being immobilized.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T07:00:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 281745.pdf: 3514340 bytes, checksum: f888864f9bbaf44bdf369ae8dec134e3 (MD5) / Esterases e lipases pertencem ao grupo das hidrolases e são enzimas que catalisam a clivagem e a síntese de ligações éster, sendo um grupo de enzimas biotecnologicamente relevantes com inúmeras aplicações em indústrias de alimentos, laticínios, detergentes e farmacêuticas. O objetivo deste trabalho foi clonar, expressar em Escherichia coli, purificar e caracterizar bioquimicamente uma lipase recombinante de Staphylococcus xylosus e uma esterase recombinante de Lactobacillus plantarum. O gene da lipase (1084 pb) foi amplificado de uma cepa de S. xylosus isolada de salame fermentado naturalmente e introduzido no vetor de expressão pET14b para expressar a proteína fusão recombinante (lipase contendo a cauda de His6). A lipase recombinante de S. xylosus foi purificada por cromatografia de afinidade em um sistema HPLC. A lipase recombinante é um monômero em solução, como determinado pela cromatografia de exclusão molecular. Ela apresentou alta atividade em pH 9,0 e 42°C para acetato de p-nitrofenila e butirato de p-nitrofenila entre vários ésteres testados (pNPC2, pNPC4, pNPC10, pNPC12, pNPC14, pNPC16, pNPC18). Além disso, apresentou uma interessante estabilidade térmica após incubação por 10 min a 95°C, mantendo 77 % de sua atividade inicial. O gene da esterase de Lactobacillus plantarum (1014 pb) foi amplificado e clonado no vetor de expressão pET14b para expressar em Escherichia coli a proteína contendo a cauda His6. A esterase recombinante de Lactobacillus plantarum foi purificada em resina Ni-NTA e apresentou uma massa molecular aparente de aproximadamente 38 kDa. A enzima apresentou a atividade enzimática mais elevada em pH 6,0 e 40°C e preferência pelo butirato de p-nitrofenila, embora tenha hidrolisado mais eficientemente o acetato de p-nitrofenila. Além disso, este estudo apresenta, pela primeira vez, dados de dicroísmo circular sobre a estrutura secundária de uma esterase de Lactobacillus plantarum.