A hiperplasia adrenal congênita (HAC), mais comumente causada por deficiência da 21-hidroxilase (21OH), apresenta um espectro de manifestações clínicas, que varia desde virilização da genitália externa de fetos femininos com perda de sal neonatal até manifestações hiperandrogênicas que se iniciam tardiamente. A forma clássica, de maior gravidade, é subdividida em perdedora de sal (PS) e virilizante simples (VS). A doença é elegível para inclusão em programas de triagem neonatal, e o principal problema enfrentado é a taxa elevada de resultados falso-positivos (FP), de até 1%. Cerca de 50-70% destes são atribuídos ao estresse neonatal por doença, à prematuridade e ao baixo peso ao nascimento (PN). Em 7-17% dos FP, a dosagem da 17OHP no teste confirmatório pelo método de radioimunoensaio (RIE) no soro, um dos mais utilizados em nosso país, permanece alterada. A adição da dosagem de outros esteroides como o 21-deoxicorisol (21-DF) e, sobretudo, a utilização de metodologia mais específica, como a cromatografia líquida com detecção por espectrometria de massas (CL-MS/MS), pode aumentar o valor preditivo positivo (VPP). O estudo molecular do gene CYP21A2 também pode ser útil na confirmação diagnóstica, porém com maior custo e complexidade. No final de 2013, a triagem da HAC-21OH foi incluída no Programa Nacional de Triagem Neonatal (PNTN). A eficácia de dosagens hormonais no soro por diferentes metodologias como teste confirmatório não tem sido estudada na literatura. Objetivos: determinar o esteroide adrenal cuja dosagem oferece maior especificidade como teste confirmatório na triagem neonatal da HAC. Determinar os valores de referência da 17OHP e do 21-DF na população brasileira por CL-MS/MS. Casuística: 708.437 recém-nascidos (RN) submetidos à triagem no laboratório da APAE-São Paulo de janeiro de 2014 a dezembro de 2015. Métodos: os RNs que apresentaram 17OHP neonatal acima do valor de referência para o P99,5 para o PN foram convocados para dosagem dos esteroides no soro (RIE e CL-MS/MS). Os RNs com resultados 17OHP >= 10 ng/ml (CL-MS/MS) no soro foram convocados para estudo molecular do CYP21A2. Resultados: O VPP do teste de triagem no papel de filtro (P99,5) foi 3% e a taxa de FP de 0,037%; 65/252 (25%) resultados permaneceram alterados na dosagem 17OHP/RIE (VPP 30%) e 32/289 (11%) continuaram alterados após o teste confirmatório 17OHP/CL-MS/MS (VPP 49%); 58 casos de HAC clássica foram diagnosticados (47PS; 11VS), 57 pela triagem e 1 falso-negativo (forma VS), resultando em incidência de 1:12.200. Outros 32 casos assintomáticos e com 17OHP/CL-MS/MS elevada (indeterminados) foram acompanhados até normalização ou confirmação diagnóstica da forma não clássica da HAC pelo genótipo do CYP21A2. A relação (17OHP+delta4)/cortisol foi a que apresentou maior área sob a curva ROC, e o ponto de corte >= 9,7 detectou todos os portadores de forma clássica (S=100%). Valores entre 9,7 e 24,8 compreenderam pacientes com a forma VS, forma não clássica (NC) e não afetados e o ponto de corte >= 24,9 apresentou VPP de 100% (E=100%) para as formas clássicas da HAC. Em 10 casos com resultados indeterminados da 17OHP, o estudo molecular permitiu a alta do seguimento neonatal (4 portadores da forma NC; 4 sem mutações identificadas e 2 heterozigotos). Conclusão: A dosagem no soro da 17OHP por CL-MS/MS foi superior à dosagem por RIE. A aplicação dos pontos de corte obtidos pela curva ROC dos diferentes testes confirmatórios no soro permitiria a resolução de 30/32 indeterminados, sendo que a relação (17OHP+delta4)/cortisol foi especialmente útil nestes casos. O estudo molecular foi importante, sobretudo, para elucidação dos casos indeterminados / Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is most commonly caused by 21- hydroxylase deficiency and clinical presentation depends on the degree of enzyme activity impairment, varying from virilization of external genitalia in females and neonatal salt loss and hyperandrogenic signs in both genders. The classical form is subdivided in salt-wasting (SW) and simple virilizing (SV). The disease is suitable for neonatal screening programs. The high false-positive (FP) result rate, up to 1%, is the main issue, in most cases attributed to either prematurity or neonatal stress caused by coexistence of stress conditions. In serum confirmatory tests, 17-hydroxy-progesterone (17OHP) levels by radioimmunoassay (RIA), one of the main methodologies performed in our country, remains elevated in 7-17% of cases. The addition of other steroids, such as 21-deoxycortisol (21-DF), and the use of a more specific methodology, liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), increase de positive predictive value (PPV) of confirmatory tests. The CYP21A2 genotyping is also useful in diagnosing CAH, although its higher cost and complexity are potential limitations. Objectives: to determine the adrenal steroid with higher specificity to confirm CAH diagnosis in the newborn screening. To determine the reference values of serum 17OHP and 21-DF by LC-MS/MS in the Brazilian population in neonatal period. Patients: 708,437 newborns (NBs) screened in Laboratório da APAE SÃO PAULO between January 2014 and December 2015. Methods: NBs with neonatal 17OHP (N17OHP) on filter paper above the 99.5th percentile were recalled to serum sample collection and steroids dosage by RIA and LC-MS/MS; Molecular CYP21A2 analysis was offered to those with 17OHP >= 10 ng/ml (LC-MS/MS). Results: FP rate on filter paper was 0.037% and these NBs were recalled for serum tests: 65/252 (25%) results of 17OHP by RIA and 32/289 (11%) of 17OHP by LC-MS/MS remained altered. PPV of RIA and LC-MS/MS were 30% and 49%, respectively. Fifty-eight CAH classical cases were diagnosed (47SW;11SV) and other 32 asymptomatic NBs presented increased serum 17OHP by LC-MS/MS and were followed until diagnostic elucidation. In the ROC curves analyses between false and true-positives, 17OHP/LC-MS/MS had the highest accuracy as a single steroid measurement, for which the 48.3 ng/ml cutoff had 100% sensitivity for classical forms. Serum 21DF was not superior than 17OHP/LC-MS/MS. The product of (17OHP+delta4)/cortisol ratio presented the highest accuracy: the cutoff of 24.9 had a PPV of 100% to detect saltwasting form, while values between 9.7-24.8 comprised FP, NC and SV patients and molecular tests could be useful for differential diagnosis in this latter group. Conclusions: Serum 17OHP by LC-MS/MS was superior than 17OHP by RIA. The efficacy of confirmatory tests was improved using 17OHP by LC-MS/MS and, for the asymptomatic NBs with undetermined results, the (17OHP+delta4)/cortisol ratio presented the highest diagnostic efficacy. The CYP21A2 genotyping was particularly useful in asymptomatic NBs with persistently increased serum 17OHP

A hiperplasia adrenal congênita (HAC), mais comumente causada por deficiência da 21-hidroxilase (21OH), apresenta um espectro de manifestações clínicas, que varia desde virilização da genitália externa de fetos femininos com perda de sal neonatal até manifestações hiperandrogênicas que se iniciam tardiamente. A forma clássica, de maior gravidade, é subdividida em perdedora de sal (PS) e virilizante simples (VS). A doença é elegível para inclusão em programas de triagem neonatal, e o principal problema enfrentado é a taxa elevada de resultados falso-positivos (FP), de até 1%. Cerca de 50-70% destes são atribuídos ao estresse neonatal por doença, à prematuridade e ao baixo peso ao nascimento (PN). Em 7-17% dos FP, a dosagem da 17OHP no teste confirmatório pelo método de radioimunoensaio (RIE) no soro, um dos mais utilizados em nosso país, permanece alterada. A adição da dosagem de outros esteroides como o 21-deoxicorisol (21-DF) e, sobretudo, a utilização de metodologia mais específica, como a cromatografia líquida com detecção por espectrometria de massas (CL-MS/MS), pode aumentar o valor preditivo positivo (VPP). O estudo molecular do gene CYP21A2 também pode ser útil na confirmação diagnóstica, porém com maior custo e complexidade. No final de 2013, a triagem da HAC-21OH foi incluída no Programa Nacional de Triagem Neonatal (PNTN). A eficácia de dosagens hormonais no soro por diferentes metodologias como teste confirmatório não tem sido estudada na literatura. Objetivos: determinar o esteroide adrenal cuja dosagem oferece maior especificidade como teste confirmatório na triagem neonatal da HAC. Determinar os valores de referência da 17OHP e do 21-DF na população brasileira por CL-MS/MS. Casuística: 708.437 recém-nascidos (RN) submetidos à triagem no laboratório da APAE-São Paulo de janeiro de 2014 a dezembro de 2015. Métodos: os RNs que apresentaram 17OHP neonatal acima do valor de referência para o P99,5 para o PN foram convocados para dosagem dos esteroides no soro (RIE e CL-MS/MS). Os RNs com resultados 17OHP >= 10 ng/ml (CL-MS/MS) no soro foram convocados para estudo molecular do CYP21A2. Resultados: O VPP do teste de triagem no papel de filtro (P99,5) foi 3% e a taxa de FP de 0,037%; 65/252 (25%) resultados permaneceram alterados na dosagem 17OHP/RIE (VPP 30%) e 32/289 (11%) continuaram alterados após o teste confirmatório 17OHP/CL-MS/MS (VPP 49%); 58 casos de HAC clássica foram diagnosticados (47PS; 11VS), 57 pela triagem e 1 falso-negativo (forma VS), resultando em incidência de 1:12.200. Outros 32 casos assintomáticos e com 17OHP/CL-MS/MS elevada (indeterminados) foram acompanhados até normalização ou confirmação diagnóstica da forma não clássica da HAC pelo genótipo do CYP21A2. A relação (17OHP+delta4)/cortisol foi a que apresentou maior área sob a curva ROC, e o ponto de corte >= 9,7 detectou todos os portadores de forma clássica (S=100%). Valores entre 9,7 e 24,8 compreenderam pacientes com a forma VS, forma não clássica (NC) e não afetados e o ponto de corte >= 24,9 apresentou VPP de 100% (E=100%) para as formas clássicas da HAC. Em 10 casos com resultados indeterminados da 17OHP, o estudo molecular permitiu a alta do seguimento neonatal (4 portadores da forma NC; 4 sem mutações identificadas e 2 heterozigotos). Conclusão: A dosagem no soro da 17OHP por CL-MS/MS foi superior à dosagem por RIE. A aplicação dos pontos de corte obtidos pela curva ROC dos diferentes testes confirmatórios no soro permitiria a resolução de 30/32 indeterminados, sendo que a relação (17OHP+delta4)/cortisol foi especialmente útil nestes casos. O estudo molecular foi importante, sobretudo, para elucidação dos casos indeterminados / Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is most commonly caused by 21- hydroxylase deficiency and clinical presentation depends on the degree of enzyme activity impairment, varying from virilization of external genitalia in females and neonatal salt loss and hyperandrogenic signs in both genders. The classical form is subdivided in salt-wasting (SW) and simple virilizing (SV). The disease is suitable for neonatal screening programs. The high false-positive (FP) result rate, up to 1%, is the main issue, in most cases attributed to either prematurity or neonatal stress caused by coexistence of stress conditions. In serum confirmatory tests, 17-hydroxy-progesterone (17OHP) levels by radioimmunoassay (RIA), one of the main methodologies performed in our country, remains elevated in 7-17% of cases. The addition of other steroids, such as 21-deoxycortisol (21-DF), and the use of a more specific methodology, liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), increase de positive predictive value (PPV) of confirmatory tests. The CYP21A2 genotyping is also useful in diagnosing CAH, although its higher cost and complexity are potential limitations. Objectives: to determine the adrenal steroid with higher specificity to confirm CAH diagnosis in the newborn screening. To determine the reference values of serum 17OHP and 21-DF by LC-MS/MS in the Brazilian population in neonatal period. Patients: 708,437 newborns (NBs) screened in Laboratório da APAE SÃO PAULO between January 2014 and December 2015. Methods: NBs with neonatal 17OHP (N17OHP) on filter paper above the 99.5th percentile were recalled to serum sample collection and steroids dosage by RIA and LC-MS/MS; Molecular CYP21A2 analysis was offered to those with 17OHP >= 10 ng/ml (LC-MS/MS). Results: FP rate on filter paper was 0.037% and these NBs were recalled for serum tests: 65/252 (25%) results of 17OHP by RIA and 32/289 (11%) of 17OHP by LC-MS/MS remained altered. PPV of RIA and LC-MS/MS were 30% and 49%, respectively. Fifty-eight CAH classical cases were diagnosed (47SW;11SV) and other 32 asymptomatic NBs presented increased serum 17OHP by LC-MS/MS and were followed until diagnostic elucidation. In the ROC curves analyses between false and true-positives, 17OHP/LC-MS/MS had the highest accuracy as a single steroid measurement, for which the 48.3 ng/ml cutoff had 100% sensitivity for classical forms. Serum 21DF was not superior than 17OHP/LC-MS/MS. The product of (17OHP+delta4)/cortisol ratio presented the highest accuracy: the cutoff of 24.9 had a PPV of 100% to detect saltwasting form, while values between 9.7-24.8 comprised FP, NC and SV patients and molecular tests could be useful for differential diagnosis in this latter group. Conclusions: Serum 17OHP by LC-MS/MS was superior than 17OHP by RIA. The efficacy of confirmatory tests was improved using 17OHP by LC-MS/MS and, for the asymptomatic NBs with undetermined results, the (17OHP+delta4)/cortisol ratio presented the highest diagnostic efficacy. The CYP21A2 genotyping was particularly useful in asymptomatic NBs with persistently increased serum 17OHP