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Transportstudien von Nanopartikeln an verschiedenen Blut-Hirn-Schranke-Modellen in-vitro

Schwedat, Anke. Unknown Date (has links)
Universiẗat, Diss., 2006--Frankfurt (Main).
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Identification of accessible and closed substrate binding sites in the outward open cleft of rat Organic Cation Transporter 1 (rOCT1) / Identifizierung von zugänglichen und unzugänglichen Substratbindungsstellen in der nach außen offenen Konformation des organischen Kationentransporters rOCT1

Rehman, Saba January 2018 (has links) (PDF)
The present study was conducted on the rOCT1, a member of SLC22 family. Structurally, it consists of 12 membrane spanning α-helices with both N- and C-termini intracellular. Studies done so far, through tracer uptake and inhibition, reconstitution of rOCT1 in nanodiscs and proteoliposomes and voltage-clamp fluorometry, have identified the main amino acids in the cleft of rOCT1 that interact in a critical manner with the substrates/inhibitors either directly or indirectly. Homology modeling studies have also supported these observations. In the present study we aimed at measuring the binding of substrates MPP+ and TEA+ to rOCT1 at 0oC in order to establish the amino acids in the cleft region that interact with the substrate when the transporter is frozen in the outward-open conformation. Previously identified crucial amino acids (Asp475, Phe160, Leu447, Arg440, Trp218 and Tyr222) were selected for the study. rOCT1 wild-type and its mutants were stably expressed in HEK293 cells and these cells were used for the binding measurements with the radioactive substrate (MPP+ or TEA+) at 0°C in Mg-Ca-PBS buffer as described in “Materials and Methods” section in detail. rOCT1 wild-type revealed for MPP+-binding a KD which was not significantly different from the corresponding Km value. Also, after addition of 10 nM non-radioactive MPP+, an initial increase of about 20% in bound MPP+ was observed. The results indicate that the Km for transport is dependent on the binding of MPP+ to the outward-open conformation and hints at the possibility of allosteric interaction between the binding sites. Mutations at position Trp218, Phe160 and Asp475 resulted in a change in the KD value. Trp218 mutations also showed an allosteric increase similar to the rOCT1 wild-type. This study suggests that these amino acids are located at a critical position in the outward-open conformation for MPP+ transport. TEA+-binding could not be observed in rOCT1 wild-type, indicating that the binding site is perhaps inaccessible for TEA+ in frozen outward-open state. The mutants D475E, F160A, L447F, R440K and Y222F showed a very low affinity binding with a very high KD value as compared to the corresponding Km values indicating that the transporter might have different affinities for extra-cellular binding alone and for the complete transport process especially if temperature is the limiting factor. Substrate inhibition studies done using both MPP+ and TEA+ have confirmed the existence of overlapping binding sites for these two ligands. This study has confirmed the direct interaction of Trp218, Phe160, Asp475 with MPP+ and Phe160, Asp475, Leu447, Arg440 and Tyr222 with TEA+ in the outward-open conformation. / In der vorgelegten Arbeit werden Untersuchungen am organischen Transporter rOCT1, einem Mitglied der SLC22 Familie, berichtet. Frühere Untersuchungen beinhalteten Transportmessungen mit radioaktiven Substanzen und Hemmstoffen, Transport- und Bindungsmessungen nach Rekonstitution in Nanodisken und Proteo¬liposomen und Voltage-Clamp-Fluorimetrie-Analysen an rOCT1 und rOCT1 Mutanten. Sie führten zur Identifizierung wichtiger Aminosäuren im Bindungsspalt von rOCT1, welche für die Interaktion mit Substraten oder Hemmstoffen wichtig sind. Homologiemodelle wurden zur Interpretationen der Ergebnisse herangezogen. In der vorgelegten Arbeit haben wir die Binding der Substrate MPP+ und TEA+ an rOCT1 bei 0°C gemessen um herauszufinden welche Aminosäuren in der Spaltregion von rOCT1 mit diesen Substraten interagieren, wenn der Transporter in der nach außen offenen Konfor¬mation „eingefroren“ ist. Für die Untersuchungen wurden Aminosäuren ausgewählt, deren Relevanz für den Transport von MPP+ und TEA+ in früheren Untersuchungen erkannt worden war. Es handelt sich um die Aminosäuren Asp475, Phe160, Leu447, Arg440, Trp218 und Tyr222. rOCT1 Wildtyp und rOCT1 Mutanten wurden stabil in HEK293 Zellen exprimiert. Mit diesen Zellen wurden bei 0oC Bindungsmessungen mit radioaktiv markiertem MPP+ und TEA+ unter Verwendung eines Magnesium und Calcium erhaltenen Puffers. Für die MPP+-Bindung an den rOCT1 Wildtyp ergab sich eine µmolare Dissoziationskonstante (KD), die keinen signifikanten Unterschied zum früher gemessenen Km Wert aufweist. Dieses Ergebnis zeigt, dass der Km von der MPP+-Bindung an die nach außen offene Konformation abhängig ist. Bei der Zugabe von 10 nM nicht-radioaktivem MPP+ war beim rOCT1 Wildtyp die Bindung von radioaktiv markiertem MPP+ um 20% erhöht. Dies deutet auf einen allosterischen Effekt einer hochaffinen MPP+ Bindungsstelle auf die direkt am Transport beteiligte µmolare Bindungsstelle hin. Mutationen der Aminosäuren Trp218, Phe160 und Asp475 führten zu Änderungen des KD Wertes für die MPP+ Bindung. Für die Mutanten von Trp218 wurde ein ähnlicher allosterischer MPP+ Effekt wie beim rOCT1 Wildtyp beobachtet. Die Unter¬suchungen weisen darauf hin, dass diese drei Aminosäuren in kritischen Positionen für die MPP+-Bindung von außen befinden. Bei 00C konnte beim rOCT1 Wildtyp keine TEA+-Bindung nachgewiesen werden. Dies legt den Schluss nahe, dass die TEA+-Bindungsstelle in der „eingefrorenen“ nach außen gerichteten Konformation unzugänglich ist. In Gegensatz dazu zeigen die Mutanten D475E, F160A, L447F, R440K und Y222F eine sehr niederaffine TEA+-Bindung mit hohen KD Werten, die sich stark von den entsprechenden Km Werten unterscheiden. Durch Experimente, bei denen die Bindung von MPP+ durch TEA+ bzw. die Bindung von TEA+ durch MPP+ gehemmt wurde, wurde die Hypothese bestätigt, dass sich die Bindungsstellen für MPP+ und TEA+ überlappen. Unsere Untersuchungen deuten darauf hin, dass in der nach außen gerichteten Konformation von rOCT1 Trp218, Phe160 und Asp475 direkt mit MPP+ und Phe160, Asp475, Leu447, Arg440 und Tyr222 direkt mit TEA+ interagieren.
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Untersuchungen zum radialen Abscisinsäure- und Wassertransport in Wurzeln von Helianthus annuus L. und Zea mays L.

Hose, Eleonore January 2000 (has links) (PDF)
Mit den Experimenten dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass ein Phytohormon wie Abscisinsäure mit dem "Solvent-drag" des Wasserflusses apoplastisch durch den Wurzelzellwandbereich in die Xylemgefäße transportiert werden kann. Es konnte ein Bypass-Fluss für ABA durch den gesamten Zellwandapoplasten, auch durch lipophile Barrieren wie Exo- und Endodermis nachgewiesen werden. Dies ist durch die speziellen Moleküleigenschaften von Abscisinsäure möglich: (i) der geringe Durchmesser des Moleküls (8 - 11 nm) und (ii) die hohe Lipophilie von ABA bei schwach sauren pH-Werte. Mit einer Penetration apoplastischer Barrieren ist demnach zu rechnen. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Ausbildung solcher lipophilen Zellwandnetze einen signifikanten Einfluss auf den apoplastischen ABA-Transport besitzt. Die Ausbildung einer Exodermis in Mais, wie sie unter natürlichen Bedingungen zu beobachten ist, konnte den ABA-Fluss in das Xylem um die Faktoren 2 bis 4 reduzieren. Da gleichzeitig eine Verminderung der hydraulischen Wurzelleitfähigkeit um denselben Betrag auftrat, blieb das Wurzel-Spross-ABA-Signal, die Phytohormonkonzentration, im Xylem gleich. Die zu den Stomata geleitete Information über den Wasserzustand der Wurzel änderte sich also nicht. Im natürlichen System ist sogar eine Verstärkung des Signals zu erwarten, da eine Exodermis nicht als Aufnahme-Barriere für gewebeproduzierte ABA wirkt. Gleichzeitig verringert sie den Verlust von apoplastischer ABA an die Rhizosphäre. Außerdem wird der Wasserverlust aus dem Gewebe durch eine Exodermis signifikant reduziert wird. Somit sind solche Wurzeln gut an die Bedingungen eines eintrocknenden Bodens angepasst. Apoplastische Barrieren sind demnach, neben membran-lokalisierten Tranportern, wichtige Parameter für die Beurteilung von Wurzeltransporteigenschaften für Wasser und darin gelöste Substanzen. Der Beitrag der apoplastischen Komponente zum Gesamt-ABA-Transport ist abhängig von der untersuchten Pflanzenart, der aktuellen Transpirations- oder Wasserflussrate und von Umwelteinflüssen wie erhöhter ABA-Konzentration im Wurzelgewebe (z.B. durch Trockenstress), pH-Wert der Rhizosphäre und den Ernährungsbedingungen der Pflanze. Erhöhter radialer Wasserfluss, erhöhte ABA-Wurzelgewebegehalte und niedriger pH-Wert der Rhizosphäre verstärken den apoplastischen Bypass-Fluss unter physiologischen Bedingungen. Geringe Wassertransportraten, niedrige ABA-Konzentrationen im Gewebe, alkalische pH-Werte der Rhizosphäre und Ammoniumernährung verstärken dagegen den symplastischen Beitrag zum ABA-Transport. In der vorliegenden Arbeit konnten die sich widersprechenden Theorien bezüglich des ABA-Effektes auf die hydraulische Leitfähigkeit von Wurzeln erklärt werden. ABA erhöht über einen Zeitraum von 2 Stunden die Zellleitfähigkeit (Lp) mit einem Maximum 1 Stunde nach ABA-Inkubation. Dies wirkt sich in einem verstärktem Lpr von intakten Wurzelsystemen aus, das einem ähnlichen Zeitmuster folgt. Pflanzen sind demnach in der Lage, mittels ABA den zellulären Wassertransportweg reversibel zu optimieren, um so unter mildem Trockenstress, wie er in einem gerade eintrocknenden Boden auftritt, die Pflanze mit ausreichend Wasser zu versorgen. Tritt ein länger andauernder Wassermangel ein, versperrt die Pflanze diesen Weg wieder. Dieser transiente Effekt erklärt auch die aus der Literatur bekannten stimulierenden und inhibierenden ABA-Wirkungen. Durch den verstärkten Wasserfluss zu Beginn der Stresssituation erzeugt ABA auf diese Weise ein sich selbst verstärkendes, wurzelbürtiges Hormonsignal in den Spross. Das Blatt erreicht in effektiver Weise eine ABA-Menge, die ausreichend ist, um die Stomata zu schließen. Es folgt eine Reduktion der Transpiration. Eine weiter andauernde Erhöhung des symplastischen Wassertransportweges wäre ohne physiologische Bedeutung. Regulierende Membranstrukturen für diesen Vorgang könnten ABA-sensitive Wasserkanäle (Aquaporine) der Plasmamembran sein. Es wurde gezeigt, dass der Rezeptor für diesen Vorgang innerhalb von corticalen Maiswurzelzellen lokalisiert und hochspezifisch für (+)-cis-trans-ABA ist. Die Signaltransduktion für diesen Kurzzeiteffekt erfolgt nicht mittels verstärkter Aquaporintranskription, könnte aber über ABA-induzierte Aktivierung (Phosphorylierung), oder Einbau von Aquaporinen in die Zellmembran ablaufen. Der Abscisinsäure-Transport ist ein komplexer Vorgang. Er wird beeinflusst durch Umwelteinflüsse, Wurzelanatomie, ist gekoppelt mit dem Wasserfluss und durch sich selbst variierbar. Herkömmliche Vorstellungen einer simplen Hormondiffusion können diesen regulierbaren Vorgang nicht mehr beschreiben. Pflanzen besitzen ein ABA-Transportsystem, das schnell, effektiv und an sich verändernde Umweltbedingungen adaptierbar ist. / The experimental work of the presented study has been able to show, for the first time, that a phytohormone like ABA can be transported apoplastically into xylem vessels by solvent-drag of the water flow. For ABA, a bypass-flow throughout the whole cell wall apoplast, including lipophilic barriers like exo-and endodermis, could be demonstrated. This may be due to the particular properties of the 264 Da ABA-molecule: (i) the small diameter of the molecule (8 to 11 nm) and (ii) the high lipophily of the uncharged ABA under physiological conditions. Conclusively, a penetration of apoplastic barriers is supposed to be possible. Furthermore, this study shows the development of such lipophilic cell wall-nets should have significant influence on apoplastic ABA-transport-properties. The formation of an exodermis in maize, as it occurs under natural conditions, was able to reduce the ABA-flow into the xylem by factors of 2 up to 4. As, simultaneously, the root-hydraulic conductivity was decreased by the same rate, the root-to-shoot ABA-signal, the phytohormone concentration in the xylem, remained constant. The information about the root-water-status addressed to the guard cells has not changed, therefore. In the natural environment even an increase of this signal is to be expected, as exodermal layers are no uptake-barriers for the tissue-produced ABA. On the contrary, an exodermis will retard the leakage of ABA to the rhizosphere. At the same time, roots are more effectively adapted to drought because water loss from exodermal roots is also reduced significantly. Apoplastic barriers are, therefore, beside membrane-located transport-proteins, the important parameters for determining root-transport-properties for water and solutes. The contribution of the apoplastic component to the entire ABA-transport depends on the plant species investigated, the actual transpiration- or water-flow rate and on external conditions like high ABA-concentrations in the root tissue (e.g. after drought), pH of the rhizosphere, and the nutrient status of the plant. Increased radial water-flow, raised ABA-contents of the root tissue, and a low pH of the rhizosphere intensified the apoplastic bypass-flow under physiological conditions. Low water-transport rates, low ABA tissue-contents, alkaline pH-values in the rhizosphere and ammonium as the only N-source, on the other hand, increased the symplastic contribution to the ABA-transport. In the presented study, the controversal dispute concerning the ABA-effect on root hydraulic conductivity could be settled. ABA raises cell hydraulic conductivity (Lp) for 2 h with a maximum after 1 h of ABA-application. This results in an increased Lpr (hydraulic conductivity of intact root systems), directed by a similar time-pattern. So, by ABA plants are able to reversibly optimise the cellular transport path of water to support the plant under mild drought stress with sufficient water. However, if water deficiency continues, plants again close this additional symplastic pathway. This transient ABA-effect explains both stimulating and inhibiting ABA-actions, as known from literature. At the beginning of a stress situation ABA induces by an increased water flow a self-intensifying root-to-shoot-signal. Thus, in an effective way the leaf achieves a sufficient amount of ABA in order to close the stomata. A reduction in transpiration follows. Further continuous stimulation of the symplastic water transport path would be without any physiological meaning. Membrane structures, responsible for regulating this mechanism may be ABA-responsive water channels (aquaporins) in the plasma membrane. It has been shown that the receptor for regulating these channels is localised inside the cortical cells of maize roots and highly specific for (+)-cis-trans-ABA. Signal transduction for this short-time effect is not mediated by intensified aquaporin-transcription, but there may be evidence of ABA-induced regulation by channel activation (phosphorylation) or by incorporation of aquaporins into cell membranes. The transport of abscisic acid is a complex process modified by environmental conditions, root anatomy, coupled with the water flow, and variable by itself. Customary ideas about a simple hormone diffusion are not apt to describe this complex process anymore. Plants possess an ABA-transport system, which is fast, effective, and adaptable to changing environmental conditions.
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Micro-Imaging Employed to Study Diffusion and Surface Permeation in Porous Materials

Hibbe, Florian 01 February 2013 (has links) (PDF)
This thesis summarizes experimental results on mass transport of small hydrocarbons in micro-porous crystals obtained via interference microscopy (IFM). The transport process has been investigated in three difffferent materials with difffferent pore structures : the metal-organic framework Zn(tbip) with one-dimensional pores, a FER type zeolite with two-dimensional anisotropic pore structure and zeolite A, a LTA type material with isotropic three-dimensional pore structure. Mass transport is described in terms of diffffusivity and surface permeability, both derived from the detected transient concentration profiles. The results on intra-crystalline diffffusion are discussed under consideration of the influences of pore diameter and molecule diameter, which are both found to have a strong influence on the diffffusivity. Based on experimental results measured on the Zn(tbip) material, a new model for the description of surface barriers is developed and proved by experiment. It is demonstrated that the observed surface barrier is created by the total blockage of a large number of pore entrances at the surface and not by a homogeneous surface layer.
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Mass Transport in Nanoporous Materials: New Insights from Micro-Imaging by Interference Microscopy

Binder, Tomas 22 October 2013 (has links) (PDF)
This thesis presents the recent progress of diffusion measurements in nanoporous host systems by micro-imaging. Interference microscopy is applied as a powerful tool to record transient, intracrystalline concentration profiles of different sorbate species in the porous framework of two different zeolites, viz. ZSM-5 (MFI) and ZSM-58 (DDR). These profiles, yielding high temporal and spatial resolutions of about 10 s and 0.45 μm, follow the change of the refractive index of the host-guest system during uptake and release of certain guest molecules. With the thus accessible changes of concentration and particle fluxes, mass transport parameters, such as intracrystalline diffusivity and surface permeability, can be obtained by the use of the very fundamental equations on diffusion. Additionally, in two examples of never before performed types of experiments, further insights into challenging fields of host-guest interactions are provided: The well known phase transition in MFI type zeolites covering high benzene loadings is investigated in a single crystal study, allowing to follow the change of the sorbate phase in great detail. Furthermore, in DDR zeolites, a new way of data analysis facilitates to study the uptake and release of binary mixtures. Here, from the two-dimension profiles obtained by interference microscopy, the local concentrations of the sorbate species could be retrieved by using the so-called ideal adsorbed solution theory.
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Indirekt-detektierte 13C NMR Mikroskopie: In vivo Untersuchungen über Synthese und Transport von Saccharose in Ricinus communis L. Keimlingen

Heidenreich, Michael. January 1999 (has links)
Ulm, Univ., Diss., 1999.
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Charakterisierung von zwei Na+-Phosphat-Kotransportern des Typs NaPi-IIb aus dem Zebrafisch (Brachydanio rerio) und die Regulation durch Antisense-Transkripte

Nalbant, Perihan. Unknown Date (has links)
Universiẗat, Diss., 2000--Dortmund. / Dateiformat: PDF.
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Functional and structural characterization of a yeast membrane protein involved in the secretory pathway

Votsmeier, Christian. Unknown Date (has links) (PDF)
Techn. University, Diss., 2002--Berlin.
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Osmosensorische Eigenschaften des Glycinbetain-Transporters BetP aus Corynebacterium glutamicum

Schiller, Dirk. Unknown Date (has links) (PDF)
Universiẗat, Diss., 2004--Köln.
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Der Nährstofftransport im Fernleitungssystem des Xylem und dessen Beeinflussung durch Transpiration bei Ricinus und Pappel

Gilmer, Frank. Unknown Date (has links) (PDF)
Universiẗat, Diss., 2004--Heidelberg.

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