Malgré les avancées considérables de la cancérologie, de nouvelles thérapies sont toujours recherchées étant donné les effets secondaires des traitements actuels. Peu connue, la virothérapie oncolytique consiste à utiliser un virus pour détruire des cellules cancéreuses tout en épargnant les saines. Sur les mutants T1026R1 et TP3R1 du VSV de la famille des vésiculovirus portant un génome à ARN négatif de 11 kb, des efforts sont entrepris afin de prouver qu'ils sont des armes efficaces contre le cancer. Cependant, leur faible pouvoir apoptique ainsi que la persistance démontrée pour T1026R1 dans les cellules H4 les rendent moins attrayants. D'autres mutants du VSV, soit TR5R1 et TP6R1 pourraient également être de bons candidats dans la virothérapie oncolytique. Ils ne persistent pas, ils sont de meilleurs inducteurs d'apoptose et comme les mutants T1026R1 et TP3R1, ils induisent fortement la réponse des interférons. Afin de comprendre les différences quant au phénotype d'infection des mutants TP5R1 et TP6R1, le séquençage du génome entier de la souche sauvage HR ainsi que tous les mutants thermosensibles et thermorésistants a été entrepris. Les mutations responsables de la thermosensibilité vs thermorésistance pourront du même coup être révélées. Les résultats confirment les mutations M51R sur la protéine de la matrice de T1026R1 et de T1026 et V221F-S226R de TP3R1. Les mutants TP5R1 et TP6R1 portent respectivement les mutations E254Q et E254G sur le « PH domain » de leur glycoprotéine. Les mêmes mutations sont retrouvées chez TP5 et TP6 avec en plus la mutation D232G aussi sur le « PH domain ». L'analyse de la structure secondaire montre des changements par rapport au VSV Indiana HR, alors que l'analyse de la structure tridimensionnelle montre que seule la mutation D232G altère la structure. La présence de cette mutation sur les souches thermosensibles T1026, TP5, TP6 et le VSV Indiana San juan ainsi que sa conséquence sur la structure 3D laissent présager qu'elle pourrait être responsable de la thermosensibilité. La cartographie génétique des virus BR, T1026, T1026R1, TP3, TP3R1, TP5, TP5R1, TP6 et TP6R1 permettra d'approfondir la compréhension de leur phénotype d'infection particulier pour éventuellement construire un virus oncolytique recombinant conjuguant les avantages de chacun.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Le marché des agents de livraison d’acides nucléiques est en pleine expansion et atteindra plus de cinq milliards de dollars en 2030. Ces agents, utilisés pour livrer de l’information génétique dans des cellules de mammifères, ont de nombreuses applications tant dans le domaine de la recherche fondamentale que thérapeutique. Parmi les différentes catégories d’agents de livraison, celle utilisant des vésicules extracellulaires (VE) pseudotypées par la glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire (VSVG) s’est révélée prometteuse dans les dernières années. En effet, en combinaison avec un polymère cationique, ces particules (VE-VSVG) se sont montrées capables de livrer des acides nucléiques de type ADN et ARN dans différents types cellulaires. Malheureusement, les procédés de production actuels des VE-VSVG, impliquant l’utilisation de cellules HEK293, sont difficiles à adapter à l’échelle industrielle notamment à cause de l'utilisation de cellules productrices adhérentes, de la présence de sérum dans le milieu de culture et de procédés de purification incomplets. Par conséquent, l’objectif de ces travaux de recherche a été de développer un procédé de fabrication des VE-VSVG, pouvant être plus facilement transposé à l’échelle industrielle. Cette thèse se divise en quatre chapitres. Le chapitre 1 constitue une revue de la littérature et fait un état des lieux des différentes méthodes de livraison d'acides nucléiques, ainsi que des procédés de production et de purification de particules biologiques pseudotypées par la protéine VSVG, incluant les VE-VSVG. Les trois chapitres suivants présentent les résultats obtenus au cours de ce doctorat. Le chapitre 2 regroupe les résultats d’une première publication dédiée à la mise en place d’un procédé de production de VE-VSVG par transfection transitoire de cellules HEK 293,cultivées en suspension sans sérum, ainsi que d’une méthode de purification, composée d’une phase de concentration par ultracentrifugation et d’une étape de séparation par chromatographie d’affinité. Le chapitre 3présente les résultats d’une future publication, consacrée à l’analyse de l'effet de la production de VE-VSVG sur l'expression génique des cellules HEK 293, ainsi qu’à l’amélioration des rendements de production de ces particules, grâce à l’identification de différents gènes prometteurs au cours de cette étude transcriptomique. Finalement, le chapitre 4 regroupe des résultats consacrés à l’évaluation d’autres plateformes de fabrication(production et purification) des VE-VSVG. En conclusion, les nouvelles données et les procédés développés dans le cadre de cette thèse permettent d’améliorer significativement la production et la purification de cet agent de livraison d’acides nucléiques prometteur, dans un contexte industriel. / The market of nucleic acid delivery agents is growing rapidly and will reach more than$5billion by 2030. These agents, used to deliver genetic information into mammalian cells, have numerous applications in both basic and therapeutic research. Among the different classes of delivery agents, the one using extracellular vesicles (EV) pseudotyped with the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG) has shown promises in recent years. In combination with a cationic polymer, these particles (EV-VSVG) have been shown to be able to deliver DNA and RNA in different cell types. Unfortunately, current EV-VSVG production processes, involving the use of HEK 293cells, are difficult to adapt to industrial scale, notably due to the use of adherent producer cells, the presence of serum in the culture medium and incomplete purification procedures. Therefore, the goal of this thesis was to develop a manufacturing process for EV-VSVG that could facilitate the transposition to industrial scale. This thesis is divided into four chapters. Chapter 1 is a review of the literature and presents an overview of the nucleic acid delivery methods, as well as processes for the production and purification of VSVG-pseudotyped biological particles, including EV-VSVG. The following three chapters present the results obtained during this Ph.D.Chapter 2 covers the results of a first publication dedicated to the development of a production process of EVVSVG by transient transfection of HEK 293 suspension cells grown in serum-free media, as well as a purification method, composed of a concentration step by centrifugation and a separation step by affinity chromatography.Chapter 3 presents the results of a future publication, dedicated to the analysis of the effect of VSVG protein production on HEK 293 cell gene expressions, as well as to the improvement of those particles production yields,through the identification of various promising genes during this transcriptomic study. Finally, Chapter 4 brings together results devoted to the evaluation of alternative manufacturing platforms (production and purification) forEV-VSVG. In conclusion, the new data and processes developed in this thesis significantly improve theproduction and purification of this promising nucleic acid delivery agent, in an industrial context.

Malgré le nombre croissant d'individus infectés par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) chaque année, il n'existe toujours pas de vaccin efficace qui prévienne son infection chez l'homme. Seulement en 2020, on peut encore compter 37,6 millions d'infection et 690 000 décès liés au SIDA. Le développement d'un vaccin contre le SIDA, sûr et efficace, serait donc un moyen très pertinent pour combattre les ravages de cette maladie. Le virus de la stomatite vésiculeuse (VSV), membre de la famille des Rhabdoviridae, infecte principalement les bovins, mais est relativement bénin pour l'humain, n'étant associé qu'à de légers symptômes pseudo-grippaux. Par ailleurs, le VSV recombinant a déjà été utilisé pour le développement de vaccins humains contre divers virus, notamment Ebola, Marbourg, Lassa, la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (CCHFV), Nipah, les coronavirus MERS et SRAS, Zika, Influenza et VIH. Dans ce travail, effectué dans le cadre plus large du développement de nouveaux candidats vaccins contre le VIH, basé sur les VSV recombinants (rVSV), nous proposons différents schémas de purification pour le traitement de ces candidats. Une série de filtres avec des tailles de pores et des supports de filtration différents ont été testés pour leur efficacité à éliminer les débris cellulaires du surnageant de culture cellulaire tout en permettant aux particules infectieuses de traverser le filtre. Cette microfiltration en série a également été appliquée pour éliminer le besoin de centrifugation à basse vitesse à l'étape de la clarification et améliorer les rendements, la simplicité et l'extrapolabilité des schémas proposés. Afin de réduire le volume de l'échantillon à traiter, l'application de différentes unités d'ultrafiltration (UF), soit des unités d'UF centrifuge ou à flux tangentiel (TFUF), ont été testées. Pour ce faire, les paramètres de fonctionnement de la TFUF ont été maintenus à des valeurs ne générant que de faible taux de cisaillement (≤ 2000 s⁻¹) pour préserver l'intégrité du rVSV. Pour l'étape de la purification chromatographique proprement dite, plusieurs technologies candidates ont été testées pour leur capacité à séparer les particules infectieuses de l'ADN et des protéines contaminants. Des résines échangeuses d'anions fortes et faibles, à savoir HiTrap™ DEAE FF, HiTrap™ ANX FF, HiTrap™ Q FF et HiTrap™ XL (Cytiva), ont été testées en colonne. Dans les meilleures conditions, ces colonnes ont permis de récupérer 77 % des particules infectieuses tout en éliminant respectivement 93 % et 92,7 % des protéines totales et de l'ADN. Par la suite, un schéma de purification chromatographique en deux étapes utilisant initialement un adsorbeur échangeur d'ion membranaire (Sartobind® Q, Sartorius), suivi d'une résine multimodale (Captocore™ 700, Cytiva) a également été testé car les adsorbeurs membranaires sont plus pratiques pour les procédés à grande échelle. La purification des rVSV à l'aide de ce protocole a permis de récupérer 51 % de particules infectieuses et a éliminé 95 % et 85 % de l'ADN et des protéines contaminants, respectivement. Cependant, étant donné que les micrographies électroniques de ces préparations virales purifiées présentaient encore une quantité notable de vésicules extracellulaires ou d'exosomes, deux résines à base de céramique d'hydroxyapatite (CHT) ont aussi été testées pour leur capacité à séparer les rVSV de ces contaminants. La colonne CHT II (BioRad) a montré des résultats prometteurs en terme d'élimination des vésicules extracellulaires, comme vérifié par microscopie électronique à transmission (TEM). De plus, une récupération de 78 % de rVSV infectieux ainsi que l'élimination de 98 % de l'ADN résiduel et de 99 % des protéines ont été mesurées dans les éluats de cette colonne. / Despite the growing number of Human immune deficiency virus (HIV) infected individuals every year, there is still no effective vaccine that prevents new HIV infection in humans. As of 2020, a total of 37.6 million individuals were found globally to be infected with HIV. With 690,000 AIDS-related death reports in 2020, developing a safe and effective HIV vaccine is of utmost importance. Vesicular stomatitis virus(VSV), a member of the Rhabdoviridae family, mainly infects cattle, but its infection in human is mainly benign and can only be associated with mild flu-like symptoms. In addition, the VSV platform has already been used to develop vaccines against a variety of virus infections, including Ebola, Marburg, Lassa, Crimean-Congo hemorrhagic fever (CCHFV), Nipah, MERS- and SARS- coronaviruses, Zika, Influenza, and HIV. In the current work, carried out within the broader framework of developing new vaccine candidates against HIV based on recombinant VSVs (rVSVs), we propose different purification schemes for the DSP of the candidate vaccine. A series of filters with different pore sizes and filtration media were tested for their effectiveness in removing cellular debris from the cell culture supernatant while allowing the infectious particles to pass through the filter. Serial microfiltration was also applied to eliminate the need for low-speed centrifugation at the clarification step and improve the proposed schemes' yield, simplicity, and scalability. In order to reduce the volume of the sample to be processed, the application of different ultrafiltration (UF) units, either centrifugal based UF units or tangential flow UF (TFUF) systems, were tested. The TFF operation parameters were maintained at values generating low shear (≤2000 s⁻¹ shear rate) for preserving the integrity of the rVSV as an enveloped virus. For the actual chromatographic purification step, multiple candidate technologies were tested for their ability to separate infectious particles and to remove the contaminant DNA and proteins. Strong and weak anion exchanger resins, namely, HiTrap™ DEAE FF, HiTrap™ ANX FF, HiTrap™ Q FF, and HiTrap™ XL (Cytiva), were put into test in the column mode. In best condition, these columns resulted in the recovery of 77 % infectious particles while eliminating 86.6 % and 92.7 % of the total proteins and DNA, respectively. Subsequently, a two-step chromatographic purification scheme initially used a membrane adsorber (Sartobind® Q, Sartorius), followed by a multimodal resin (Captocore™ 700, Cytiva) was tested since membrane adsorbers are more applicable for large-scale processes. Purification of rVSVs using this protocol resulted in the recovery of 51 % infectious particles but removed 95 % of the contaminant DNA contents and 85 % of total proteins. However, since the electron micrographs of these purified virus preparations still showed a noticeable amount of extracellular vesicles or exosomes (visually through TEM), two resins based on ceramic hydroxyapatite (CHT) were screened for their ability in separating the rVSVs from these contaminants. The CHT II (BioRad) column showed promising results in removing extracellular vesicles from the virus preparations as verified by transmission electron microscopy (TEM). Moreover, a recovery of 69.2 % infective rVSVs alongside the removal of 88 % residual DNA and 87 % of protein contents was measured in this column's eluates.