Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 79-91. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2006. / Bibliogr.: f. 221-240. Publié aussi en version électronique.

Afin de comprendre la biogénèse et l'assemblage des fimbriae de Streptococcus salivarius, les gènes inactivés de deux mutants ayant une production réduite de fimbriae ont été analysés. Chez le mutant C34, le transposon est inséré entre les gènes cysD et ssaO988, codant respectivement pour une O-acetylhomosérine sulfhydrylase et une hydrolase des haloacides déhalogénases. Les analyses de la transcription ont montré que les transcrits ne sont pas perturbés. Chez le mutant DU, le transposon est inséré dans le gène dagA codant pour une D-alanine/glycine/Na perméase et les analyses de la transcription ont montré l'absence du transcrit. La complémentation en trans a été effectuée, mais la méthode d'immunoempreinte n'a pas permis de détecter le retour à une expression normale de fimbriae. L'absence du transporteur de la D-alanine, stéréoisomère retrouvé exclusivement dans la paroi, pourrait perturber l'ancrage des fimbriae par une modification de la composition et/ou de la stabilité de la paroi bactérienne.

Streptococcus thermophilus {St) est une bactérie utilisée pour la transformation du lait en yogourts et en fromages. Le lactose constitue sa principale source d'énergie. Cette espèce bactérienne est incapable de croître sur galactose et rejette, au cours d'une croissance sur milieu lactose, la partie galactose du lactose malgré le fait qu'elle possède les gènes codant pour les en2ymes du métabolisme du galactose. Ce travail visait à éclairer le rôle de GalM, une mutarotase, dans le phénomène du rejet de galactose par St. Le gène galM de Streptococcus salivarius a été introduit dans quatre souches de St. L'expression du gène galM chez les transformants a été confirmée par des expériences de type Western et Northern. Les résultats indiquent qu'une augmentation de GalM chez les souches Gal+ cause un rejet moins important de galactose.

HPr fait partie du système de transport phosphoénolpyruvate: sucre phosphotransferase (PTS). HPr peut être phosphorylée sur Hisis, par l'enzyme I (El) du PTS, et sur Sér46, par la HPr(Ser) kinase/phosphorylase (HprK/P). Finalement, HPr peut être phosphorylée sur les deux résidus, ce qui génère HPr(Ser-P)(His~P). L'objectif principal de l'étude présentée dans cette thèse était de déterminer par quelle(s) voie(s) HPr(Ser-P)(His~P) est synthétisée chez les streptocoques. Théoriquement, HPr(Ser-P)(His~P) peut être synthétisée via la phosphorylation de HPr(Ser-P) par El et/ou de HPr(His-P) par HprK/P. Nous avons étudié la cinétique de ces voies de synthèse chez Streptococcus salivarius. Les résultats de l'étude avec El ont montré que (i) la kcat/Km pour HPr(Ser-P) était ~5 OOOx plus faible que pour HPr à pH 7,9 et 37°C, (ii) aucun intermédiaire glycolytique ne stimulait la synthèse de HPr(Ser-P)(His~P), (iii) la synthèse de HPr(Ser-P)(His~P) était ~8x plus efficace à pH acide, des conditions retrouvées dans le cytoplasme des streptocoques en croissance, et (iv) la synthèse du HPr(Ser-P)(His~P) de Bacillus subtilis par El de cet organisme était aussi stimulée à pH acide. Les résultats suggèrent que la synthèse de HPr(Ser-P)(His~P) chez les streptocoques résulterait des concentrations élevées en HPr(Ser-P) et de la stimulation de la réaction à pH acide. L'absence de HPr(Ser-P)(His~P) chez B. subtilis cultivée en présence de glucose s'expliquerait en partie par le fait que cette bactérie maintient son pH intracellulaire constamment au-dessus de la neutralité. Les résultats de l'étude avec HprK/P ont montré que les kQJKm pour les HPr(H15D) et HPr(H15E) étaient ~13x plus faibles que pour HPr à pH 7,4 et 37°C. Dans des conditions où HPr(His~P) était stable (pH 8,6 et 15°C), les kcJKm pour HPr(H15D) et HPr(His~P) Ill étaient respectivement neuf et 26 fois plus faibles que pour HPr. Finalement, la phosphorylation de HPr(H15D) n'était que marginalement stimulée à pH acide et le FBP ne stimulait pas la synthèse de HPr(Ser-P)(His~P). Les résultats suggèrent que (i) l'inefficacité de la phosphorylation de HPr(His~P) résulterait de la présence de la charge négative en position 15 et d'autres éléments structuraux et (ii) la contribution de HprK/P à la synthèse de HPr(Ser-P)(His~P) chez les streptocoques serait marginale.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2009. / Bibliogr.: f. 166-196. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

RABELO, E. M. Avaliação do potencial antimicrobiano do extrato etanólico e frações obtidas de guettarda sericea müll. arg.(rubiaceae). 2013. 83 f. Dissertação ( Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2013. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-28T15:44:12Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_emrabelo.pdf: 10038342 bytes, checksum: 035c474be4424e0dddff689c31e484ba (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-29T12:17:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_emrabelo.pdf: 10038342 bytes, checksum: 035c474be4424e0dddff689c31e484ba (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T12:17:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_emrabelo.pdf: 10038342 bytes, checksum: 035c474be4424e0dddff689c31e484ba (MD5) Previous issue date: 2013 / The genus Guettarda (Rubiaceae) comprises plants widely distributed in tropical areas. Regarding the Guettarda sericea species, the literature shows that there is a lack of botanical and phytochemicals studies. Thus, the present study aimed to evaluate the antibacterial effect of ethanol extract of leaves of G. sericea (EEFGS) and its fractions on the growth of Streptococcus oralis ATCC 10557 and S. salivarius ATCC 7073 in both the planktonic and biofilms states. Different methods were employed to verify the antimicrobial potential. Among these are the determination of minimum inhibitory concentration (MIC) determination of the death curve and evaluation of minimum bactericidal concentration (MBC). Furthermore, quantification of biomass and the number of viable cells of the biofilm were performed, respectively, by staining with crystal violet and counting colony forming units (CFU). The negative and positive controls used in all assays were respectively 4% DMSO and chlorhexidine gluconate with concentration adjusted according to the data of the MIC of each microorganism. To determine the toxicity of EEFGS, it was used the toxicity test on Artemia nauplii. The data showed that the extract and subfractions 13 to 17 of the chloroform fraction show a remarkable antimicrobial effect, able to inhibit the growth of planktonic and development of biofilms of S. oralis strain until the concentration of 62.5 μg.mL-1. With respect to S. salivarius, only subfraction 12 interfered on bacterial growth. Regarding the toxicity, it was observed that death of Artemia nauplii occurred at higher concentrations than those that exhibited antibacterial effect. From these results it can be concluded that EEFGS and subfractions 13-17 can be used as agents for the control of biofilm formation of S. oralis. In addition, complementary methodologies that seek purification of the active compounds and their cytotoxic effects on eukaryotic cells need to be held, aiming its use as an herbal agent. / O gênero Guettarda (Rubiaceae) compreende plantas extensamente distribuídas em áreas tropicais. Com relação à espécie Guettarda sericea, a literatura demonstra que existe uma ampla carência acerca de estudos botânicos e fitoquímicos. Assim, o presente trabalho buscou avaliar o efeito antibacteriano do extrato etanólico das folhas de G. sericea (EEFGS) e suas frações sobre o crescimento de Streptococcus oralis ATCC 10557 e S. salivarius ATCC 7073, nas formas planctônicas e de biofilmes. Diferentes metodologias foram empregadas para a verificação do potencial antimicrobiano. Dentre estas estão a determinação da concentração inibitória mínima (MIC), a determinação da curva de morte e a avaliação da concentração bactericida mínima (MBC). Além disso, a quantificação da biomassa e do número de células viáveis do biofilme foi realizada, respectivamente, através da coloração pelo cristal violeta e contagem de unidades formadoras de colônia (UFC). Os controles, negativo e positivo utilizados em todos os ensaios foram, respectivamente, DMSO 4% e Gluconato de Clorexidina com concentração ajustada de acordo com os dados da CIM de cada micro-organismo. Para a determinação da toxicidade do EEFGS utilizou-se o ensaio de toxicidade sobre náuplios de Artemia. Os dados mostraram que o extrato e as subfrações 13 a 17 da fração clorofórmio apresentaram um marcante efeito antimicrobiano, sendo capazes de inibir o crescimento planctônico, bem como o desenvolvimento de biofilmes da cepa de S. oralis até a concentração de 62,5 µg.mL-1. Com relação a S. salivarius, apenas a subfração 12 interferiu sobre o crescimento bacteriano. No tocante à toxicidade, foi observado que a morte dos náuplios de Artemia ocorreu em concentrações mais elevadas do que aquelas que apresentaram efeito antibacteriano. A partir de tais resultados pode-se concluir que EEFGS e as subfrações 13 a 17 podem ser utilizados como insumos para o controle da formação de biofilmes de S. oralis. Em adição, metodologias complementares que busquem a purificação dos compostos ativos e seus efeitos citotóxicos sobre células eucarióticas necessitam ser realizadas, visando sua utilização como um agente fitoterápico.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第23519号 / 農博第2466号 / 新制||農||1086(附属図書館) / 学位論文||R3||N5350(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科森林科学専攻 / (主査)教授 和田 昌久, 教授 髙野 俊幸, 教授 河本 晴雄 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

Streptococcus thermophilus is a low GC gram-positive bacterium massively used for the production of fermented products such as yogurt and cheeses. Every day, the dairy industry must face virulent bacteriophages and their consequences. Recently, a genetic structure called CRISPR (for Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) was found to be present in many bacterial and archeabacterial genomes. This system, in association with Cas (CRISPR-associated) proteins, allows the bacteria to become resistant to foreign DNA, such as phage or plasmid DNA, by the acquisition of new sequence-specific spacers. During this M. Sc. project, the transcription profile of the CRISPRl-cas system of S. thermophilus was investigated. First, the phage-sensitive wild-type strain DGCC7710 and two phage-resistant CRISPR-mutants (DGCC7710<i>2972+S4 and DGCC7710*2972+S7) were infected with the virulent phage 2972. Northern blot experiments of infected cells samples taken at time intervals were performed using a series of single-stranded 5'-labeled-probes targeting the four cas genes, the CRISPR1 locus, as well as phage genes. Phage DNA replication assays of the same samples were also done. Finally, in vitro enzymatic assays were performed using Casl and Cas2 purified proteins. In the three S. thermophilus strains tested, the four cas genes and the CRISPR1 locus were constitutively transcribed. In the phage-resistant CRISPR-mutant DGCC7710<D2972+S4 , phage mRNA specific to the acquired new spacer was rapidly degraded, whereas phage mRNAs were increasingly and strongly detected in infected phage-sensitive cells (DGCC7710). Conversely, no DNA degradation was observed. The enzymatic assays revealed that Casl and Cas2 have ssRNase activity which, in the case of Casl, is specific to a A(U)C sequence. Taken altogether, the CRISPR-cos system in S. thermophilus leads to mRNA degradation of specific phage transcripts, thereby limiting phage replication. / Streptococcus thermophilus est une bactérie utilisée pour la fabrication de produits laitiers fermentes, mais elle doit constamment lutter contre les infections par de nouveaux bacteriophages virulents. Récemment, un tout nouveau mécanisme naturel de défense contre les phages a été découvert chez S. thermophilus. Les CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) sont des séquences d'ADN contenant plusieurs répétitions entrecoupées de régions appelées spacers qui proviennent d'ADN extrachromosomique. Les loci CRISPR sont habituellement situés à proximité de gènes cas (CRISPR-associated). L'acquisition d'un spacer est directement reliée à une immunité contre le phage duquel provient l'ADN de ce spacer. Au cours de ce projet de maîtrise, le mode de fonctionnement du système CRISPR-cas a été étudié par analyse transcriptionnelle des gènes cas, de régions impliquées dans le locus CRISPRl-cas ainsi que des gènes viraux chez trois souches isogéniques de S. thermophilus (DGCC7710, DGCC7710[phi]2972+S4 et DGCC7710[phi]2972+S7) en cours d'infection par le phage 2972. Des travaux ont également été faits sur la replication virale chez les trois souches. Finalement, des essais enzymatiques in vitro ont été réalisés avec deux des quatre protéines Cas dont les gènes précèdent un des loci CRISPR de la souche DGCC7710. Les résultats du projet indiquent, entre autres, que les quatre gènes cas présents chez la souche S. thermophilus DGCC7710 sont transcrits constitutivement et que l'ARNm viral est dégradé par les souches résistantes ayant acquis de nouveaux spacers, ce qui ne semble pas être observé au niveau de l'ADN. Les résultats des essais enzymatiques démontrent également que les protéines Casl et Cas2 possèdent une activité sbRNase, qui dans le cas de la protéine Casl, est spécifique à la séquence A(U)C. Les résultats démontrent que le système CRISPR-cas agit de façon à dégrader l'ARN étranger comprenant une séquence identique à un spacer acquis par une souche résistante, ce qui a pour effet direct de limiter la replication du phage.

Les bactériophages sont maintenant reconnus pour jouer un rôle majeur dans divers écosystèmes. De nouveaux gènes sont fréquemment identifiés dans les génomes de ces bactériophages issus de différentes études environnementales. La majorité de ces gènes ne peuvent être associés à une fonction connue, d’où la nécessité de développer des outils génétiques performants afin mieux comprendre leur rôle dans la biologie des bactériophages virulents. Dans ce projet de maîtrise, le système CRISPR-Cas de la souche Streptococcus thermophilus DGCC7710 a été utilisé afin de pouvoir étudier des gènes sans fonction connue du bactériophage virulent 2972. Des mutations ponctuelles ainsi que de petites et de grandes délétions ont été réalisées dans le génome de phages virulents en utilisant le système CRISPR-Cas comme pression sélective. Finalement, la méthylation de l’ADN phagique a été démontrée suite à l’insertion d’un gène codant pour une méthyltransférase bactérienne dans le génome du phage 2972. / Bacteriophages are now widely recognized as major players in a wide variety of ecosystems. Novel genes are often identified in newly isolated phages as well as in environmental metavirome studies. Most of these novel viral genes have unknown functions but appear to be coding for small, non-structural proteins. To understand their biological role, very efficient genetic tools are required to modify them, especially in the genome of virulent phages. For this MSc project, specific point mutations and large deletions can be engineered in the genome of the virulent phage 2972 using the Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas Type II-A. Furthermore, the CRISPR-Cas engineering system can be used to efficiently introduce a functional methyltransferase gene into a virulent phage genome. Finally, synthetic CRISPR bacteriophage insensitive mutants were constructed by cloning a spacer-repeat unit in a low copy vector illustrating the possibility to target multiple regions of the phage genome.