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Rôle du transporteur vésiculaire du glutamate de type 3 (VGLUT3) dans la réponse au stress hypoxique néonatal et la surdité DFNA25 / Atypical vesicular glutamate transporter type 3 (VGLUT3) function in the response to neonatal hypoxic stress, and the DFNA25 deafness

Miot, Stéphanie 24 February 2017 (has links)
Avant d'être libéré dans la fente synaptique, le glutamate est accumulé dans les vésicules présynaptiques par les transporteurs vésiculaires du glutamate (VGLUTs). Il existe 3 types de VGLUTs. VGLUT3 possède une distribution anatomique et des fonctions atypiques. Au sein du système nerveux central, VGLUT3 est exprimé dans des neurones glutamatergiques mais aussi non glutamatergiques, dans lesquels il assure les fonctions de co-transmission ou de synergie vésiculaire. On le retrouve notamment dans certains neurones sérotoninergiques du raphé. Au sein de l'oreille interne, VGLUT3 est l'unique VGLUT décrit dans les cellules ciliées internes (CCI). La sérotonine joue un rôle essentiel dans le contrôle respiratoire néonatal. En étudiant la respiration de souriceaux n'exprimant plus le VGLUT3, nous avons démontré le rôle de VGLUT3 dans l'adaptation au stress hypoxique néonatal. Une mutation de VGLUT3 a été mise en évidence dans une surdité humaine très proche cliniquement de la presbyacousie et appelée DFNA25. En étudiant le phénotype auditif de souris exprimant cette mutation, nous avons prouvé l'implication de cette mutation dans l'atteinte des CCI à l'origine de la surdité DFNA25. L'étude des processus biochimiques mis en jeu nous a permis d'envisager un rôle indirect de VGLUT3 dans l'activation de la mort autophagique, via la protéine Becline 1 et une possible interaction au sein de la voie de la Culline 3. L'ensemble de ce travail nous a permis de mettre en évidence un rôle de VGLUT3 dans l'adaptation aux conditions extrêmes telles que le développement néonatal ou le processus de vieillissement. Il ouvre de nouvelles perspectives sur les diverses fonctions des VGLUTs. / Before its release into synaptic cleft, glutamate is accumulated in presynaptic vesicles by vesicular glutamate transporters (VGLUTs). There are 3 types of VGLUTs. VGLUT3 presents atypical functions and anatomical distribution. In the central nervous system, VGLUT3 is expressed in glutamatergic and non glutamatergic neurons, in which it performs the co-transmission and the vesicular synergy. Particularly, we can observe VGLUT3 in serotoninergic neurons of raphe. In the inner ear, VGLUT3 is the unique VGLUT described in the inner hair cells (IHCs). Serotonin plays a key role in the neonatal respiratory control. By exploring the respiration of VGLUT3 knock out mice pumps, we have demonstrated the role of VGLUT3 in the response to neonatal hypoxic stress. One VGLUT3 mutation has been described in a human deafness clinically very close to presbycusis, the DFNA25 deafness. By studying the auditory phenotype of mice expressing this VGLUT3 mutation, we have proved the implication of this mutation in the IHCs impairment at the origin of DFNA25 deafness. Biochemical analysis have helped us to consider an indirect role of VGLUT3 in the autophagic death. Beclin 1 and a possible interaction between VGLUT3 and the Cullin3 pathways could be implicated. All of our results allowed us to highlight a role of VGLUT3 in the adaptation to extreme conditions like neonatal development or aging process. They open new perspectives on the various functions of VGLUTs.
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Étude fonctionnelle de la famille des facteurs de transcription ERF-VIIs chez Medicago truncatula : régulateurs clés de l’adaptation au manque d’oxygène / ERF-VII family as key players in hypoxic signaling and adaptation in Medicago truncatula

Rovere, Martina 19 June 2018 (has links)
Les légumineuses sont connues pour leurs capacités à établir une relation symbiotique avec des bactéries du sol fixatrices de l'azote atmosphérique. Cette interaction aboutit à la formation d'un nouvel organe au niveau des racines, la nodosité, au sein duquel le symbiote convertit l'azote atmosphérique (N2) en ammoniac, qui peut être directement consommé par les plantes. A l’intérieur de cette nodosité, la concentration en oxygène (O2) est maintenue à un très faible niveau car la réaction de réduction du N2 par l’enzyme bactérienne nitrogénase est inhibée par des traces d’oxygène. Un mécanisme de perception directe de l'O2 impliquant des membres de la famille des facteurs de transcription « Ethylene Responsive Factors » (ERFs) du groupe VII a récemment été découvert chez Arabidopsis thaliana. Ces facteurs de transcription (FT) possèdent une extrémité N-terminale caractéristique avec un résidu de cystéine à la seconde position. Dans des conditions normales d'O2, les FT sont conduit à la dégradation suivant une voie spécifique du protéasome. En condition de stress hypoxique, les TFs sont stabilisés et peuvent activer l’expression des gènes de réponse à l'hypoxie. Il a été démontré que la présence d’O2 et de NO était nécessaire pour déstabiliser ces protéines, et qu'une réduction de la disponibilité de l'un ou l'autre des gaz est suffisante pour protéger le résidu cystéine N-terminale de l'oxydation. L’objectif de cette thèse a été d'étudier le rôle de la famille ERF-VII dans la perception et l'adaptation au manque d'O2 chez M. truncatula. Des travaux ont aussi été menés pour déterminer l’importance du NO dans le fonctionnement en microoxie de la nodosité. Quatre gènes codant pour des facteurs de transcription de la famille ERF-VII ont été identifiés dans le génome de M. truncatula. La caractérisation de cette famille au niveau transcriptionnel a révélé que seul MtERF-B2.2 était induit par le stress hypoxique et au cours du développement des nodosités. Les trois autres, MtERF-B1.1, MtERF-B1.11 et MtERF-B2.3, sont constitutivement exprimés dans les feuilles, les racines et les nodosités. Pour étudier la stabilité de la protéine MtERF-B2.1, l’orthologue de RAP2.12 principal ERF-VII décrit dans la perception de l’O2 chez Arabidopsis, en fonction de la disponibilité de O2/NO, nous avons réalisé une protéine de fusion entre l’extrémité N-terminale de notre protéine et la protéine rapporteur luciférase. Les résultats obtenus sur des protoplastes d'Arabidopsis montrent l’implication la partie N-terminale de MtERF-B2.1 dans la régulation de la stabilité de la protéine, mais en contradiction avec les résultats obtenus en plantes composites de M. truncatula. La fonction de MtERF-B2.1 et MtERF-B2.11 a également été étudiée dans le cadre de la réponse au stress hypoxique et au cours du processus de nodulation en utilisant une stratégie d'interférence ARN. Des racines transgéniques dérégulées sur l’expression de MtERF-B2.1 et MtERF-B2.11 ont montré un défaut d’activation de plusieurs gènes de réponses à l'hypoxie tels que l’alcool déshydrogénase (ADH1) ou la pyruvate décarboxylase (PDC1). Ces racines transgéniques ARNi-MtERF-B2.1/B2.11 sont également affectées dans l'interaction symbiotique avec une réduction significative de la capacité de nodulation et de l'activité de fixation de l'azote dans les nodules matures. En conclusion, ces travaux révèlent que le mécanisme de détection d'O2 est médié par les ERF-VII dans les nodosités de M. truncatula et que ce mécanisme, associé aux cibles moléculaires régulées en aval, participe au développement de cet organe et au maintien de la capacité de fixatrice de celui-ci. De plus, les résultats indiquent que MtERF-B2.1/B2.11 sont des régulateurs positifs du métabolisme anaérobie et que les gènes associés au cycle hémoglobine-NO sont susceptibles d'activer d'autres voies de génération d'ATP. / Legume crops are known for their capacities to establish a symbiotic relationship with nitrogen fixing soil bacteria. This mutualism culminates in the formation of a new plant organ, the root nodule, in which the symbiont converts atmospheric nitrogen (N2) into ammonia, which can be directly consumed by plants. In nodules, bacterial nitrogenase enzyme is inhibited by traces of oxygen (O2) so different mechanisms maintain this organ at low O2 level. At the same time, nodules need to maintain a high ATP level to support the nitrogenase activity, which is highly energy demanding. Thus, a balance between a tight protection from O2 and an efficient energy production, referred as the “O2 paradox” of N2-fixing legume nodules, has to be reached. In Arabidopsis thaliana, a direct oxygen sensing mechanism has recently been discovered involving members of the ethylene responsive factors (ERFs) group VII. These transcription factors (TFs) possess a characteristic N-terminal amino acid with a cysteine residue at the second position that, under normal O2 conditions, leads to protein degradation following a specific pathway called the N-end rule pathway. Furthermore, it was shown that both O2 and nitric oxide (NO) are required to destabilize the ERFs VII and that a reduction in the availability of either gas is sufficient to stabilize these proteins. Therefore, the goal of this thesis was to investigated the role of ERF-VII family in O2 sensing and adaptation to hypoxia in M. truncatula, model plant for legumes, and to understand how NO interacts with O2 in hypoxic signalization in the microoxic environment that characterizes the nodule. We identified four genes belonging to the ERF-VII TF family in the M. truncatula genome, which present a strong similarity with ERF-VII of Arabidopsis. The characterization of this family at the transcriptional level revealed that only MtERF-B2.2 is up-regulated by hypoxia stress and during nodule development. The three others, MtERF-B1.1, MtERF-B1.11 and MtERF-B2.3 are found constitutively expressed in leaves, roots and nodules. To investigated the protein stability of MtERF-B2.1, the closest orthologous to AtRAP2.12 described as O2-sensors in Arabidopsis, in function of O2/NO availability, we realized a fusion protein with the luciferase reporter protein. Our results on Arabidopsis protoplasts indicated that the N-terminal part of MtERF-B2.1 drives its O2-dependent degradation by the N-end rule pathway. The function of MtERF-B2.1 and MtERF-B2.11 was also investigated both in response to hypoxia stress and during the nodulation process using an RNA interference strategy. Silencing of MtERFB2.1 and MtERF-2.11 showed a significant lower activation of several core hypoxia-responsive genes such as ADH1, PDC1, nsHb1 and AlaAT. These double knock-down transgenic roots were also affected in symbiotic interaction with a significant reduction of the nodulation capacity and nitrogen fixation activity in mature nodules. Overall, the results reveal that O2 sensing mechanism is mediated by ERF-VIIs in M. truncatula roots and nodules and that this mechanism, together with downstream targets, is involved in the organ development and ability to efficiently fix nitrogen. Furthermore, results indicated that MtERF-B2.1/B2.11 are positive regulator of the anaerobic metabolism and the Hb-NO cycle– related genes likely in order to activate alternative ATP generation pathways.

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