L'apolipoprotéine D (apoD) est une glycoprotéine sécrétée dont l'expression est modulée dans une multitude de situations incluant les cancers de différents tissus, les désordres métaboliques et les maladies neurodégénératives. Bien que la liste des conditions présentant une augmentation de l'apoD s'allonge chaque jour, les facteurs provoquant le déclenchement de son expression, de même que la fonction de celle-ci, restent inconnus. Les travaux présentés dans cette thèse ont permis de jeter un peu de lumière sur ces deux aspects. Dans un premier temps, ces travaux ont permis de déterminer que l'apoD est une protéine de stress spécifique et que son expression est déclenchée par des stress ayant une forte composante oxydante ou inflammatoire. Cependant, alors que l'expression de l'apoD en réponse au stress oxydatif est associée à un arrêt de croissance, en condition inflammatoire, elle est accompagnée d'une stimulation de la prolifération. De plus, ces stress modifient non seulement le niveau d'expression, mais aussi la localisation intracellulaire de l'apoD. L'apoD, qui est normalement sécrétée, est réinternalisée et s'accumule dans le cytoplasme et le noyau. L'entrée de l'apoD dans la cellule influence, de plus, la prolifération cellulaire. Ces travaux ont ensuite permis de mieux cerner le rôle de cette modulation de l'apoD en situations de stress chez l'animal. Pour cela, nous avons soumis des souris surexprimant l'apoD humaine dans leur système nerveux ou n'exprimant pas l'apoD à des conditions neurodégénératives. Nous avons ainsi établi que l'apoD serait impliquée dans les mécanismes régulant la protection contre diverses atteintes neurodégénératives, incluant le stress oxydatif et l'inflammation, favorisant donc la survie suite à ces atteintes. Ainsi, l'apoD joue un rôle dans la fonction neuronale basale tel que déterminé grâce à des tests comportementaux. De plus, l'apoD limite la peroxydation lipidique lors de l'exposition au paraquat, un générateur de stress oxydatif. De façon similaire, l'apoD contrôle la production de cytokines et de phospholipase A2, réduit l'infiltration de cellules T et induit l'activation gliale en réponse à l'infection par le coronavirus humain OC43, un modèle d'inflammation aiguë. Par ailleurs, la surexpression de l'apoD humaine chez la souris favorise l'accumulation de lipides dans le foie et les muscles, favorisant ainsi le développement de la résistance à l'insuline accompagnant souvent le vieillissement physiologique. Cette accumulation de lipides a été associée à une stimulation de gènes impliqués dans la synthèse d'acides gras. Les travaux présentés dans cette thèse contribuent donc à établir l'apoD comme un facteur bénéfique favorisant la survie suite à une atteinte cellulaire. Ils suggèrent aussi l'importance de contrôler les niveaux physiologiques de l'apoD afin de maintenir l'homéostasie métabolique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Apolipoprotéine D, Arrêt de croissance, Inflammation, Lipocaline, Résistance à l'insuline, Stress oxydatif.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Biochimie : Villeurbanne, INSA : 2005. / Contient 2 articles en anglais co-rédigés par l'auteur. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 114-129. Index.

Francisella tularensis, agent étiologique de la tularémie, classée parmi les bactéries pathogènes les plus infectieuses pour l’homme, possède une palette d’enzymes lui permettant de faire face au stress oxydatif, notamment à l’intérieur des macrophages, sa principale cible cellulaire. Nous nous sommes consacrés à l’étude d’un nouveau locus potentiellement impliqué dans la réponse au stress oxydatif chez F. tularensis LVS : le locus FTL_0200-FTL_0209. L’analyse in silico de ce locus révèle une homologie de la partie proximale avec le locus batL impliqué dans l’aérotolérance chez Bacteroides fragilis. D'une part, le premier gène du locus, FTL_0200, détermine une protéine chaperon putative ATPase AAA+ de la famille MoxR. D'autre part, les gènes FTL_0201 à FTL_0205 présentent des motifs protéiques de type facteur von Willebrand de type A (VWA) et tétratricopeptide (TPR), potentiellement impliqués dans la liaison d’ions métalliques et les interactions protéineprotéine. Or, les gènes déterminant des ATPases AAA+ de type MoxR sont très souvent retrouvés dans des loci codant pour des prot ines à domaines VWA et TPR. Enfin, les données expérimentales disponibles sur ce type de loci suggèrent que les protéines chaperons MoxR s’associeraient avec des protéines à motifs VWA et TPR pour former des complexes impliqués dans l’insertion de cofacteurs métalliques sur leurs cibles dédiées (enzymes ou autres). Ces observations nous ont conduit à étudier le rôle du gène FTL_0200 dans la virulence de F. tularensis, et sa participation à la réponse au stress. L'étude du mutant de délétion LVS!FTL_0200 démontre que le gène FTL_0200 joue un rôle majeur dans la survie intramacrophagique, ainsi que dans la virulence de F. tularensis dans le modèle murin; elle confirme également sa participation à la résistance au stress. Une analyse transcriptionnelle du locus nous a permis d’identifier le site d’initiation de sa transcription ; les régions -10 et -35 correspondent à un site de fixation pour le facteur alternatif "32, intervenant en conditions de stress. Des expériences d’étiquetage moléculaire (TAPtag) sur les protéines FTL_0200, FTL_0201 et FTL_0205 codées par le locus, ont été réalisées afin d’identifier leurs partenaires d’interaction, et démontrer l’association des protéines produites par le locus en un complexe multimérique. L’analyse des résultats obtenus par spectrométrie de masse montre une interaction de FTL_0200 avec FTL_0201, une interaction de FTL_0201 avec FTL_0205 et une interaction de FTL_0205 avec FTL_0207, suggérant l’association de ces protéines en un complexe multimérique. De plus, les trois protéines, plus particulièrement FTL_0205, semblent interagir avec des enzymes proches ou internes au cycle de Krebs : l’-cétoglutarate déshydrogénase (KGDH), la pyruvate déshydrogénase (PDH) et l’acétyl-CoA carboxylase (ACC). Une expérience de double hybride bactérien confirme partiellement ces résultats. La protéine FTL_0205, présentant beaucoup plus d’interactions que les deux autres protéines, le gène correspondant a été muté. Il présente une sensibilité très accrue au stress oxydatif ainsi qu’un défaut de multiplication dans la lignée de macrophages murins primaires issus de moelle osseuse, et une atténuation de virulence dans les souris. L’activité des trois enzymes métaboliques découvertes dans les expériences de TAP, a été mesurée chez les mutants FTL_0200 et FTL_0205, et comparée à celle de la souche sauvage. La KGDH et la PDH présentent une activité significativement diminuée chez les deux mutants, tandis que l’activité de l’ACC reste inchangée. Les enzymes du cycle de Krebs participent à la synthèse de certains acides aminés. Une expérience d’infection cellulaire, avec ajout de casaminoacides, chez le mutant FTL_0205 montre une restauration de sa virulence au niveau de celle de la souche sauvage. / Pas de résumé en anglais

Bien que les taux de survie soient des plus élevés depuis 1950 au Canada, le cancer du sein peut réapparaître jusqu'à 15 ans après traitements par radiations. Les radiations produisent des radicaux libres reconnus pour activer les métalloprotéinases de matrice (MMP). Ces MMPs sont relâchées par les cellules cancéreuses sous forme inactive (proMMP) et peuvent être activées par des radicaux libres. Les MMPs activées, dont la MMP-2 et -9, dégradent la matrice extracellulaire (MEC) qui a pour rôle d'empêcher le passage des cellules cancéreuses de la tumeur primaire vers la circulation sanguine et lymphatique. Une fois cet obstacle contrecarré, les cellules cancéreuses forment alors des métastases. Le métabolisme de l'estradiol est altéré chez presque sinon toutes les cellules cancéreuses du sein. Ce qui résulte en une accumulation de ces métabolites. Ces derniers génèrent des radicaux libres qui comme cela a été prouvé par plusieurs équipes causent des mutations cellulaires. Mais, une autre conséquence de la présence de ces métabolites a attiré notre attention. La stimulation de l'expression de MMPs clés de l'invasion et l'augmentation de leur activation. Ce projet de recherche s'articule suivant trois axes. L'objectif premier consistait à déterminer si les radiations pourraient effectivement augmenter la capacité d'invasion des cellules cancéreuses du sein. Le second, était d'examiner l'implication des métabolites de l'estradiol, en l'occurrence la 4-OHE[indice inférieur 2], dans ce phénomène d'invasion. En dernier lieu, il s'avérait important de vérifier l'existence d'un effet synergique des précédents phénomènes observés. En utilisant des chambres d'invasion, l'irradiation (5 à 20 Gy) de la matrice basale (MB) artificielle augmentait de 2,5 fois la capacité d'invasion des cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231. Lorsque ces mêmes cellules ont été traitées avec la 4-OHE[indice inférieur 2], une augmentation de l'invasion de plus de 3 fois a également été observée. À la suite de ces expériences, les niveaux d'ARNm des MMPs clés de l'invasion ont augmenté. Inversement chez les MCF-7, des cellules faiblement métastasiques, aucune augmentation n'a été observée.Bien que très utiles pour les traitements, les radiations pourraient contribuer à la migration des cellules cancéreuses, favorisant ainsi la formation des métastases et la récurrence du cancer du sein. La 4-OHE[indice inférieur 2] produite par les cellules cancéreuses influence aussi la capacité d'invasion de ces cellules. Pour contrer ces effets, il serait donc intéressant d'utiliser lors des traitements des inhibiteurs de MMPs. C'est une voie potentielle d'avenir pour empêcher toute récurrence du cancer du sein.

NF-kB, découvert en 1986 dans des lymphocytes B mature, est un groupe de facteurs de transcription impliqué dans plusieurs processus cellulaires différents tels les réponses immunitaires et inflammatoires, les processus du développement et de la croissance cellulaire ainsi que l'apoptose. L'activité de NF-kB est régulée par IkB ; lors de la phosphorylation de ce dernier, NF-kB est relocalisé vers le noyau. L'apoptose, une mort programmée identifiée en 1972, est caractérisée par une fragmentation de l'ADN et la formation de corps apoptotiques. Les mécanismes contrôlant ce phénomène sont très complexes. Un de ces mécanismes nécessite des protéases à cystéine aspartate-dépendantes que l'on nomme caspases. En utilisant le modèle cellulaire neuronal Neuro 2A, l'objectif de cette étude a été de déterminer si un stress oxydatif (H₂O₂) et un stress thermique (40 à 43°C) pouvaient induire l'apoptose par les mêmes mécanismes et si NF-kB avait un rôle dans la réponse cellulaire à ces deux stress. Une condensation de la chromatine, une caractéristique de l'apoptose, a été observée lors d'un stress oxydatif comme lors d'un stress thermique dans les Neuro 2A. Bien qu'une diminution de la polarité des membranes mitochondriale n'a été observée que pour le choc thermique, l'activation de l'apoptose serait induite au moins par la voie mitochondriale puisqu'il y a eu activation de la caspase 9 dans les deux stress. L'implication de la voie des récepteurs de mort est moins évidente; une activité de la caspase 8 est détectée dans les deux stress mais n'est que peu ou pas augmentée par rapport à l'absence de stress. La présence de H₂O₂ (0 à 25 µM) ne stimule pas l'activité de la caspase 3, mais active significativement l'activité de la caspase 6. Au contraire, durant le choc thermique (42 à 43°C), l'induction de la caspase 3 est très significative, soit environ près de dix fois celle des cellules témoins (37°C), et l'activité de la caspase 6 ne varie pas. La présence de l'inhibiteur Bay 11-7082 (inhibiteur de la phosphorylation de IkB, 4 µM) a peu d'influence sur l'activité des caspases 3 et 6 lors du stress oxydatif mais multiplie l'activité de la caspase 3 d'environ vingt fois lors d'un stress thermique. En conclusion, nos résultats ont permis de montrer l'implication de la voie mitochondriale (caspase 9) dans la mort apoptotique induite par H₂O₂ et le choc thermique et cela, dans la lignée neuronale Neuro 2A. La caspase effectrice 6 serait activée dans le stress oxydatif mais non thermique. Les résultats pour la caspase 6 dans le choc thermique demeurent à être vérifiés en analysant l'activité de cette caspase plus tardivement. En effet, la caspase 6 est située en aval de la caspase 3 dans les mécanismes apoptotiques. L'utilisation de Bay 11-7082 dans le choc thermique montre que NF-kB aurait un effet inhibiteur sur l'activation de la caspase 3. Le Bay 11-7082 en combinaison avec le choc thermique pourrait trouver application dans le traitement de tumeurs neuronales.

Le Cd est un métal hautement toxique, dont les expositions chroniques mènent à des maladies d'obstruction respiratoire, des troubles rénaux ainsi que des désordres osseux. Il est connu que le Cd a pour cible de liaison les groupements thiols des protéines, d'où sa forte affinité au GSH et à la MT. Le Cd peut générer un stress oxydatif possiblement par l'inhibition d'enzymes antioxydantes, telles que la CAT, la SOD, le GR et la GPx, in vitro et in vivo. L'accumulation de Cd au sein des cellules induit la synthèse de MT qui protège des dommages oxydatifs ou de la toxicité des métaux. Sachant que l'exposition au Cd entraîne une induction de Pgp, de récentes études stipulent que la Pgp serait responsable de l'efflux de Cd après surexpression des gènes de MDR. Pour sa part, le Zn est un métal essentiel capable d'induire le GSH, la HSP70, la SOD ainsi que la MT, et ce, sans induire de stress oxydatif. Le but de cette recherche fut de caractériser la différence de sensibilité des cellules alvéolaires (lignée A549) et bronchiolaires (lignée H441) face au Cd et de comparer leur capacité à développer une résistance au Cd suite à une préexposition au Cd ou au Zn. Les hypothèses sont : i) le Cd induit un déséquilibre redox dans les cellules pulmonaires et celles-ci ont des capacités antioxydantes ainsi que des capacités à exprimer des protéines de stress de réponse immédiate différentes et ii) le Zn est en mesure d'induire une résistance au Cd différente de celle induite par le Cd lui-même. Les résultats de viabilité cellulaire obtenus après exposition de 24 h au Cd indiquent une LC50 presque deux fois plus élevée pour les cellules H441 comparativement aux cellules A549 (118 ± 7 vs. 61 ± 6 µM). Cette différence n'est pas due à une différence d'accumulation intracellulaire du Cd, ni au niveau basal de GSH intracellulaire, mais serait possiblement due au niveau d'ARNm de HSP70 (évalué semi quantitativement) 2,4 fois plus élevé dans les cellules H441 que dans les cellules A549. Cependant, les résultats de viabilité cellulaire obtenus en présence de BSO, un inhibiteur de synthèse de GSH, révèlent que cet antioxydant détient un rôle important dans la résistance basale au Cd dans les deux lignées. La CAT semblerait avoir un rôle plus important dans la résistance basale au Cd dans les cellules A549 que dans les cellules H441, compte tenu des résultats obtenus en présence de 3AT, un inhibiteur de la CAT. Dans les deux lignées, une préexposition de 24 h au Cd ou au Zn n'a pas modifié les niveaux d'accumulation de 109Cd. Une préexposition de 24 h au Cd (20 µM) a presque doublé la valeur de LC50 dans les cellules A549 tandis qu'une préexposition de 24 h au Zn (40 µM) n'a induit aucune résistance. Inversement, dans les cellules H441, la préexposition de 24 h au Cd (40 µM) n'a pas eu d'effet, tandis que le Zn (40 µM) a augmenté la résistance au Cd avec une augmentation de 23% de la LC50. Dans les cellules A549, la HSP70 ainsi que la MDR1 ne sembleraient pas être impliquées dans l'induction de résistance au Cd, par le Cd. Malgré que les cellules H441 soient constitutivement plus résistantes au Cd que les cellules A549, les cellules A549 possèdent une meilleure capacité à développer une résistance que les cellules H441. Nos résultats révèlent ainsi des différences entre résistances basales et acquises entre les deux lignées cellulaires et montrent que les cellules A549 et H441 toutes deux d'origine pulmonaire ne réagissent pas de la même façon, ne développent pas les mêmes mécanismes de défense et n'expriment pas nécessairement les mêmes niveaux de protéines de stress. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cellules A549, cellules H441, Cadmium, Zinc, tolérance, GSH, MDR1, HSP70, stress oxydatif.

Thèse doctorat : Biochimie : Villeurbanne, INSA : 2004. / En annexe, 2 articles. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 162-183.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2009. / Bibliogr.: f. 61-69. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Au sein de notre organisme, l'équilibre entre les systèmes oxydants et antioxydants est étroitement contrôlé pour le maintien des fonctions biologiques vitales. Le stress oxydatif, défini comme un déséquilibre de la balance oxydative en faveur de l’oxydation, conduit à l’apparition de dégâts cellulaires associés au développement et à l’aggravation de très nombreuses pathologies ainsi qu’au vieillissement, notamment cutané. De nombreuses études visent à montrer les bénéfices d’une supplémentation en antioxydants dans la prévention des dommages liés au stress oxydatif. Dans ce sens, nos travaux ont porté sur l’identification de nouvelles sources naturelles d’antioxydants, valorisables comme ingrédients actifs dans des formulations nutraceutiques. Pour cela, nous avons sélectionné et extrait trente matières premières végétales et étudié les propriétés antioxydantes des extraits végétaux obtenus. Quatre extraits prometteurs ont été sélectionnés et caractérisés chimiquement afin d’identifier les composés phénoliques responsables de leurs propriétés antioxydantes. La contribution individuelle de ces composés phénoliques au potentiel antioxydant global des extraits a été estimée. Nous avons également étudié l’efficacité des extraits antioxydants sélectionnés sur le vieillissement cutané in vitro, par une étude globale de transcriptomique sur microarray, et confirmé les propriétés antioxydantes de ces extraits sur fibroblastes dermiques humains. / Within our body, the balance between oxidants and antioxidant systems is tightly controlled to maintain vital biological functions. Oxidative stress, defined as an imbalance of the oxidative balance in favor of oxidation, leading to the onset of cellular damage associated with the development and exacerbation of many diseases and with aging, including skin aging. Many studies aim to demonstrate the benefits of antioxidant supplementation in the prevention of damage related to oxidative stress. In that way, our work focused on identifying new sources of natural antioxidants, to value as active ingredients in nutraceutical formulations. For this, we selected and extracted thirty plant raw materials and studied the antioxidant properties of extracts obtained. Four promising extracts were selected and chemically characterized to identify the phenolic compounds responsible for their antioxidant properties. The individual contribution of these phenolic compounds to total antioxidant potential of extracts was estimated. We also studied the effectiveness of the selected antioxidants extracts on skin aging in vitro, by a transcriptomic study on microarray, and confirmed the antioxidant properties of these extracts on human dermal fibroblasts.