Este estudo teve como objetivo identificar mecanismos pelos quais rearranjos cromossômicos aparentemente equilibrados possam estar associados de maneira causal a determinados quadros clínicos. Para isso estudamos seis translocações cromossômicas aparentemente equilibradas, detectadas em pacientes com malformações congênitas, comprometimento neuropsicomotor ou déficit intelectual. Os pontos de quebra desses rearranjos foram mapeados por hibridação in situ fluorescente (FISH). A busca por microdeleções e duplicações genômicas foi realizada por a-CGH. Estudamos duas translocações esporádicas, t(7;17)(p.13;q24) e t(17;20)(q24.3;q11.2), nas quais os pontos de quebra no cromossomo 17 foram localizados, respectivamente, a 917-855 kb e 624-585 kb upstream ao gene SOX9, em segmentos sem genes mapeados. Ambos os portadores apresentavam alterações esqueléticas que indicaram o diagnóstico de displasia campomélica acampomélica. Não foram detectados desequilíbrios cromossômicos submicroscópicos por a-CGH. Essas translocações podem levar à expressão alterada do gene SOX9, ao afetar a região reguladora desse gene. Sequências dos outros cromossomos participantes da translocação, que foram aproximadas ao gene pelo rearranjo, também podem ter afetado sua expressão. O estudo dos rearranjos t(7;17) e t(17;20) forneceu informação para o entendimento da região reguladora do gene. As manifestações clínicas associadas à t(17;20) permitiram redefinir o limite distal do cluster distal de rearranjos do cromossomo 17 associados ao espectro de manifestações clínicas do SOX9. A presença de testículo no portador dessa translocação indicou um elemento conservado candidato a atuar como enhancer do SOX9, para o desenvolvimento do testículo. Duas outras translocações equilibradas estavam associadas a desequilíbrios submicroscópicos em cis aos pontos de quebra. Caracterizamos uma t(10;21)(p13;q22) esporádica associada a atraso do desenvolvimento neuropsicomotor, microcefalia e espasticidade generaliza. Os pontos de quebra dos cromossomos 10 e 21, foram mapeados, respectivamente, em segmentos de 440 kb e 172 kb. Três genes estão mapeados no segmento que contém o ponto de quebra do cromossomo 10 e três outros, no intervalo delimitado para o ponto de quebra no cromossomo 21. O gene CDNF, que pode ter sido interrompido pelo ponto de quebra do cromossomo 10, é altamente expresso no sistema nervoso. A análise por meio de a-CGH detectou quatro deleções no cromossomo 10 todas de novo, indicando a complexidade do rearranjo. Duas deleções estavam próximas ao ponto de quebra: uma deleção de 973 kb em 10p14 e uma outra de 1,15 Mb em 10p13, mapeadas a 3,27 Mb e 210 kb do ponto de quebra da translocação, respectivamente. Outras duas deleções no cromossomo 10 ocorreram no braço longo: uma deleção de 700 kb em 10q26.13 estaria a 110,10 Mb do ponto de quebra da translocação, mas não conseguimos mapeá-la por FISH; uma outra deleção de 1,66 Mb em 10q26.2-q26.3 foi mapeada a 114,68 Mb do ponto de quebra da translocação. Quatorze genes estão localizados nas regiões das microdeleções. Os genes GPR26, OPTN, CUGBP2 são altamente expressos no sistema nervoso e, assim como o CNDF, podem ser considerados candidatos ao efeito fenotípico. O modelo de chromothripsis, em que o rearranjo resulta de uma série de quebras na dupla fita do DNA, seguida de ligação aleatória dos fragmentos resultantes, pode explicar a formação da translocação t(10;21). Aplicando a-CGH no estudo de uma translocação t(X;22)(q22;q13) esporádica, detectamos duplicações de 490 kb e 570 kb, respectivamente, em 22q13 e Xq22. A análise por FISH revelou que as cópias adicionais desses segmentos estavam localizadas nos pontos de quebra dos cromossomos derivativos X (segmento duplicado de 22q13) e 22 (segmento duplicado de Xq22). Não há genes mapeados no segmento duplicado do cromossomo 22. Um dos 14 genes duplicados no cromossomo X é o PLP1 (proteolipid protein 1), cujas mutações de ponto e duplicações causam a doença de Pelizaeus- Merzbacher, caracterizada pela hipomielinização do sistema nervoso central e afetando quase que exclusivamente indivíduos do sexo masculino. O exame neurológico, incluindo ressonância magnética, mostrou que o quadro clínico da paciente é compatível com o da doença de Pelizaeus-Merzbacher. A análise do padrão de inativação do cromossomo X em linfócitos de sangue periférico da paciente, com base na metilação do gene AR e também citologicamente em metáfases, após incorporação de 5-BrdU, revelou que, na maioria das células, o cromossomo X normal está inativo. Esse padrão de inativação torna as células funcionalmente equilibradas quanto aos segmentos translocados. O PLP1, entretanto, tem uma cópia adicional no cromossomo 22, além das cópias localizadas nos cromossomos X e der(X). Portanto, duas cópias ativas do gene estão presentes nas células da portadora da t(X;22). O mecanismo de formação de rearranjos cromossômicos baseado em bolhas de replicação explicaria a formação de translocações com duplicação em ambos os pontos de quebra, como ocorreu nessa t(X;22). Estudamos também uma aparente t(2;22)(p14;q12) familial que cossegregava com quadro de atraso do desenvolvimento neuropsicomotor e dificuldade de aprendizado associados a dismorfismos craniofaciais e alterações de mãos. A identificação de duplicações e deleções submicroscópicas, por meio de a-CGH e sua validação por FISH revelaram que se tratava, na verdade, de rearranjo, complexo entre três cromossomos 2, 5 e 22: um segmento de 1,2 Mb de 2p14 inseriu-se no braço curto do cromossomo 5, um evento que pode ter causado a deleção de um segmento de 1,4 Mb em 5p15.1; no cromossomo derivativo der(22) um segmento adicional de 5q23.2- 23.3 inseriu-se no ponto de quebra. Todos os afetados da família eram portadores do der(2) e do der(22). No entanto, o der(5) não segregava com o quadro clínico e foi detectado em um individuo fenotipicamente normal da família. Todos os afetados eram portadores da duplicação de 6,6 Mb do braço longo do cromossomo 5 (5q23.2-23.3). Os 17 genes duplicados são candidatos para o quadro clínico, por aumento da dosagem de seus produtos. Outra alteração comum a todos os afetados foi a haploinsuficiência do gene SLC1A4 mapeado em 2p14 e altamente expresso no sistema nervoso. É interessante que a deleção em 2p14, consequente à ausência do der(5), está restrita aos dois afetados que aparentam tem maior déficit cognitivo. Além do SLC1A4 , quatro genes mapeados nesse segmento CEP68, RAB1A, ACTR2 e SPRED2 podem contribuir para a variabilidade clínica dos afetados. A translocação t(2;5;22) pode ter-se originado a partir de duas quebras no braço curto do cromossomo 2, duas no braço curto e duas outras no braço longo do cromossomo 5 e uma quebra no braço longo do cromossomo 22. As quebras teriam ocorrido simultaneamente em um único evento. Após reunião de extremidades quebradas, formaram-se os cromossomos derivativos. Investigamos por a-CGH uma t(2;16)(q35;q24.1) esporádica cujos pontos de quebra foram mapeados anteriormente por FISH; nenhum gene estava mapeado nos segmentos que continham esses pontos de quebra. Não detectamos desequilíbrios cromossômicos submicroscópicos. A paciente portadora da translocação t(2;16) tinha quatro dígitos nas duas mãos e hexadactilia nos pés. A cerca de 1 Mb do ponto de quebra do cromossomo 2 está mapeado o gene IHH, que atua no desenvolvimento dos membros. A translocação pode ter interrompido elemento regulador do IHH ou separado o gene de elemento(s) regulador(es), levando à alteração de sua expressão e ao fenótipo. Este estudo fornece evidência adicional da importância da busca de desequilíbrios cromossômicos submicroscópicos em associação com rearranjos aparentemente equilibrados. Em três das seis translocações estudadas - t(10;21), t(2;22), t(X;22) - foram detectados desequilíbrios cromossômicos submicroscópicos em cis aos pontos de quebra, que podem ser responsáveis pelas manifestações clínicas dos portadores. Este estudo ressalta ainda a importância da técnica de FISH na análise dos desequilíbrios cromossômicos detectados por array, permitindo determinar a relação entre as perdas ou ganhos de segmentos submicroscópicos e os rearranjos equilibrados. A caracterização de rearranjos equilibrados neste estudo também contribuiu para sugerir mecanismos para sua formação / This study aimed at identifying mechanisms that lead to phenotypic abnormalities in carriers of balanced chromosomal rearrangements. We studied six apparently balanced chromosomal translocations detected in patients with congenital malformations, intellectual impairment or neuropsychomotor delay. Breakpoint mapping of apparently balanced chromosomal rearrangements was performed by fluorescence in situ hybridization (FISH), and cryptic genomic imbalances were investigated by array comparative genomic hybridization (a-CGH). We studied two sporadic translocations, t(7;17) (p13;q24) and t(17;20) (q24.3,q11.2). The breakpoints were located on chromosome 17, respectively, 917-855 kb and 624-585 kb upstream the SOX9 gene. There are no genes mapped to these segments. Patients had skeletal abnormalities that led to the diagnosis of acampomelic campomelic dysplasia. No submicroscopic chromosomal imbalances were detected by a-CGH. These translocations can alter gene expression by directly disrupting regulatory elements or by a position effect. The translocation t(7;17) and (17;20) provided additional information regarding the regulatory region of SOX9. The clinical manifestations associated with the translocation t(17;20) allowed the redefining of the limits of the distal breakpoint cluster of rearrangements on chromosome 17, which are associated with SOX9-related disorders. A conserved element was identified as a candidate SOX9 enhancer for testis development. Two additional sporadic translocations were associated with submicroscopic imbalances in cis to the breakpoints: t(10;21) and t(X;22). The translocation t(10;21)(p13;q22) was present in a girl with delayed motor development, microcephaly and generalized spasticity. The breakpoints on chromosomes 10 and 21 were mapped to 440 kb and 172 kb segments, respectively. Among the genes mapped to these breakpoint regions, only CDNF on chromossome 10, is highly expressed in the nervous system. Four de novo deletions on chromosome 10 were identified by a-CGH, revealing the complexity of the rearrangement. Two deletions were located at the vicinity of the translocation breakpoint: a 973 kb deletion on 10p14 and a 1.15 Mb deletion on 10p13 located, respectively, 3.27 Mb and 210 kb distal to the translocation breakpoint. Two other deletions were detected on the long arm of chromosome 10: a 700 kb deletion on 10q26.13, located 110.10 Mb distal to the translocation breakpoint, which we could not mapped by FISH; and a 1.66 Mb deletion on 10q26.2-q26.3, located 114.68 Mb distal to the translocation breakpoint. Fourteen genes are mapped to the microdeletion regions. Among these genes, GPR26, OPTN, CUGBP2 are highly expressed in the nervous system and, together with CNDF, are candidates for having clinical effects. The chromothripsis model, in which rearrangements result from a series of simultaneous double-stranded breaks followed by random joining of chromosomal fragments, might explain the formation of this t(10,21) translocation. Applying a-CGH to the apparently balanced translocation t(X;22)(q22;q13) carried by a girl, we detected duplicated segments on 22q13 and Xq22, encompassing 490 kb and 570 kb, respectively. FISH analysis revealed that the additional copies were located to the breakpoints of the derivative X chromosome (22q13 duplicated segment) and of the derivative 22 chromosome (Xq22 duplicated segment). No genes are mapped to the duplicated segment of chromosome 22. One of the 14 duplicated genes on the X chromosome is PLP1 (proteolipid protein 1). PLP1 point mutations and duplications cause Pelizaeus-Merzbacher disease, characterized by hypomyelination of the central nervous system, and affecting almost exclusively males. Neurological examination of the patient, including MRI showed that her clinical manifestations were compatible with Pelizaeus-Merzbacher disease. The pattern of X chromosome inactivation was determined in peripheral blood lymphocytes, based on the AR gene methylation, and cytologically, in metaphases spreads, after 5-BrdU incorporation, and showed that the normal X chromosome was the inactive one in the majority of cells. This pattern of X inactivation makes cells functionally balanced for the translocated segments. A copy of the PLP1 gene, however, is present on chromosome 22, in addition to the copies located on the chromosomes X and der(X). Thus, two active copies of the gene are present in the cells, irrespective of the X-inactivation pattern. A mechanism based on replication bubbles can explain the formation of translocations with duplication at the breakpoints, such as this t(X;22). An apparently balanced familial translocation t(2;22)(p13;q12.2) was detected in association with learning disability and craniofacial and hand dysmorphisms. The combination of a-CGH and FISH revealed that the rearrangement, identified by Gbanding as a two-break balanced translocation, was a more complex three-chromosome rearrangement: a segment from chromosome 2 was inserted into chromosome 5 short arm, an event that probably caused a 5p15.1 deletion; on chromosome 22 a segment from 5q23.2-23.3 was inserted into the breakpoint. Chromosomes der(2) and der(22) were present in all affected individuals. However, the der(5) did not segregate with the clinical phenotype, and was detected in a phenotypically normal individual. The 6.6 Mb duplication of the long arm of chromosome 5 was the imbalance common to all affected individuals. The 17 genes in this region are candidates for the clinical phenotypes through dosage effect. In addition, common to all affected individuals is the haploinsufficiency of SLC1A4, a gene highly expressed in the nervous system, which is encompassed by the deletion on chromosome 2. Interestingly, learning disabilities were more pronounced in those patients who also carried chromosome 2 deletion. CEP68, RAB1A, ACTR2 and SPRED2, mapped to this deleted segment, might contribute to the variability of the clinical phenotype in the family. The translocation t(2;5;22) might have originated from a series of simultaneously occurring brakes, two on the short arm of chromosome 2, four breaks on the short arm and two on the long arm of chromosome 5, and one break on the long arm of chromosome 22. We also investigated by a-CGH a sporadic translocation t(2;16)(q35;q24.1) whose carrier had hand and feet defects. Submicroscopic imbalances were not detected. Previously performed FISH delimited the breakpoints segments on chromosomes 2 and 16, which encompassed no genes. The IHH gene, which is involved in limb development, is located approximately 1 Mb upstream chromosome 2 breakpoint. Therefore, the translocation might have disrupted a regulatory element of IHH or, alternatively, separated the gene from a regulatory region, thus altering IHH expression. This study provides further evidence for the occurrence of submicroscopic chromosomal imbalances in association with apparently balanced rearrangements. In three out of six translocations - t(10,21), t(2;5;22), t(X;22) - cryptic duplications/deletions in cis to the breakpoints were detected, which might account for the clinical manifestations of the patients. This study also highlights the importance of FISH in the analysis of genomic imbalances detected by array in determining how losses and gains of submicroscopic segments relate to the rearranged chromosomes. The characterization of the balanced translocations in this study also contributed to suggest mechanisms for their formation

Este trabalho teve o objetivo de identificar genes candidatos para deficiência mental de herança ligada ao cromossomo X (DMLX). Foram investigadas quatro famílias, nas quais a deficiência mental de causa desconhecida segregava num padrão típico de herança ligada ao X, e 24 irmandades que incluíam pelo menos dois afetados do sexo masculino. O padrão de inativação do cromossomo X foi determinado nas mães dos afetados, pois desvios extremos no padrão de inativação são frequentes em mulheres portadoras de mutações no cromossomo X que causam DMLX. Nas famílias com padrão de herança ligada ao X, a deficiência mental foi mapeada, usando marcadores moleculares do tipo microssatélite, localizados ao longo do cromossomo X. Desequilíbrios cromossômicos submicroscópicos foram investigados por hibridação genômica comparativa baseada em array (array-CGH). Genes candidatos posicionais que já haviam sido associados a deficiência mental foram sequenciados pelo método de Sanger, em busca de mutações patogênicas. Em três famílias com DMLX, o probando teve seu exoma sequenciado. Nas três famílias com DMLX em que o sequenciamento do exoma foi realizado, foram detectadas mutações missense, levando à substituição de resíduos de aminoácidos conservados, que segregavam com a deficiência mental. Essas mutações foram consideradas como prováveis causas dos fenótipos nessas famílias: c.12378C>G no gene HUWE1 (HECT, UBA and WWE domain containing 1, E3 ubiquitin protein ligase); c.1413C>A no gene SHROOM4 (shroom family member 4) e c.262G>A no gene KIAA2022. As mulheres heterozigóticas quanto a essas mutações apresentaram desvio completo de inativação do cromossomo X (100:0). Mutações de ponto ou interrupção desses genes por rearranjos cromossômicos foram previamente descritas em alguns pacientes com deficiência mental. Em uma família, em que a DMLX estava associada a microcefalia e malformação de Dandy-Walker, uma microduplicação de aproximadamente 300 kb em Xq28 (ChrX :153,578,110-153,880,794;Hg19) foi detectada segregando com a doença. As mulheres heterozigóticas quanto a essa duplicação apresentaram desvios de inativação do X (80:20 e 90:10). Duplicações semelhantes foram anteriormente descritas em três famílias europeias e em um caso esporádico; a malformação de Dandy-Walker foi documentada em alguns desses pacientes. No estudo das 24 irmandades com pelo menos dois indivíduos do sexo masculino apresentando deficiência mental, o padrão de inativação do cromossomo X de suas mães foi determinado. Quatro mulheres (16,7%) apresentaram desvio total de inativação do cromossomo X (100:0), frequência significativamente maior do que a descrita para população geral de mulheres adultas (cerca de 2 %). Considerando que desvios extremos de inativação do cromossomo X são observados em aproximadamente 30% das portadoras de mutações que causam DMLX, concluiu-se que as quatro mães de homens que apresentam deficiência mental eram provavelmente portadores de mutações no cromossomo X, causadoras da deficiência mental em seus filhos. Não foram encontradas microdeleções ou microduplicações no cromossomo X nos probandos das quatro irmandades. / This study aimed at identifying candidate genes for X-linked intellectual disability (ID). Four families in which ID of unknown cause segregated as an X-linked trait, and 24 sibships with at least two affected males were investigated. The pattern of X-inactivation was determined in the mothers of affected males, taking into account that extremely skewing of X-inactivation is frequently found in women carrying mutations causative of X-linked intellectual disability (XLID). In the XLID families, ID was mapped by the genotyping of microsatellite markers localized throughout the X chromosome. Cryptic X-chromosome imbalances were investigated by array-based comparative genomic hybridization (a-CGH). Positional candidate genes that had been associated with ID were directly sequenced in the search for causative mutations. In three XLID families, the propositus had their exome sequenced. In three XLID families missense mutations that led to substitutions of conservative aminoacid residues were found that segregated with ID, and were probably causative of the clinical phenotypes: c.12378C>G in HUWE1 (HECT, UBA and WWE domain containing 1, E3 ubiquitin protein ligase) gene; c.1413C>A in the SHROOM4 (shroom family member 4) gene; c.262G>A in the KIAA2022 gene. Heterozygotes for these mutations had completely skewed X-inactivation (100:0 inactivation ratio). Point mutations or disruption of these genes by rearrangement breakpoints have been previously described in a few patients with ID. In one family in which XLID was associated with microcephaly and Dandy-Walker malformation, a duplication of approximately 300 kb at Xq28 (ChrX:153,578,110-153,880,794 - Hg19) was found segregating with the disease. Heterozygotes for this duplication had skewed X-inactivation (80:20 and 90:10 inactivation ratios). Similar duplications have been described in three European families and one sporadic case, Dandy-Walker malformation being documented in some patients. In the study of the 24 sibships with at least two males presenting with ID, the maternal pattern of X-inactivation was determined. Four women (16.7%) showed completely skewing of X-inactivation (100:0 inactivation ratio), a frequency significantly higher than the reported frequency of skewing >= 95% in women from the general population (about 2%). Considering this finding and that extremely skewed X-inactivation have been reported in about 30% of carriers of mutations causing XLID, it was assumed that the four mothers of males presenting with ID were most probably carriers of the mutations causative of ID in their sons. Chromosome X microimbalances were not found in the propositus, in these four sibships.

Este estudo teve como objetivo identificar mecanismos pelos quais rearranjos cromossômicos aparentemente equilibrados possam estar associados de maneira causal a determinados quadros clínicos. Para isso estudamos seis translocações cromossômicas aparentemente equilibradas, detectadas em pacientes com malformações congênitas, comprometimento neuropsicomotor ou déficit intelectual. Os pontos de quebra desses rearranjos foram mapeados por hibridação in situ fluorescente (FISH). A busca por microdeleções e duplicações genômicas foi realizada por a-CGH. Estudamos duas translocações esporádicas, t(7;17)(p.13;q24) e t(17;20)(q24.3;q11.2), nas quais os pontos de quebra no cromossomo 17 foram localizados, respectivamente, a 917-855 kb e 624-585 kb upstream ao gene SOX9, em segmentos sem genes mapeados. Ambos os portadores apresentavam alterações esqueléticas que indicaram o diagnóstico de displasia campomélica acampomélica. Não foram detectados desequilíbrios cromossômicos submicroscópicos por a-CGH. Essas translocações podem levar à expressão alterada do gene SOX9, ao afetar a região reguladora desse gene. Sequências dos outros cromossomos participantes da translocação, que foram aproximadas ao gene pelo rearranjo, também podem ter afetado sua expressão. O estudo dos rearranjos t(7;17) e t(17;20) forneceu informação para o entendimento da região reguladora do gene. As manifestações clínicas associadas à t(17;20) permitiram redefinir o limite distal do cluster distal de rearranjos do cromossomo 17 associados ao espectro de manifestações clínicas do SOX9. A presença de testículo no portador dessa translocação indicou um elemento conservado candidato a atuar como enhancer do SOX9, para o desenvolvimento do testículo. Duas outras translocações equilibradas estavam associadas a desequilíbrios submicroscópicos em cis aos pontos de quebra. Caracterizamos uma t(10;21)(p13;q22) esporádica associada a atraso do desenvolvimento neuropsicomotor, microcefalia e espasticidade generaliza. Os pontos de quebra dos cromossomos 10 e 21, foram mapeados, respectivamente, em segmentos de 440 kb e 172 kb. Três genes estão mapeados no segmento que contém o ponto de quebra do cromossomo 10 e três outros, no intervalo delimitado para o ponto de quebra no cromossomo 21. O gene CDNF, que pode ter sido interrompido pelo ponto de quebra do cromossomo 10, é altamente expresso no sistema nervoso. A análise por meio de a-CGH detectou quatro deleções no cromossomo 10 todas de novo, indicando a complexidade do rearranjo. Duas deleções estavam próximas ao ponto de quebra: uma deleção de 973 kb em 10p14 e uma outra de 1,15 Mb em 10p13, mapeadas a 3,27 Mb e 210 kb do ponto de quebra da translocação, respectivamente. Outras duas deleções no cromossomo 10 ocorreram no braço longo: uma deleção de 700 kb em 10q26.13 estaria a 110,10 Mb do ponto de quebra da translocação, mas não conseguimos mapeá-la por FISH; uma outra deleção de 1,66 Mb em 10q26.2-q26.3 foi mapeada a 114,68 Mb do ponto de quebra da translocação. Quatorze genes estão localizados nas regiões das microdeleções. Os genes GPR26, OPTN, CUGBP2 são altamente expressos no sistema nervoso e, assim como o CNDF, podem ser considerados candidatos ao efeito fenotípico. O modelo de chromothripsis, em que o rearranjo resulta de uma série de quebras na dupla fita do DNA, seguida de ligação aleatória dos fragmentos resultantes, pode explicar a formação da translocação t(10;21). Aplicando a-CGH no estudo de uma translocação t(X;22)(q22;q13) esporádica, detectamos duplicações de 490 kb e 570 kb, respectivamente, em 22q13 e Xq22. A análise por FISH revelou que as cópias adicionais desses segmentos estavam localizadas nos pontos de quebra dos cromossomos derivativos X (segmento duplicado de 22q13) e 22 (segmento duplicado de Xq22). Não há genes mapeados no segmento duplicado do cromossomo 22. Um dos 14 genes duplicados no cromossomo X é o PLP1 (proteolipid protein 1), cujas mutações de ponto e duplicações causam a doença de Pelizaeus- Merzbacher, caracterizada pela hipomielinização do sistema nervoso central e afetando quase que exclusivamente indivíduos do sexo masculino. O exame neurológico, incluindo ressonância magnética, mostrou que o quadro clínico da paciente é compatível com o da doença de Pelizaeus-Merzbacher. A análise do padrão de inativação do cromossomo X em linfócitos de sangue periférico da paciente, com base na metilação do gene AR e também citologicamente em metáfases, após incorporação de 5-BrdU, revelou que, na maioria das células, o cromossomo X normal está inativo. Esse padrão de inativação torna as células funcionalmente equilibradas quanto aos segmentos translocados. O PLP1, entretanto, tem uma cópia adicional no cromossomo 22, além das cópias localizadas nos cromossomos X e der(X). Portanto, duas cópias ativas do gene estão presentes nas células da portadora da t(X;22). O mecanismo de formação de rearranjos cromossômicos baseado em bolhas de replicação explicaria a formação de translocações com duplicação em ambos os pontos de quebra, como ocorreu nessa t(X;22). Estudamos também uma aparente t(2;22)(p14;q12) familial que cossegregava com quadro de atraso do desenvolvimento neuropsicomotor e dificuldade de aprendizado associados a dismorfismos craniofaciais e alterações de mãos. A identificação de duplicações e deleções submicroscópicas, por meio de a-CGH e sua validação por FISH revelaram que se tratava, na verdade, de rearranjo, complexo entre três cromossomos 2, 5 e 22: um segmento de 1,2 Mb de 2p14 inseriu-se no braço curto do cromossomo 5, um evento que pode ter causado a deleção de um segmento de 1,4 Mb em 5p15.1; no cromossomo derivativo der(22) um segmento adicional de 5q23.2- 23.3 inseriu-se no ponto de quebra. Todos os afetados da família eram portadores do der(2) e do der(22). No entanto, o der(5) não segregava com o quadro clínico e foi detectado em um individuo fenotipicamente normal da família. Todos os afetados eram portadores da duplicação de 6,6 Mb do braço longo do cromossomo 5 (5q23.2-23.3). Os 17 genes duplicados são candidatos para o quadro clínico, por aumento da dosagem de seus produtos. Outra alteração comum a todos os afetados foi a haploinsuficiência do gene SLC1A4 mapeado em 2p14 e altamente expresso no sistema nervoso. É interessante que a deleção em 2p14, consequente à ausência do der(5), está restrita aos dois afetados que aparentam tem maior déficit cognitivo. Além do SLC1A4 , quatro genes mapeados nesse segmento CEP68, RAB1A, ACTR2 e SPRED2 podem contribuir para a variabilidade clínica dos afetados. A translocação t(2;5;22) pode ter-se originado a partir de duas quebras no braço curto do cromossomo 2, duas no braço curto e duas outras no braço longo do cromossomo 5 e uma quebra no braço longo do cromossomo 22. As quebras teriam ocorrido simultaneamente em um único evento. Após reunião de extremidades quebradas, formaram-se os cromossomos derivativos. Investigamos por a-CGH uma t(2;16)(q35;q24.1) esporádica cujos pontos de quebra foram mapeados anteriormente por FISH; nenhum gene estava mapeado nos segmentos que continham esses pontos de quebra. Não detectamos desequilíbrios cromossômicos submicroscópicos. A paciente portadora da translocação t(2;16) tinha quatro dígitos nas duas mãos e hexadactilia nos pés. A cerca de 1 Mb do ponto de quebra do cromossomo 2 está mapeado o gene IHH, que atua no desenvolvimento dos membros. A translocação pode ter interrompido elemento regulador do IHH ou separado o gene de elemento(s) regulador(es), levando à alteração de sua expressão e ao fenótipo. Este estudo fornece evidência adicional da importância da busca de desequilíbrios cromossômicos submicroscópicos em associação com rearranjos aparentemente equilibrados. Em três das seis translocações estudadas - t(10;21), t(2;22), t(X;22) - foram detectados desequilíbrios cromossômicos submicroscópicos em cis aos pontos de quebra, que podem ser responsáveis pelas manifestações clínicas dos portadores. Este estudo ressalta ainda a importância da técnica de FISH na análise dos desequilíbrios cromossômicos detectados por array, permitindo determinar a relação entre as perdas ou ganhos de segmentos submicroscópicos e os rearranjos equilibrados. A caracterização de rearranjos equilibrados neste estudo também contribuiu para sugerir mecanismos para sua formação / This study aimed at identifying mechanisms that lead to phenotypic abnormalities in carriers of balanced chromosomal rearrangements. We studied six apparently balanced chromosomal translocations detected in patients with congenital malformations, intellectual impairment or neuropsychomotor delay. Breakpoint mapping of apparently balanced chromosomal rearrangements was performed by fluorescence in situ hybridization (FISH), and cryptic genomic imbalances were investigated by array comparative genomic hybridization (a-CGH). We studied two sporadic translocations, t(7;17) (p13;q24) and t(17;20) (q24.3,q11.2). The breakpoints were located on chromosome 17, respectively, 917-855 kb and 624-585 kb upstream the SOX9 gene. There are no genes mapped to these segments. Patients had skeletal abnormalities that led to the diagnosis of acampomelic campomelic dysplasia. No submicroscopic chromosomal imbalances were detected by a-CGH. These translocations can alter gene expression by directly disrupting regulatory elements or by a position effect. The translocation t(7;17) and (17;20) provided additional information regarding the regulatory region of SOX9. The clinical manifestations associated with the translocation t(17;20) allowed the redefining of the limits of the distal breakpoint cluster of rearrangements on chromosome 17, which are associated with SOX9-related disorders. A conserved element was identified as a candidate SOX9 enhancer for testis development. Two additional sporadic translocations were associated with submicroscopic imbalances in cis to the breakpoints: t(10;21) and t(X;22). The translocation t(10;21)(p13;q22) was present in a girl with delayed motor development, microcephaly and generalized spasticity. The breakpoints on chromosomes 10 and 21 were mapped to 440 kb and 172 kb segments, respectively. Among the genes mapped to these breakpoint regions, only CDNF on chromossome 10, is highly expressed in the nervous system. Four de novo deletions on chromosome 10 were identified by a-CGH, revealing the complexity of the rearrangement. Two deletions were located at the vicinity of the translocation breakpoint: a 973 kb deletion on 10p14 and a 1.15 Mb deletion on 10p13 located, respectively, 3.27 Mb and 210 kb distal to the translocation breakpoint. Two other deletions were detected on the long arm of chromosome 10: a 700 kb deletion on 10q26.13, located 110.10 Mb distal to the translocation breakpoint, which we could not mapped by FISH; and a 1.66 Mb deletion on 10q26.2-q26.3, located 114.68 Mb distal to the translocation breakpoint. Fourteen genes are mapped to the microdeletion regions. Among these genes, GPR26, OPTN, CUGBP2 are highly expressed in the nervous system and, together with CNDF, are candidates for having clinical effects. The chromothripsis model, in which rearrangements result from a series of simultaneous double-stranded breaks followed by random joining of chromosomal fragments, might explain the formation of this t(10,21) translocation. Applying a-CGH to the apparently balanced translocation t(X;22)(q22;q13) carried by a girl, we detected duplicated segments on 22q13 and Xq22, encompassing 490 kb and 570 kb, respectively. FISH analysis revealed that the additional copies were located to the breakpoints of the derivative X chromosome (22q13 duplicated segment) and of the derivative 22 chromosome (Xq22 duplicated segment). No genes are mapped to the duplicated segment of chromosome 22. One of the 14 duplicated genes on the X chromosome is PLP1 (proteolipid protein 1). PLP1 point mutations and duplications cause Pelizaeus-Merzbacher disease, characterized by hypomyelination of the central nervous system, and affecting almost exclusively males. Neurological examination of the patient, including MRI showed that her clinical manifestations were compatible with Pelizaeus-Merzbacher disease. The pattern of X chromosome inactivation was determined in peripheral blood lymphocytes, based on the AR gene methylation, and cytologically, in metaphases spreads, after 5-BrdU incorporation, and showed that the normal X chromosome was the inactive one in the majority of cells. This pattern of X inactivation makes cells functionally balanced for the translocated segments. A copy of the PLP1 gene, however, is present on chromosome 22, in addition to the copies located on the chromosomes X and der(X). Thus, two active copies of the gene are present in the cells, irrespective of the X-inactivation pattern. A mechanism based on replication bubbles can explain the formation of translocations with duplication at the breakpoints, such as this t(X;22). An apparently balanced familial translocation t(2;22)(p13;q12.2) was detected in association with learning disability and craniofacial and hand dysmorphisms. The combination of a-CGH and FISH revealed that the rearrangement, identified by Gbanding as a two-break balanced translocation, was a more complex three-chromosome rearrangement: a segment from chromosome 2 was inserted into chromosome 5 short arm, an event that probably caused a 5p15.1 deletion; on chromosome 22 a segment from 5q23.2-23.3 was inserted into the breakpoint. Chromosomes der(2) and der(22) were present in all affected individuals. However, the der(5) did not segregate with the clinical phenotype, and was detected in a phenotypically normal individual. The 6.6 Mb duplication of the long arm of chromosome 5 was the imbalance common to all affected individuals. The 17 genes in this region are candidates for the clinical phenotypes through dosage effect. In addition, common to all affected individuals is the haploinsufficiency of SLC1A4, a gene highly expressed in the nervous system, which is encompassed by the deletion on chromosome 2. Interestingly, learning disabilities were more pronounced in those patients who also carried chromosome 2 deletion. CEP68, RAB1A, ACTR2 and SPRED2, mapped to this deleted segment, might contribute to the variability of the clinical phenotype in the family. The translocation t(2;5;22) might have originated from a series of simultaneously occurring brakes, two on the short arm of chromosome 2, four breaks on the short arm and two on the long arm of chromosome 5, and one break on the long arm of chromosome 22. We also investigated by a-CGH a sporadic translocation t(2;16)(q35;q24.1) whose carrier had hand and feet defects. Submicroscopic imbalances were not detected. Previously performed FISH delimited the breakpoints segments on chromosomes 2 and 16, which encompassed no genes. The IHH gene, which is involved in limb development, is located approximately 1 Mb upstream chromosome 2 breakpoint. Therefore, the translocation might have disrupted a regulatory element of IHH or, alternatively, separated the gene from a regulatory region, thus altering IHH expression. This study provides further evidence for the occurrence of submicroscopic chromosomal imbalances in association with apparently balanced rearrangements. In three out of six translocations - t(10,21), t(2;5;22), t(X;22) - cryptic duplications/deletions in cis to the breakpoints were detected, which might account for the clinical manifestations of the patients. This study also highlights the importance of FISH in the analysis of genomic imbalances detected by array in determining how losses and gains of submicroscopic segments relate to the rearranged chromosomes. The characterization of the balanced translocations in this study also contributed to suggest mechanisms for their formation

La déficience intellectuelle (DI) est une affection fréquente à causes multiples et souvent inconnues. Durant les 30 dernières années, l’examen utilisé pour l’exploration des anomalies chromosomiques chez des patients libanais présentant une DI était le caryotype standard. Le but de ce projet de thèse était d'appliquer pour la 1ère fois au Liban les technologies d'hybridation sur puces à ADN dans la recherche de nouveaux microremaniements (CNV) impliquant des gènes susceptibles d'engendrer une DI.Ainsi, les ADNs de 99 contrôles et de 185 patients libanais présentant une DI inexpliquée ont été hybridés sur des puces à ADN. Nous avons, par la suite, classé les CNVs identifiés en groupes selon leur transmission, leur contenu en gènes et leur localisation.Nous avons identifié 29 CNVs pathogènes associés à des syndromes ou gènes morbides responsables du phénotype recherché et 90 variants de signification inconnue dont 25 ont été investigués. On a retrouvé 18 de ces derniers comme probablement bénins, 5 comme probablement pathogènes, et 2 à investiguer puisqu'ils sont rapportés comme pathogènes dans la littérature mais hérités d’un parent sain dans l’étude. Nous avons élaboré 4 cas des CNVs pathogènes, 3 des CNVs probablement pathogènes qui sont des microdélétions à l'état homozygote chez des sujets issus de mariages consanguins; et les 2 CNVs à investiguer.Finalement, nous avons discuté les avantages de cette technique permettant l'identification chez 8% des patients ayant une DI inexpliquée, des microremaniements non identifiables par caryotype standard. Cependant nous avons aussi souligné la complexité, les limites et certaines incertitudes d’interprétation des résultats. / Chromosomal imbalances are the most frequent cause of intellectual disability (ID). In Lebanon, during the past 30 years, screening of these imbalances was done using standard karyotyping. However, the resolution of this test was insufficient to detect submicroscopic chromosomal imbalances (CNV). The aim of this thesis was to apply, for the first time in Lebanon, advanced techniques like the chromosomal microarray analysis (CMA), capable of detecting CNVs. Therefore, we screened the DNAs of 185 Lebanese subjects having unexplained ID and those of 99 healthy controls.CNVs identified were classified into groups upon their inheritance status, gene/microRNA content, and their localization.We identified 29 pathogenic CNVs associated to known syndromes or to morbid genes responsible for the patient's phenotype. We also found 90 variants of unknown significance of which 25 were investigated. 18 of the latter were likely benign, 5 were considered as probably pathogenic, and 2 needed future investigations to be classified, as they were considered as pathogenic in the literature but were inherited from a normal parent in this study.We discussed interesting cases by developing 4 pathogenic CNVs, 3 probably pathogenic that were homozygous microdeletions found in patients issued from consanguineous parents, and the 2 CNVs that required further investigations.Finally, we discussed the advantage of this CMA technique that lead to the identification of microimbalances unseen by a standard karyotype in 8% (14/174) of the patients with unexplained ID. Moreover, we mentioned the complexity, limitation and difficulty of interpretation of some results.