A dinâmica folicular, bem como a preparação do endométrio para a gestação, é dependente do estabelecimento de vascularização adequada. Alguns estudos apontam para a importância do tratamento com eCG após o emprego de protocolos de IATF, de forma a aumentar as taxas de ovulação e prenhez, e para a uma possível propriedade angiogênica, influenciando o fluxo sanguíneo e a vascularização. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência do eCG na espessura e área do endométrio e miométrio, calibre e área da artéria uterina do corno ipsilateral e também na densidade vascular do endométrio e miométrio de vacas submetidas a tratamentos de sincronização (grupo controle), estimulação do folículo dominante e superovulação. Para tal, foram utilizadas 16 vacas mestiças de Nelore ciclando com escore corporal entre 2 e 3 que foram divididas em 3 grupos de acordo com tratamento hormonal: o grupo controle foi submetido apenas ao protocolo de sincronização da ovulação (n=5), o grupo estimulado recebeu 400 UI de eCG no dia 4 após início do protocolo (n=6) e o grupo superovulado recebeu 2000UI de eCG no dia 8 após início do tratamento (n=5). No dia 5 após a ovulação (p.o) foram realizados exames ultrasonográficos para mensuração do miométrio e endométrio dos cornos uterinos, bem como para análise do calibre da artéria uterina. Os animais foram abatidos, os úteros coletados no dia 6 p.o. e imediatamente fixados em paraformaldeido a 4%. Para análise da densidade vascular, foi realizada imunohistoquímica para o KDR com o intuito de marcação das células endoteliais e contagem dos vasos por estereologia. As espessuras e áreas, tanto do miométrio quanto do endométrio, não foram influenciadas pelos tratamentos. A artéria uterina nos animais superovulados apresentou maior calibre do que nos animais do grupo controle (p< 0,05). A densidade vascular do endométrio nos animais estimulados foi menor quando comparada à dos animais do grupo controle (p<0,05), e no grupo superovulado, a densidade vascular apresentou-se diminuída (p<0,05) no miométrio. Os resultados obtidos sugerem que o aumento de vascularização do endométrio após tratamentos com ECG, relatado em outros trabalhos, seja provavelmente influenciado pelo concepto e não exclusivamente pelo tratamento. Além disso, a influência do eCG no útero pode ser dependente tanto da dose quanto do estágio do ciclo estral. / Follicle dynamic, as well as the uterus preparation for gestation, is dependent of an adequate vascularization establishment. Currently, many studies point towards the importance of eCG treatment following fixed-time artificial insemination (FTAI), in a manner to improve ovulation and gestational rates. Moreover, eCG have been implicated in angiogenesis, leading to important changes in uterine blood flow and vascularization. Thus, the present study was designed to investigate the influence of eCG on the endometrial and myometrial thickness and area; on the caliber and area of the uterine artery of the ipsilateral horn; and, on endometrial and myometrial uterine vascular density of cows submitted to sincronization (control group), stimulation (stimulated group), and superovulatory (superovulated group) treatments. For that, we used 16 cows with body score between 2 and 3, randomly distributed into the 3 above described groups: the cows of the control group (n = 5) did not receive eCG, while the cows of the stimulated group (n = 6) and superovulated group 3 (n = 5) received, respectively, 400 UI and 2000 UI of eCG at days 4 and 8 after the protocol beginning. For endometrial and myometrial measurements, as well as for uterine artery caliber and area analysis, ultrasonographic evaluations were done at day 5 after ovulation. At day 6, the animals were slaughtered, the uterus were harvested and fixed in 4% paraformaldehyde. In order to analyze the vascular density, immunohistochemistry for KDR detection and blood vessels counting by stereology were performed. In all studied groups, treatments did not influence either uterine wall thickness or area. In the superovulated animals, the uterine artery presented higher caliber than in the control ones (P<0.05). Endometrial vascular density of stimulated animals in the ipsilateral uterine horn was lower when compared to that of the control (P<0.05),and in the superovulated, vascular density was lower in the myometrium (P<0.05). These results suggest that the endometrial vascularization increase following eCG treatment, described by other groups, is probably influenced by the concept, not only by the treatment. Moreover, the influence of eCG in the uterus could be dependent of both the hormonal dosis and the estrous cycle phase.

O uso de biotecnologias pode ser um método eficaz para melhorar a eficiência da reprodução e aumentar a produção de animais geneticamente superiores. O tratamento superovulatório é uma técnica comum utilizada com o objetivo de difundir o material genético desejado, embora seu uso em búfalos ainda apresente limitações, principalmente relacionada à baixa taxa de recuperação de embriões. O corpo lúteo (CL) é uma glândula reprodutiva transitória que produz progesterona, requerida para o estabelecimento e manutenção da prenhez e regulação do ciclo reprodutivo. O desenvolvimento e as funções do corpo lúteo são afetados pela hiperestimulação ovariana. As células luteínicas de animais superovulados apresentam características compatíveis com alta síntese de proteína. O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF) são reguladores importantes do desenvolvimento e função do CL, e também são afetados pelo tratamento superovulatorio. Vários estudos sugerem que o LH (hormônio luteinizante) e hCG (gonadotrofina coriônica humana) modulam a expressão dos fatores de crescimento. Este trabalho teve como objetivo avaliar a expressão gênica e protéica dos sistemas VEGF e bFGF em corpo lúteo cíclico de búfalas não tratadas e superovuladas. Foram utilizados vinte corporea lutea (CLL) divididos em 5 grupos de acordo com o estágio do ciclo estral (2, 6, 12, 17 e 26 dias após ovulação p.o.) e o grupo 6 era composto de CLL de animais superovulados no dia 6 p.o. Os CLL foram coletados em abatedouro, dissecados e congelados imediatamente em nitrogênio líquido para posterior extração de proteína e de mRNA. A análise protéica do VEGF, KDR, bFGF, FGFR-2 e FGFR-3 foi determinada por western blotting, enquanto a análise da expressão gênica de VEGF, KDR, Flt-1, bFGF, FGFR-1 a 4, por RT-PCR em tempo real. No CL de búfalas superovuladas observou-se maior expressão protéica dos sistemas VEGF e bFGF, em relação aos animais não tratados (p<0,05). Por outro lado, a expressão do mRNA de todos os genes estudados decresceu (sistema VEGF-A p<0.001, bFGF, FGFR-1 e FGFR-3, p<0.05) ou apresentou tendência a decrescer (FGFR-2 e FGFR-4, p<0.1) nos animais superovulados. Durante o ciclo estral, a expressão protéica do VEGF não variou, apesar da expressão de todas as outras proteínas e mRNA estudados apresetarem variações de acordo com a fase do ciclo estral. Os resultados obtidos sugerem que o tratamento superovulatório aumenta a taxa de tradução dos fatores angiogênicos no CL de búfalas, e que a expressão dos sistemas VEGF e bFGF ao longo do ciclo estral é tempo-dependente, indicando um papel importante destes fatores na regulação das funções do CL. / Biotechniques can be an effective way of improving reproduction efficiency and enhancing the production of genetically superior animals. The superovulatory treatment is a common technique aiming to spread desired genetical material, although its use in buffalos still presents limitations, mainly the low embryo recovery rate. The corpus luteum (CL) is a temporary endocrine gland that produces progesterone (P), which is required to the establishment and maintenance of pregnancy and regulation of reproductive cycle. CL development and function are affected by ovarian hyperestimulation. The luteal cells of superovulated animals are described to show characteristics compatible with higher protein synthesis. The vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) are important regulators of CL and are also affected by superovulatory treatment. Several studies suggest that LH (luteinizing hormone) and hCG (human chorionic gonadotropin) modulate expression of growth factors. The aim of this work was to access gene and protein expression of VEGF and bFGF systems in cyclic CL of nontreated and superovulated water buffalos. Twenty water buffaloes corpora lutea (CLL) were divided in five groups according to estrous cycle stage (days 2, 6, 12, 17 and 26 after ovulation - p.o.) and the sixth group was composed by superovulated CLL from day 6 p.o. The CLL were collected at the slaughterhouse, dissected and frozen immediately in liquid nitrogen for posterior protein and mRNA extraction. Protein expression of VEGF and its receptors KDR and Flt-1 as well as bFGF and its receptors FGFR-2 and FGFR-3 was measured by western blotting (WB). For the relative gene expression of VEGF, KDR, Flt-1, bFGF, FGFR-1 to 4, we used real time RT-PCR. VEGF and bFGF systems protein expression showed an increase (p <0.05) in superovulated CLL compared to non-treated CLL on day 6 after p.o. On the other hand, mRNA expression from all studied genes was decreased (VEGF-A system p<0.001, bFGF, FGFR-1 and FGFR-3, p<0.05) or tended to decrease (FGFR-2 and FGFR-4, p<0.1) in superovulated CLL. In estrous cycle CLL VEGF protein did not show a time dependent expression although all other proteins and mRNAs expression were dependent on estrous cycle stage. These results indicate that the superovulatory treatment increased transduction rate of angiogenic factors in CL and that VEGF and bFGF systems are expressed in a time-dependent manner during the estrous cycle, indicating that these growth factors are important regulators of CL function.

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:55:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnaCarolina Nascimento Tirapelli-dissertacao.pdf: 835496 bytes, checksum: d1241371358fd9c1b5711519b6a38a32 (MD5) Previous issue date: 2013-05-17 / This experiment aimed to evaluate and compare result of superovulation of zebu females, using a product based on FSH/LH protocol, and with a smaller number of applications and similar dose (split dose). Were performed 32 superovulations in16 Zebu females, aged 17-42 months, body condition score 2,5 to 4 (scale 1-5), arrangedin arandomized cross-over. That is, all females were superovulated twice, once with each protocol .Before the beginning of the protocol, all animals underwent a synchronization: D0-introduction of a progesterone implant and applying 2 mL of estradiol benzoate. The females of the conventional group received 250 IU of FSH/LH, outline application for four days and eight decreasing doses. So, the administration of FSH/LH in D4, D5, D6 and D7 was in the morning and afternoon, with their respective strengths: 50,0 IU; 37,5 IU; 25,0 IU and 12,5 IU; D7 was added in 2 mL of application of cloprostenol in the morning and removal the implant of progesterone 12 hours after. On D8 was applied 2 mL of a GnRH analogue and held to first AI 12 hours after, and the second AI 12 hours after the first. D15 was performed on the collection of embryos. Female of split group received 250 IU of FSH/LH. D4 was administered 62,5 IU FSH/ LH intramuscular and 125,0 IU subcutaneously in the morning. Twenty-four hours after 62,5 IU was administered subcutaneously in the morning and on D7 was removed progesterone implantand applied 2 ml of cloprostenol sodico. On D8 was applied 2 mL of GnRH and AIs were performed 12 hours and 24 hours after. On D15 the embryos was collected. Before beginning the superovulation (D0) in the first day of superovulation (D4) in the middle of the superovulation protocol (D6) and on the end of the protocol (D8) were counted numbers of follicles present <3mm, between 3 and 8mm >8 mm in diameter, with the aid of ultrasound. The two groups were equivalent in number of follicles measured from day 4-6. From day 8, significant differences (P<0,05) between the conventional group and split up to 3mm follicles (2,19 ±1,22 and 4,06±2,59, respectively) and follicles >8mm (9,06 ± 4,54and 5,50±4,59, respectively).The evaluation of the superovulatory response was doneby counting the number of corpora luteaineach ovaryat harvest (D15) embryos. All embryos were collected by nonsurgical method and classified according to Lindner&Wright(1983). The amount of CLs were 8,12±3,26 for the conventional group and 4,69± 3,46 for the split group (P <0,05) and total number of embryos were collected: 6,69± 3,05 e3,37± 2,50, respectively (P <0,05). Also significant differences (P<0,05) for the number of viable embryos: 5,25 ±2,29 (conventional group) and 2,37±1,78(split group). From these results, it is concluded that the protocol split with three applications of FSH/ LH showed no equivalence or superiority in production of CLs and in total embryos produced and viable, compared to the conventional protocol superovulation. &#8195; / Este experimento teve como objetivo avaliar e comparar resultados de superovulação de fêmeas zebuínas, utilizando um produto a base de FSH/LH num protocolo convencional e com número menor de aplicações e similar dosagem (dose split). Foram realizadas 32 superovulações em 16 fêmeas zebuínas, com idade variando de 17 a 42 meses, com escore de condição corporal 2,5 a 4 (escala de 1-5), arranjadas num delineamento experimental tipo cross-over. Isto é, todas as fêmeas foram superovuladas duas vezes, uma com cada protocolo. Anteriormente ao início dos protocolos, todos os animais passaram por sincronização com: D0- introdução de um implante de progesterona e aplicação de 2mL de benzoato de estradiol. As fêmeas do grupo convencional receberam 250 UI de FSH/LH, num esquema de aplicação por quatro dias e oito doses decrescentes. Desta maneira, administrou-se FSH/LH no D4, D5, D6 e D7 no período da manhã e da tarde, com as respectivas dosagens: 50,0 UI; 37,5 UI; 25,0 UI e 12,5 UI; sendo acrescentado no D7 a aplicação de 2 mL de cloprostenol sódico no período da manhã e remoção do implante de progesterona 12 horas após. No D8 aplicou-se 2mL de um análogo de GnRH e realizou-se a primeira IA 12 horas após e, a segunda IA 12 horas após a primeira. No D15 foi realizada a colheita de embriões. As fêmeas do grupo split também receberam 250 UI de FSH/LH. No D4 administrou-se 62,5 UI de FSH/LH por via intramuscular e 125,0 UI por via subcutânea no período da manhã. Vinte e quatro horas após administrou-se 62,5 UI por via subcutânea e na manhã do D7 removeu-se o implante de progesterona e aplicou-se 2mL de cloprostenol sódico. No D8 aplicou-se 2mL de GnRH e as IAs foram realizadas as 12 horas e 24 horas após.No D15 colheu-se os embriões. Antes do início da superovulação (D0), no primeiro dia (D4), no meio do protocolo (D6) e ao final (D8), foram contabilizados os números de folículos presentes < 3 mm, entre 3 a 8 mm e >8 mm de diâmetro, com auxílio de ultrasson. Os dois grupos foram equivalentes na quantidade de folículos mensurados do dia 4 ao 6. A partir do dia 8, houve diferença (P<0,05) entre o grupo convencional e split para folículos até 3 mm (2,19±1,22 e 4,06±2,59, respectivamente) e para folículos > 8 mm (9,06±4,54 e 5,50±4,59, respectivamente). Foi realizada a avaliação da resposta superovulatória pela contagem do número de corpos lúteos de cada ovário no dia da colheita (D15) de embriões. Todos os embriões foram colhidos pelo método não cirúrgico e classificados segundo Lindner&Wright (1983). A quantidade de CLs foram: 8,12±3,26 para o grupo convencional e 4,69±3,46 para o grupo split (P<0,05), e o número de embriões totais coletados foram: 6,69±3,05 e 3,37±2,50, respectivamente (P<0,05). Também houve diferença (P<0,05) para o número de embriões viáveis: 5,25±2,29 (grupo convencional) e 2,37±1,78 (grupo split). Conclui-se que o protocolo split com três aplicações de FSH/LH não apresentou equivalência ou superioridade na produção de CLs e no total de embriões produzidos e viáveis, quando comparado com o protocolo de superovulação convencional.

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Les récentes recherches suggèrent que la superovulation de vaches laitières sous une concentration élevée de progestérone permet de meilleurs résultats que la superovulation sous une basse progestéronémie pendant la première vague folliculaire. Nous émettions donc l’hypothèse qu’une basse progestéronémie pendant la phase lutéale, une problématique connue chez la vache laitière haute productrice, compromet le rendement en embryons suite à la superovulation de la deuxième vague folliculaire. Afin de tester cette hypothèse, 18 vaches laitières ont été superovulées à deux reprises avec deux protocoles distincts, dont un atteignant un niveau lutéal de progestérone (>2.5 ng/mL, le corps jaune comme source de progestérone) et l’autre un niveau sublutéal (<2.5 ng/mL, l’implant intravaginal comme unique source de progestérone). Le nombre d’embryons transférables était similaire entre les protocoles. Curieusement, nous avons obtenu un développement accéléré des follicules dans le protocole sublutéal (p = 0,002), un développement embryonnaire plus avancé (p = 0,01) et une qualité améliorée des embryons (p = 0,02) par rapport au protocole lutéal. Ces résultats suggèrent que des facteurs autres qu’une basse progestéronémie peuvent affecter le rendement en embryons. Une pulsatilité augmentée de la LH grâce à une basse progestéronémie pendant la deuxième vague folliculaire pourrait être responsable du développement folliculaire accru ainsi que du développement et de la qualité augmentés des embryons. Ces résultats indiquent que des niveaux sublutéaux de progestérone pendant la phase lutéale ne compromettent pas le résultat d’un traitement de superovulation mais, au contraire, peuvent améliorer certains aspects du rendement en embryons. / Recent research has suggested that superovulation of dairy cows under high levels of progesterone allows for better results than superovulation of cows under low levels during the first follicular wave. We therefore hypothesized that low levels of luteal progesterone, a known problem for high producing dairy cows, impair superovulatory outcome during the second follicular wave. To test this hypothesis, 18 lactating cows were superovulated twice with two different protocols, one creating a luteal level of progesterone (>2.5 ng/mL, corpus luteum as progesterone source) during the superovulation treatment, the other one inducing a subluteal level (<2.5 ng/mL, intravaginal implant as the only progesterone source). The number of transferable embryos was not significantly different between the two protocols. Interestingly, we obtained an accelerated development of follicles in the subluteal protocol (p = 0.002), a more advanced embryo development (p = 0.01) and enhanced embryo quality (p = 0.02) compared to the luteal protocol. These results indicate that factors other than low progesterone levels may determine the outcome of superovulation performed during the first follicular phase. Increased LH pulsatility in response to low levels of progesterone during the second follicular phase may be responsible for enhancing follicular development in our subluteal group, resulting in accelerated embryo development and improved embryo quality. These results indicate that subluteal levels of progesterone during the luteal phase do not impede superovulatory outcome, but may, in contrary, enhance certain aspects of the yield in embryos.

Les récentes recherches suggèrent que la superovulation de vaches laitières sous une concentration élevée de progestérone permet de meilleurs résultats que la superovulation sous une basse progestéronémie pendant la première vague folliculaire. Nous émettions donc l’hypothèse qu’une basse progestéronémie pendant la phase lutéale, une problématique connue chez la vache laitière haute productrice, compromet le rendement en embryons suite à la superovulation de la deuxième vague folliculaire. Afin de tester cette hypothèse, 18 vaches laitières ont été superovulées à deux reprises avec deux protocoles distincts, dont un atteignant un niveau lutéal de progestérone (>2.5 ng/mL, le corps jaune comme source de progestérone) et l’autre un niveau sublutéal (<2.5 ng/mL, l’implant intravaginal comme unique source de progestérone). Le nombre d’embryons transférables était similaire entre les protocoles. Curieusement, nous avons obtenu un développement accéléré des follicules dans le protocole sublutéal (p = 0,002), un développement embryonnaire plus avancé (p = 0,01) et une qualité améliorée des embryons (p = 0,02) par rapport au protocole lutéal. Ces résultats suggèrent que des facteurs autres qu’une basse progestéronémie peuvent affecter le rendement en embryons. Une pulsatilité augmentée de la LH grâce à une basse progestéronémie pendant la deuxième vague folliculaire pourrait être responsable du développement folliculaire accru ainsi que du développement et de la qualité augmentés des embryons. Ces résultats indiquent que des niveaux sublutéaux de progestérone pendant la phase lutéale ne compromettent pas le résultat d’un traitement de superovulation mais, au contraire, peuvent améliorer certains aspects du rendement en embryons. / Recent research has suggested that superovulation of dairy cows under high levels of progesterone allows for better results than superovulation of cows under low levels during the first follicular wave. We therefore hypothesized that low levels of luteal progesterone, a known problem for high producing dairy cows, impair superovulatory outcome during the second follicular wave. To test this hypothesis, 18 lactating cows were superovulated twice with two different protocols, one creating a luteal level of progesterone (>2.5 ng/mL, corpus luteum as progesterone source) during the superovulation treatment, the other one inducing a subluteal level (<2.5 ng/mL, intravaginal implant as the only progesterone source). The number of transferable embryos was not significantly different between the two protocols. Interestingly, we obtained an accelerated development of follicles in the subluteal protocol (p = 0.002), a more advanced embryo development (p = 0.01) and enhanced embryo quality (p = 0.02) compared to the luteal protocol. These results indicate that factors other than low progesterone levels may determine the outcome of superovulation performed during the first follicular phase. Increased LH pulsatility in response to low levels of progesterone during the second follicular phase may be responsible for enhancing follicular development in our subluteal group, resulting in accelerated embryo development and improved embryo quality. These results indicate that subluteal levels of progesterone during the luteal phase do not impede superovulatory outcome, but may, in contrary, enhance certain aspects of the yield in embryos.

Esse estudo está apresentado em Capítulo 1 (Protocolo de Superovulação com IATF em Bos taurus) e Capítulo 2 [Protocolos de superovulação com IATF em Bos indicus, com 3 experimentos; 1- Momento da administração de LH em vacas Nelore (Bos indicus) superovuladas e inseminadas em tempo fixo; 2- Efeito da administração de progesterona injetável no início do protocolo de sincronização para superovulação com IATF em vacas Nelore; 3- Efeito do número de inseminações em vacas Nelore superovuladas e inseminadas em tempo fixo]. No Capítulo 1 objetivou-se avaliar o momento da retirada do dispositivo de P4 (DIB®) e da administração de LH em vacas Holandesas. Dezesseis vacas receberam DIB (D-1) e 2mg de BE (D0). Superovulou-se com 200mg de FSHp em 8 doses decrescentes a partir do D4. No D6, administrou-se PGF e estabeleceram-se quatro grupos: P24LH48 (retirada do DIB 24h e LH 48h pós PGF); P24LH60 (retirada 24h e LH 60h); P36LH48 (retirada 36h e LH 48h) e P36LH60 (retirada 36h e LH 60h; fatorial 2x2; cross-over). Realizou-se a IATF 12 e 24h pós LH. Os efeitos principais para P24vsP36 e LH48vsLH60 foram: taxa de ovulação (TO; 49,9 &plusmn; 5,7 vs 60,9&plusmn; 4,8% e 53,1&plusmn;5,3 vs 57,5&plusmn;5,4%; P>0,05), estruturas totais (ETot; 4,4&plusmn;0,9 vs 5,0&plusmn;0,9 e 3,8&plusmn;0,7 vs 5,7&plusmn;1,0; P>0,05), embriões transferíveis (ET; 3,0&plusmn;0,7 vs 4,1&plusmn;0,9 e 2,3&plusmn;0,5a vs 4,9&plusmn;0,9b; P<0,05) e embriões congeláveis (EC; 2,9&plusmn;0,7 vs 3,8&plusmn;0,8 e 2,1&plusmn;0,5a vs 4,7&plusmn;0,9b; P<0,05). O LH 60h pós PGF aumentou o número de ET e EC em Holandesas. No Capítulo 2, estudaram-se diferentes protocolos de superovulação com IATF em Nelore. No Experimento 1, vinte vacas foram superovuladas (P24) e tratadas com LH 48h (G-LH48) ou 60h (G-LH60) pós PGF (cross-over). Não houve diferença (P>0,05) para: número de folículos >8mm no LH (FolLH; 12,5±1,5 vs 9,4±1,0) e TO (71,0±4,2 vs 64,6±4,0%). No entanto, verificou-se diferença (P<0,05) para: intervalo primeira/última ovulação (IntOV; 15,0±2,1a vs 21,0±1,7bh), ETot (7,5±1,0a vs 5,1±0,5b), ET (6,2±1,0a vs 3,1±0,5b) e EC (5,9±0,9a vs 2,5±0,5b). O LH 48h pós PGF apresentou maior eficiência em Nelore. No Experimento 2, dez vacas receberam o protocolo P36LH48 e foram divididas em dois grupos no D0: Grupo BE (2mg) + P4 (50mg; G-BE+P4) ou Grupo BE (2mg; G-BE; cross-over). Os resultados para o G-BE+P4 e G-BE foram: emergência da onda folicular (EM; 3,6&plusmn;0,2 e 4,0&plusmn;0,1 d; P>0,05), variação da EM (2,5 a 4,5 vs 3,5 a 4,5d; P=0,06), FolLH (16,2&plusmn;1,4 vs 18,5&plusmn;1,1; P>0,05), IntOV (32,4&plusmn;1,8 vs 33,6&plusmn;1,6h; P>0,05), ETot (7,7&plusmn;0,8 vs 9,2&plusmn;1,2; P>0,05), ET (6,2±0.6 vs 7,2±1,1; P>0,05), EC (5,1&plusmn;0,7 vs 6,3&plusmn;1,0; P>0,05) e ED (0,6&plusmn;0,2 vs 0,8&plusmn;0,2; P>0,05). Não houve efeito da P4 i.m no D0. No Experimento 3, dez vacas foram divididas em: G-1IATF (16h pós LH) e G-2IATF (12 e 24h pós LH; cross-over). Os efeitos dos tratamentos G-1IATF e G-2IATF foram: FolLH (16,2&plusmn;1,4 vs 14,8&plusmn;1,2; P>0,05), ETot (8,2±0,9 vs 7,2±0,8; P>0,05), ET (4,3±0,7 vs 4,2±0,6; P>0,05), EC (2,9±0,6 vs 2,8±0,4; P>0,05) e estruturas não fertilizadas (0,6±0,2 vs 0,8±0,2; P>0,05). Não houve diferença na produção de embriões quando do emprego de uma ou duas IATFs. / This study is presented in Chapter 1 (Superovulations protocols with FTAI for Bos taurus) and Chapter 2 (Superovulation protocols with FTAI for Bos indicus), in this Chapter are included three experiments [1 - Moment of the application of LH in cows Nelore (Bos indicus); 2 - Effect of the injectable progesterone administration in the day 0 in Nelore cows; 3 - Effect of the number of inseminations in superstimulated and fixed-time inseminated Nelore cows]. On Chapter 1, it went to evaluate the time of intravaginal P4 device (DIBTM) withdrawal and the application of LH in Holstein cows superstimulated with FTAI. Sixteen cows, treated with DIB (D-1) and 2mg of EB (D0) were assigned in four groups (superstimulation with 200mg of FSHp in 8 decreasing doses starting on D4). On D6, PGF was administered and the cows were accomplished in four groups: P24LH48; P24LH60; P36LH48 and P36LH60 (cross-over). The FTAIs were performed 12 and 24h after LH. The main effects for treatments P24 vs P36 and LH48vsLH60 were: ovulation rate (OR; 49.9&plusmn;5.7 vs 60.9&plusmn;4.8% and 53.1&plusmn;5.3 vs 57.5&plusmn;5.4%; P>0.05), total of structures (TS; 4.4&plusmn;0.9 vs 5.0&plusmn;0.9 and 3.8&plusmn;0.7 vs 5.7&plusmn;1.0; P>0.05), transferable embryos (TE; 3.0&plusmn;0.7 vs 4.1&plusmn;0.9 and 2.3&plusmn;0.5a vs 4.9&plusmn;0.9b; P<0.05) and suitable to freezing embryos (FE; 2.9&plusmn;0.7 vs 3.8&plusmn;0.8 and 2.1&plusmn;0.5a vs 4.7&plusmn;0.9b; P<0.05). The LH 60h after prostaglandin increased the TE and FE in Holstein cows. In the Chapter 2, it was studied different superstimulation with FTAI protocols in Nelore. In the first Experiment cows (n=20) were superovulated and treated with LH 48h (G-LH48) or 60h (G-LH60) after prostaglandin. There were no significant (P>0.05) differences in the variables between LH48 and LH60: number of follicles >8mm at the time of LH (FolLH12.5±1.5 and 9.4±1.0), OR [169/249 (71.0±4.2 %) and 120/187 (64.6±4.0%)]. However, there were differences (P<0.05) between G-LH48 and G-LH60 in the variables: interval first/last ovulation (IntOV15.0±2.1a and 21.0±1.7b), TS (7.5±1.0a and 5.1±0.5b), TE (6.2±1.0a and 3.1±0.5b), and FE (5.9±0.9a and 2.5±0.5b). The LH 48h after prostaglandin was more efficient in Nelore cows. In second experiment, ten Nelore cows were divided in two groups (D0): EB plus injectable progesterone group (G-BE+P4); or EB group (G-BE). The results for G-BE+P4 and G-BE were: follicular wave emergency in days (FE; 3.6&plusmn;0.2 and 4.0&plusmn;0.1; P>0.05), variation in FE [(2.5 to 4.5) and (3.5 to 4.5)], IntOV (32.4&plusmn;1.8 and 33.6&plusmn;1.6; P>0.05), TS (7.7&plusmn;0.8 and 9.2&plusmn;1.2; P>0.05), degenerated embryos (0.6&plusmn;0.2 and 0.8&plusmn;0.2; P>0.05), TE (6.2±0.6 e 7.2±1.1; P>0.05), and FE (5.1&plusmn;0.7 and 6.3&plusmn;1.0; P>0.05). The third Experiment, ten Nelore cows were divided in two groups: G-1IATF (16h after LH) or G-2IATF (12 and 24h after LH). The results for G-1IATF and G-2IATF were: FolLH (16.2&plusmn;1.4 and 14.8&plusmn;1.2; P>0.05), TS (8.2±0.9 and 7.2±0.8; P>0.05), TE (4.3±0.7 and 4.2±0.6; P>0.05), FE (2.9±0.6 and 2.8±0.4; P>0.05) and unfertilized structures (0.6&plusmn;0.2 and 0.8&plusmn;0.2; P>0.05). There was no difference on embryo production when the cows were inseminated one (16h) or two (12 and 24h) inseminations.

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No. of bitstreams: 1 silveira_cra_me_jabo.pdf: 1335776 bytes, checksum: 2c41b17b49dd121d78806d292d582d58 (MD5) Previous issue date: 2016-06-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo do presente estudo foi avaliar o desempenho na produção embrionária in vivo e in vitro de doadoras da raça Holandesa não lactantes, verificar a ocorrência de polimorfismos no gene JY-1 e sua associação com a produção in vivo e in vitro de embriões. Primeiramente, foi verificada a similaridade na produção de embrião da mesma doadora entre as biotécnicas (produção in vivo e in vitro), sendo utilizadas 44 vacas e comparados os desempenhos nas produções de embrião. Na produção in vivo de embriões não foram observados efeitos de ano (P=0,13), estação dentro de ano (P=0,46) e touro dentro de estação e ano (P=0,20). Na produção in vitro, também não foram observados efeitos de ano (P=0,64) e estação dentro de ano (P=0,72), entretanto, o efeito do touro dentro da estação e ano foi significativo (P<0,01). Não há correlação entre as produções in vivo e in vitro dentro de doadora (r=- 0,04; P=0,56). Nenhuma probabilidade de semelhança entre as biotécnicas de produção de embriões, ou seja, se a mesma doadora tem o mesmo desempenho nas duas técnicas (acima ou abaixo da média), foi encontrada (P=0,12). Para verificar a ocorrência de polimorfismos no gene JY-1 e sua associação com a produção embrionária, dados retrospectivos de produções in vivo e in vitro de embriões foram obtidos de 144 vacas não lactantes da raça Holandesa. Para a identificação dos polimorfismos do gene JY-1, as regiões do éxon 2 e íntron 2 foram amplificadas e sequenciadas pelo método de PCR-sequenciamento. Foram detectados quatro SNPs [dois no éxon 2 (rs381676360; rs384600927) e dois no íntron 2 (rs378994837; rs211595914)]. O SNP rs381676360 provocou uma substituição não sinônima de aminoácido (leucina/isoleucina) e o rs384600927, uma substituição sinônima do aminoácido valina. Em relação ao equilíbrio de Hardy-Weinberg, uma das quatro frequências genotípicas não se encontrava em equilíbrio (rs211595914; P<0,01). Considerando o teste de desequilíbrio de ligação (DL), maiores valores de r2 (>0,33) foram observados entre os SNPs rs381676360, rs384600927 e rs378994837 (r2=0,767-0,973) e um SNP (rs211595914) apresentou baixos valores de r2 (r2=0,016-0,025). A associação dos SNPs com as características [número de embriões transferíveis produzidos in vivo (NET); taxa de embriões transferíveis in vivo; (%ET); número de embriões produzidos in vitro (NEV); taxa de clivagem (%CLIV) e taxa de embriões in vitro (%EV)] foi verificada. Nenhum dos SNPs isoladamente foi associado às características estudadas. Porém, quando todos os SNPs foram considerados em conjunto quanto à associação às características, valores significativos foram encontrados para o NET (P<0,01), NEV (P<0,01) e %EV (P<0,01). Desta forma, é possível concluir que o desempenho de produção de doadores de embriões depende da biotécnica utilizada. Ainda, que o gene JY-1 possui polimorfismos do tipo SNP em vacas não lactantes da raça Holandesa e que estes estão associados à produção embrionária. / The aim of this study was to evaluate the performance in in vivo and in vitro embryo production in non-lactating Holstein donors, verify the occurrence of JY-1 gene polymorphisms and their association with the in vivo and in vitro embryo production. First, the similarity in embryo production from the same donor between biotechnologies (in vivo and in vitro production) was verified, being used 44 cows and the embryo production performance was compared. In in vivo embryo production no effects of year (P=0.13), season within year (P=0.46) and sire within the season and year (P=0.20) were found. Regarding in vitro embryo production, no effects of year (P=0.64) and season within year (P=0.72) were found, however, the effect of sire within season and year was significant (P<0.01). There was no correlation concerning embryo production between techniques within donors (r=- 0.04, P=0.56). No probability of similarity between the embryo production techniques, i.e., if the same donor has the same performance in two techniques (above or below of the average), was found (P=0.12). To check the occurrence of JY-1 gene polymorphisms and their association with embryo production, retrospective data from in vivo and in vitro embryo production were obtained from 144 non-lactating Holstein cows. For the identification off JY-1 gene polymorphisms, the region of exon 2 and intron 2 was amplified and sequenced by PCR-sequencing method. Four SNPs were found [two in exon 2 (rs381676360; rs384600927) and two in intron 2 (rs378994837; rs211595914)]. SNP rs381676360 caused a non-synonymous amino acid substitution (leucine/isoleucine) and rs384600927 a synonymous substitution of the valine amino acid. Regarding the Hardy-Weinberg equilibrium, one of the four genotypic frequencies was not in equilibrium (rs211595914; P<0.01). For linkage disequilibrium test (LD) higher r2 values (>0.33) were observed between the SNPs rs381676360, rs384600927 and rs378994837 (r2=0.767 to 0.973) and one SNP (rs211595914) showed lower r2 values (r2=0.016 to 0.025). The association of SNPs with the characteristics [number of in vivo transferable embryos (NET); in vivo transferable embryo rate; (%ET); number of in vitro embryos (NEV); cleavage rate (% CLIV) and in vitro embryo rate (%EV)] was observed. None of the SNPs alone was associated with traits. However, when all SNPs were considered together for the association, significant values were found for NET (P<0.01), NEV (P<0.01) and %EV (P<0.01). Thus, it is possible to conclude that the donor embryo production performance depends on the implemented technique. Still, the JY-1 gene has SNP polymorphisms and they are associated with embryo production in non-lactating Holstein cows. / CNPq: 447172/2014-0 / FAPESP: 2014/13162-1

Esse estudo está apresentado em Capítulo 1 (Protocolo de Superovulação com IATF em Bos taurus) e Capítulo 2 [Protocolos de superovulação com IATF em Bos indicus, com 3 experimentos; 1- Momento da administração de LH em vacas Nelore (Bos indicus) superovuladas e inseminadas em tempo fixo; 2- Efeito da administração de progesterona injetável no início do protocolo de sincronização para superovulação com IATF em vacas Nelore; 3- Efeito do número de inseminações em vacas Nelore superovuladas e inseminadas em tempo fixo]. No Capítulo 1 objetivou-se avaliar o momento da retirada do dispositivo de P4 (DIB®) e da administração de LH em vacas Holandesas. Dezesseis vacas receberam DIB (D-1) e 2mg de BE (D0). Superovulou-se com 200mg de FSHp em 8 doses decrescentes a partir do D4. No D6, administrou-se PGF e estabeleceram-se quatro grupos: P24LH48 (retirada do DIB 24h e LH 48h pós PGF); P24LH60 (retirada 24h e LH 60h); P36LH48 (retirada 36h e LH 48h) e P36LH60 (retirada 36h e LH 60h; fatorial 2x2; cross-over). Realizou-se a IATF 12 e 24h pós LH. Os efeitos principais para P24vsP36 e LH48vsLH60 foram: taxa de ovulação (TO; 49,9 &plusmn; 5,7 vs 60,9&plusmn; 4,8% e 53,1&plusmn;5,3 vs 57,5&plusmn;5,4%; P>0,05), estruturas totais (ETot; 4,4&plusmn;0,9 vs 5,0&plusmn;0,9 e 3,8&plusmn;0,7 vs 5,7&plusmn;1,0; P>0,05), embriões transferíveis (ET; 3,0&plusmn;0,7 vs 4,1&plusmn;0,9 e 2,3&plusmn;0,5a vs 4,9&plusmn;0,9b; P<0,05) e embriões congeláveis (EC; 2,9&plusmn;0,7 vs 3,8&plusmn;0,8 e 2,1&plusmn;0,5a vs 4,7&plusmn;0,9b; P<0,05). O LH 60h pós PGF aumentou o número de ET e EC em Holandesas. No Capítulo 2, estudaram-se diferentes protocolos de superovulação com IATF em Nelore. No Experimento 1, vinte vacas foram superovuladas (P24) e tratadas com LH 48h (G-LH48) ou 60h (G-LH60) pós PGF (cross-over). Não houve diferença (P>0,05) para: número de folículos >8mm no LH (FolLH; 12,5±1,5 vs 9,4±1,0) e TO (71,0±4,2 vs 64,6±4,0%). No entanto, verificou-se diferença (P<0,05) para: intervalo primeira/última ovulação (IntOV; 15,0±2,1a vs 21,0±1,7bh), ETot (7,5±1,0a vs 5,1±0,5b), ET (6,2±1,0a vs 3,1±0,5b) e EC (5,9±0,9a vs 2,5±0,5b). O LH 48h pós PGF apresentou maior eficiência em Nelore. No Experimento 2, dez vacas receberam o protocolo P36LH48 e foram divididas em dois grupos no D0: Grupo BE (2mg) + P4 (50mg; G-BE+P4) ou Grupo BE (2mg; G-BE; cross-over). Os resultados para o G-BE+P4 e G-BE foram: emergência da onda folicular (EM; 3,6&plusmn;0,2 e 4,0&plusmn;0,1 d; P>0,05), variação da EM (2,5 a 4,5 vs 3,5 a 4,5d; P=0,06), FolLH (16,2&plusmn;1,4 vs 18,5&plusmn;1,1; P>0,05), IntOV (32,4&plusmn;1,8 vs 33,6&plusmn;1,6h; P>0,05), ETot (7,7&plusmn;0,8 vs 9,2&plusmn;1,2; P>0,05), ET (6,2±0.6 vs 7,2±1,1; P>0,05), EC (5,1&plusmn;0,7 vs 6,3&plusmn;1,0; P>0,05) e ED (0,6&plusmn;0,2 vs 0,8&plusmn;0,2; P>0,05). Não houve efeito da P4 i.m no D0. No Experimento 3, dez vacas foram divididas em: G-1IATF (16h pós LH) e G-2IATF (12 e 24h pós LH; cross-over). Os efeitos dos tratamentos G-1IATF e G-2IATF foram: FolLH (16,2&plusmn;1,4 vs 14,8&plusmn;1,2; P>0,05), ETot (8,2±0,9 vs 7,2±0,8; P>0,05), ET (4,3±0,7 vs 4,2±0,6; P>0,05), EC (2,9±0,6 vs 2,8±0,4; P>0,05) e estruturas não fertilizadas (0,6±0,2 vs 0,8±0,2; P>0,05). Não houve diferença na produção de embriões quando do emprego de uma ou duas IATFs. / This study is presented in Chapter 1 (Superovulations protocols with FTAI for Bos taurus) and Chapter 2 (Superovulation protocols with FTAI for Bos indicus), in this Chapter are included three experiments [1 - Moment of the application of LH in cows Nelore (Bos indicus); 2 - Effect of the injectable progesterone administration in the day 0 in Nelore cows; 3 - Effect of the number of inseminations in superstimulated and fixed-time inseminated Nelore cows]. On Chapter 1, it went to evaluate the time of intravaginal P4 device (DIBTM) withdrawal and the application of LH in Holstein cows superstimulated with FTAI. Sixteen cows, treated with DIB (D-1) and 2mg of EB (D0) were assigned in four groups (superstimulation with 200mg of FSHp in 8 decreasing doses starting on D4). On D6, PGF was administered and the cows were accomplished in four groups: P24LH48; P24LH60; P36LH48 and P36LH60 (cross-over). The FTAIs were performed 12 and 24h after LH. The main effects for treatments P24 vs P36 and LH48vsLH60 were: ovulation rate (OR; 49.9&plusmn;5.7 vs 60.9&plusmn;4.8% and 53.1&plusmn;5.3 vs 57.5&plusmn;5.4%; P>0.05), total of structures (TS; 4.4&plusmn;0.9 vs 5.0&plusmn;0.9 and 3.8&plusmn;0.7 vs 5.7&plusmn;1.0; P>0.05), transferable embryos (TE; 3.0&plusmn;0.7 vs 4.1&plusmn;0.9 and 2.3&plusmn;0.5a vs 4.9&plusmn;0.9b; P<0.05) and suitable to freezing embryos (FE; 2.9&plusmn;0.7 vs 3.8&plusmn;0.8 and 2.1&plusmn;0.5a vs 4.7&plusmn;0.9b; P<0.05). The LH 60h after prostaglandin increased the TE and FE in Holstein cows. In the Chapter 2, it was studied different superstimulation with FTAI protocols in Nelore. In the first Experiment cows (n=20) were superovulated and treated with LH 48h (G-LH48) or 60h (G-LH60) after prostaglandin. There were no significant (P>0.05) differences in the variables between LH48 and LH60: number of follicles >8mm at the time of LH (FolLH12.5±1.5 and 9.4±1.0), OR [169/249 (71.0±4.2 %) and 120/187 (64.6±4.0%)]. However, there were differences (P<0.05) between G-LH48 and G-LH60 in the variables: interval first/last ovulation (IntOV15.0±2.1a and 21.0±1.7b), TS (7.5±1.0a and 5.1±0.5b), TE (6.2±1.0a and 3.1±0.5b), and FE (5.9±0.9a and 2.5±0.5b). The LH 48h after prostaglandin was more efficient in Nelore cows. In second experiment, ten Nelore cows were divided in two groups (D0): EB plus injectable progesterone group (G-BE+P4); or EB group (G-BE). The results for G-BE+P4 and G-BE were: follicular wave emergency in days (FE; 3.6&plusmn;0.2 and 4.0&plusmn;0.1; P>0.05), variation in FE [(2.5 to 4.5) and (3.5 to 4.5)], IntOV (32.4&plusmn;1.8 and 33.6&plusmn;1.6; P>0.05), TS (7.7&plusmn;0.8 and 9.2&plusmn;1.2; P>0.05), degenerated embryos (0.6&plusmn;0.2 and 0.8&plusmn;0.2; P>0.05), TE (6.2±0.6 e 7.2±1.1; P>0.05), and FE (5.1&plusmn;0.7 and 6.3&plusmn;1.0; P>0.05). The third Experiment, ten Nelore cows were divided in two groups: G-1IATF (16h after LH) or G-2IATF (12 and 24h after LH). The results for G-1IATF and G-2IATF were: FolLH (16.2&plusmn;1.4 and 14.8&plusmn;1.2; P>0.05), TS (8.2±0.9 and 7.2±0.8; P>0.05), TE (4.3±0.7 and 4.2±0.6; P>0.05), FE (2.9±0.6 and 2.8±0.4; P>0.05) and unfertilized structures (0.6&plusmn;0.2 and 0.8&plusmn;0.2; P>0.05). There was no difference on embryo production when the cows were inseminated one (16h) or two (12 and 24h) inseminations.