Proefschrift Universiteit Maastricht. / Met bibliogr., lit. opg. - Met een samenvatting in het Nederlands.

Thèse de doctorat : Environnement et Santé : Nancy 1 : 2009. / Titre provenant de l'écran-titre.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.) -- Université Laval, 1997. / Bibliogr.: f. 55-64. Publié aussi en version électronique.

Récemment, notre laboratoire a démontré pour la première fois, que la protéine Damaged DNA Binding 2 (DDB2) possédait une activité régulatrice négative de l’expression basale de la superoxyde dismutase mitochondriale (SOD Mn) en se fixant sur un élément de réponse dans la région promotrice de son gène. Cette protéine était connue jusque là pour sa participation dans le système de réparation de l’ADN par excision de nucléotides. L’objectif de ce travail a été de définir précisément l’implication de ces deux protéines dans la croissance des cellules d’adénocarcinome mammaire, en développant des modèles cellulaires dont l’expression de la SOD Mn ou de la DDB2 est modulée expérimentalement. Nos résultats montrent pour la 1ère fois, que la SOD Mn est surexprimée dans les cellules tumorales mammaires insensibles aux oestrogènes (ER-) et ayant un pouvoir métastatique, et non dans les cellules épithéliales mammaires normales et les cellules ER+. L’inhibition de l’expression de la SOD Mn entraîne une stimulation de la croissance et une diminution de l’invasivité cellulaires, associées à une activité réduite de la métalloprotéinase 9. L’addition d’antioxydants, éliminant spécifiquement l’H2O2 issu de l’activité élevée de la SOD Mn, entraîne à la fois une inhibition de la croissance et du pouvoir invasif des cellules ER-. Ces résultats révèlent que la SOD Mn participe aux capacités invasives des cellules ER- via la production d’H2O2. Nous avons également montré pour la 1ère fois, que la DDB2 présente une activité oncogénique dans les cellules tumorales mammaires sensibles aux oestrogènes (ER+), non seulement parce que son gène est surexprimé, mais également parce qu’elle active leur prolifération en agissant sur la phase de transition G1/S et sur la progression dans la phase S du cycle cellulaire. Contrairement à la SOD Mn, l’expression de la DDB2 n’est pas observée dans les cellules tumorales mammaires ER-. De même à partir de biopsies provenant de patientes atteintes d’un cancer du sein, nous avons montré que la DDB2 est significativement plus exprimée dans les tumeurs les moins agressives et exprimant le récepteur aux oestrogènes. En montrant l’importance de la SOD Mn et la DDB2 dans la croissance et l’invasion des cellules tumorales mammaires, l’ensemble de ce travail révèle ainsi ces deux protéines comme des marqueurs prédictifs potentiels de la progression tumorale, et ouvre de nombreuses perspectives en cancérologie mammaire. / Recently, our laboratory demonstrated for the first time, that Damaged DNA Binding 2 (DDB2) played a role as a negative transcriptional regulator on the mitochondrial superoxide dismutase (MnSOD) expression through its binding to a specific DNA sequence located into the promoter of MnSOD gene. DDB2 was known as a protein which participates in the nucleotide excision repair of DNA. The goal of this study was to define precisely the involvement of the both proteins in the growth of mammary adenocarcinoma cells, using experimental procedures to modulate their expression in the breast cancer cell lines. Our results show for the first time that MnSOD is overexpressed in the estrogen receptor (ER) negative and metastatic breast tumor cells, but not in normal epithelial mammary cells and ER-positive tumor cells. Inhibition of MnSOD expression stimulates proliferation but decreases the invasive ability and the metalloproteinase 9 activity of tumor cells. Elimination of H2O2 from the elevated MnSOD activity by addition of specific antioxidants decreases proliferation as well as invasive ability of tumor cells, suggesting that the role of MnSOD in the invasive ability of tumor cells is mediated by H2O2. We have shown too for the first time that DDB2 has an oncogenic activity in the ER-positive breast tumor cells, because its gene is overexpressed and stimulates the proliferation by activating the entry of cells in the G1/S transition phase and the S phase progression. In contrast to MnSOD, DDB2 expression is not observed in ER-negative breast tumor cells, but is higher in ER-positive than in ER-negative tumor samples from patients with breast carcinoma. Taken together, our findings demonstrate that both MnSOD and DDB2 play a role in the growth and invasiveness of tumor cells and may become a promising candidate as a predictive markers in breast cancer. More studies will be need to define molecular mechanism controlling this activity of these both proteins.

La superoxyde dismutase à Manganèse (SOD Mn ou SOD2) est une enzyme importante dans la défense antioxydante, qui semble jouer un rôle mal défini dans le développement des tumeurs selon l’expression constitutive de son gène. Cependant, les mécanismes de régulation de cette expression constitutive sont mal connus, en particulier dans les cellules tumorales mammaires. Ce travail a reposé sur la mise en évidence préalable d’une protéine, appelée la Damaged DNA Binding 2 (DDB2) protein, se fixant spécifiquement sur la région promotrice du gène SOD2. La DDB2 est connue pour sa participation dans la réparation de l’ADN par excision de nucléotides. Dans un 1er temps, nous avons caractérisé la séquence d’ADN spécifiquement reconnue dans la région proximale du promoteur du gène SOD2, sur laquelle la DDB2 s’y fixe sous la forme d’un monomère, pour réguler négativement la transcription constitutive de la SOD Mn dans les cellules tumorales mammaires non métastatiques de type MCF-7. Par ailleurs, la DDB2 n’est pas impliquée dans le mécanisme d’induction du gène SOD2, lorsque les cellules MCF-7 sont exposées à des substances inductrices. En revanche, nous avons montré que l’absence de la protéine DDB2, associée à celle du facteur de transcription AP-2?, déjà connu comme répresseur du gène SOD2, entraîne une expression constitutive élevée de la SOD Mn dans les cellules tumorales mammaires métastatiques n’exprimant pas le récepteur aux œstrogènes (ER-). De plus, cette expression constitutive élevée est principalement dépendante du facteur de transcription Sp1. Dans un 2ème temps, nous avons évalué la signification biologique de la régulation de l’expression constitutive de la SOD Mn par la DDB2 dans les cellules tumorales mammaires. Nos résultats montrent que la DDB2 active la prolifération des cellules tumorales mammaires ER+, en exerçant sa régulation négative sur l’expression de la SOD Mn. Dans un 3ème temps, nous avons cherché à montrer les conséquences sur la croissance des cellules tumorales mammaires ER-, qui surexpriment naturellement la SOD Mn. Nos résultats révèlent que l’enzyme antioxydante joue un rôle important dans les mécanismes moléculaires impliqués dans le pouvoir invasif des cellules tumorales mammaires ER-. La surexpression de la SOD Mn, associée à un taux faible des enzymes éliminant l’H2O2, entraînent une augmentation du pouvoir invasif déjà élevé des cellules tumorales mammaires ER-, associée une augmentation de l’activité de la métalloprotéinase 9. L’élimination, en présence d’antioxydants, de l’H2O2 libéré par l’activité de la SOD Mn surexprimée, entraîne une inhibition à la fois de la croissance et des capacités invasives des cellules tumorales mammaires ER-. L’ensemble de ce travail contribue à mieux comprendre l’importance de la SOD Mn et du mécanisme de régulation de son gène dans la croissance et l’invasion tumorales. Ainsi ce travail révèle également la SOD Mn et la DDB2 comme de potentiels facteurs prédictifs de la progression tumorale mammaire. Enfin, la découverte de la nouvelle activité biologique de la DDB2 ouvre un vaste champ de perspectives intéressantes en cancérologie mammaire. / Manganese superoxide dismutase (Mn SOD or SOD2) is an important enzyme in the antioxidizing defence, which seems to play an unclear role in the cancer development, according to the constitutive expression of its gene. However, the regulation of this constitutive expression is not totally known, particularly in the breast cancer cells. This work is based on a preliminary revealing that a protein, called Damaged DNA Binding 2 (DDB2), specifically binds the SOD2 gene promoter. The DDB2 is known for its involvement in the nucleotide excision repair. At first step, we characterized the specific DNA sequence recognized in the proximal area of the SOD2 gene promoter, on which a DDB2 monomer binds, in order to regulate negatively the Mn SOD transcription in the MCF-7 non metastatic breast cancer cells. Besides, DDB2 is not involved in the mechanism of SOD2 gene induction, when MCF-7 cells are exposed to induced substances. However, we showed that the lack of the DDB2 protein, associated with the lack of the AP-2a transcription factor, already known as a repressor of the SOD2 gene, lead to a high Mn SOD constitutive expression in the metastatic breast cancer cells. Furthermore, this high constitutive expression is mainly dependent of the Sp1 transcription factor. Secondly, we estimated the biological meaning of the regulation of the Mn SOD constitutive expression by the DDB2 in the breast cancer cells. Our results show that the DDB2 activates the positive ER breast cancer cell proliferation, by exercising its negative regulation on the Mn SOD expression. Thirdly, we tried to show the consequences on the negative ER breast cancer cell growth, which naturally and highly express the Mn SOD. Our results reveal that the antioxidizing enzyme plays an important role in the molecular mechanisms involved in the invasive capacities of the negative ER breast cancer cells. The high Mn SOD expression, associated in a decrease of the H2O2 detoxifying enzymes expression, enhance the negative ER breast cancer cell invasion and an increase of the matrix metallopeptidase-9 activity. The H2O2 elimination, with specific antioxidants, decreases both negative ER breast cancer cell growth and invasive capacities. This whole work contributes to better understand the Mn SOD importance and the mechanism of its gene regulation, in the tumoral growth and invasion. This work also reveals the Mn SOD and DDB2 as potential predictive factors of the breast cancer progress. Finally, the discovery of this new DDB2 biological activity opens a huge field of interesting perspectives in breast cancer research.

La protéine Damaged DNA-Binding 2 (DDB2) est connue pour son rôle dans la réparation de l'ADN lésé par les UV. Cependant, le laboratoire a montré que cette protéine est surexprimée naturellement dans les cellules tumorales mammaires non métastatiques et active leur prolifération, en favorisant leur entrée en phase de transition G1/S du cycle cellulaire. Il a été montré que cette nouvelle activité biologique de DDB2 dépend de sa capacité à intervenir dans la transcription de gènes cibles, comme celui codant l'enzyme anti-oxydante, la superoxyde dismutase à manganèse (SOD Mn). Sur la base que DDB2 est peu ou pas exprimée dans les cellules tumorales mammaires métastatiques, ce travail a consisté à étudier le rôle de cette protéine dans les capacités invasives de ces cellules. Dans un 1er temps, nous avons montré que les cellules tumorales mammaires hautement métastatiques (MDA-MB231 et SKBR3), lorsqu'elles surexpriment DDB2 après introduction de son gène, ont des capacités migratrices et invasives in vitro, ainsi que des propriétés in vivo à développer des métastases pulmonaires, fortement réduites, en association avec une diminution importante de l'expression de la métalloprotéase matricielle 9 (MMP-9). De même, lors d'une analyse rétrospective sur 92 échantillons cliniques provenant de patientes, une corrélation inverse entre l'expression de DDB2 et le haut grade (SBR>ou =3) des tumeurs mammaires est observée. Dans un 2ème temps, nous avons identifié le mécanisme moléculaire par lequel DDB2 agit négativement sur les capacités invasives des cellules tumorales mammaires. Nous avons montré que DDB2 intervient positivement sur l'expression du gène codant I kappa B alpha (IkBa), en se fixant sur une séquence d'ADN localisée dans la région proximale du promoteur, qui entraîne en conséquence une forte diminution de l'activité du facteur de transcription NF-kB. Ce dernier est connu pour son rôle dans les capacités invasives et migratrices des cellules tumorales mammaires métastatiques, en régulant de nombreux gènes cibles comme celui codant la MMP-9. Nous avons montré, que l?inhibition de l'expression d'IkBa, par ARN interférence restaure en partie les propriétés invasives des cellules tumorales mammaires métastatiques surexprimant DDB2, en association avec une réexpression de MMP-9. Dans un 3ème temps, nous avons également montré dans les cellules tumorales mammaires métastatiques, que l?expression constitutivement élevée de la SOD Mn, en l'absence de DDB2, dépend de l'activité conjointe des facteurs de transcription NF-kB et Sp1, révélant ainsi un autre mécanisme moléculaire impliqué dans les propriétés invasives de ces cellules. L'ensemble de ce travail contribue ainsi à mieux comprendre comment les cellules tumorales mammaires progressent vers un statut invasif et renforce également l'idée que DDB2 présente un intérêt clinique potentiel, comme marqueur prédictif de la progression métastatique des tumeurs mammaires. Enfin, la relation entre la DDB2, NF-kB et la SOD Mn représente une voie intéressante pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses / The Damaged DNA-Binding 2 protein (DDB2) is known to play a role in repair of UV-induced DNA damages. However, the laboratory has shown that this protein is overexpressed in nonmetastatic breast tumor cells and stimulates their proliferation by favouring their entry in G1/S transition phase of cell cycle. This novel biological activity of DDB2 depends on its ability to modulate transcription of target genes, such as that encoding the manganese superoxide dismutase (MnSOD) antioxidant enzyme. The fact that DDB2 is not expressed in metastatic breast tumor cells led us to focuse this work on the role of DDB2 in the invasive abilities of these cells. In a 1st time, we have shown that highly metastatic breast tumor cells (MDA-MB231 et SKBR3), when they overexpress DDB2 after introduction of its gene, have a strong decrease in their in vitro migratory and invasive abilities, and in their properties to develop in vivo lung metastasis, associated with a highly reduced expression of matrix metalloprotease 9 (MMP-9). In addition, DDB2 expression was analyzed in a cohort of 92 breast samples from patients. An inverse correlation is observed between DDB2 level and the high-grade (SBR>=3) breast tumors. In a 2nd time, we identified the molecular mechanism by which DDB2 controls negatively the invasive abilities of breast tumor cells. We have shown that DDB2 plays a positive role in the expression of gene encoding I kappa B alpha gene (IkB?), though its binding to a specific DNA sequence localized in the proximal promoter, and which promotes a strong decrease in the NF-kB activity. This transcription factor is well known to play a role in migratory and invasive abilities of metastatic breast tumor cells by regulating many target genes, such as that encoding MMP-9. We have shown that inhibition by RNA interference of I?B? expression restores in part the invasive properties of DDB2-overexpressing metastatic breast tumor cells, associated with an induction of MMP-9 gene expression. In a 3rd time, we have also shown in metastatic breast tumor cells, that the high basal MnSOD expression, when DDB2 is lacking, depends on the related activity of the NF-kB and Sp1 transcription factors, considering that this other molecular mechanism is involved in invasive properties of these cells. Taken together, this work contributes to a better understanding how breast tumor cells progress toward an invasive phenotype and underlines also the idea that DDB2 has a clinical relevance as a good potential marker for predicting breast tumor progression toward metastasis. Finally, the relationship between DDB2, NF-kB and MnSOD may be considered as an interesting pathway for development of new anticancer therapies

Thèse (M.Sc)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. 75-85. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Le but de ce travail de thèse était de rechercher de nouvelles molécules inhibitrices de la SOD dans des extraits de substances naturelles. Cette enzyme majeure du stress oxydant étant impliquée dans de nombreux mécanismes de défense des cellules cancéreuses contre l'apoptose représente une voie thérapeutique d'avenir. Nous en avons recherché dans les champignons endophytes de plantes péruviennes, ces micro-organismes produisant de nombreux métabolites de défense des plantes hôtes. Ce travail de thèse a d'abord porté sur l'isolement, la culture, l'identification, l'extraction et la caractérisation des souches de champignons endophytes. Les analyses statistiques effectuées sur ces extraits avec les résultats obtenus en HPLC ont confirmé les problèmes de variabilités qualitative et quantitative pouvant être rencontrés au cours de la culture des endophytes et décrites dans la littérature. La seconde partie expérimentale a porté sur la recherche de furocoumarines dans les extraits obtenus, en raison de leur potentiel effet inhibiteur sur la SOD. Nous avons dérépliqué ces composés dans les extraits d'endophytes au cours de deux stratégies de spectrométrie de masse réalisées en mode d'ionisation négatif. La première approche, à l'aide d'un QTOF, a abouti à l'identification de deux furocoumarines, la 5-Methyl-4H-furo[2,3-b][1]benzopyran-4-one et la déhydropachyrrhizone. La seconde, à l'aide d'un OrbiTrap, a vu l'identification de quatre autres furocoumarines : l'Ochrocarpine A, la Moellendorffiline, l'Anisolactone et l'Anhydrorutarétine .Afin de compléter cette approche métabolomique et identifier les molécules inhibitrices de la SOD, nous avons tenté de mettre au point un test d'activité de cette enzyme, rapide, peu coûteux et réalisable en routine. Nous avons sélectionné le test au pyrogallol, mais celui-ci n'a pas démontré les qualités recherchées tant au niveau de la sensibilité que de la reproductibilité. Nous orientons à présent les recherches vers des approches différentes, la recherche directe d'adduits sur la SOD par LC-MS. / Superoxide dismutase is one of the major proteins controlling the oxidizing stress and cellular homeostasis. It is involved in numerous cancer cells proliferation processes. This protein is considered as major anti-cancer target for the development of new anti-cancer drugs. The goal of this work, was to research and identify an inhibitor of the SOD in endophytic fungi from Peruvian plants. These micro-organisms are known to produce numerous metabolites for host plants protection. During the preparation of endophytic extracts and their characterization by HPLC and statistical analyzes, we have pointed out a high quantitative and qualitative variability of the chemical content of endophytic extracts inside a same strain. Considering the literature we have focused our work on the identification of furocoumarins because of their potential inhibitory effect on the SOD. For this purpose two mass spectrometry strategies using negative ionization mode were carried out. With the QTOF mass spectrometer we have identified Methyl-4H-furo [2,3-b] [1] benzopyran-4-one and the déhydropachyrrhizone. With the OrbiTrap, the Ochrocarpine A, Moellendorffiline the Anisolactone and the Anhydrorutarétine were identified. Biological evaluation of the different extracts was performed using pyrogallol test. This investigation did not allow us to identify an inhibitor of the SOD. In the future we may consider seeking SOD inhibitors by looking at the formation SOD-chemical compound adducts using an LC-MS investigation.

L’analyse métalloprotéomique est un nouveau champ d’étude qui couple la détermination du protéome et l’identification, localisation et spéciation des éléments inorganiques complexés aux protéines. La faible concentration de ces hétéroéléments et la labilité possible de ceux-ci nécessite la mise en place d’outils de chimie analytique permettant une séparation des protéines à grande résolution, sans modifier la liaison protéine-hétéroélément, et une spéciation des protéines avec une technique bénéficiant d’une faible limite de détection. L’objet de cette étude est la mise en place de tels protocoles pour une application sur deux systèmes protéiques, modèles représentant les deux principales interactions métal-protéine : formation de complexes métalliques ou de liaisons covalentes. Dans une première partie, nous avons étudié la superoxyde dismutase à cuivre et zinc (CuZnSOD), protéine dont des formes mutantes sont impliquées dans une maladie neurodégénérative, la sclérose latérale amyotrophique. Les isoformes de point isoélectrique de CuZnSOD sauvage et mutante, séparées sur gel d’électrophorèse, ont été analysées par spectroscopie d’absorption des rayons X (XAS). Une analyse XAS sur des protéines séparées sur gel d’électrophorèse a ainsi pour la première fois été menée. Le traitement des spectres obtenus au seuil du Zn révèle la faisabilité de cette technique et celui au seuil du Cu met notamment en évidence des différences d’état d’oxydation Cu(I) et Cu(II) entre les isoformes. Dans une seconde partie, nous avons étudié la métabolisation de l’arsenic dans le cadre de la cancérogénicité de ce métalloïde. Les protéines extraites de cellules hépatiques exposées à l’arsenic ont été séparées par électrophorèse sur gel et chromatographie en phase liquide. L’analyse des échantillons obtenus par spectrométrie de masse a mis en évidence trois espèces protéiques complexant l’arsenic. / Metalloproteomic is a new discipline which ally proteome determination and the identification, location and speciation of inorganic elements bound to proteins. The low concentration of these heteroelements and sometimes their non-covalent binding to proteins need to set up analytical tools enabling the protein separation at high resolution, without any modification of the bond protein-heteroelement, and the protein speciation with a technique presenting a low detection limit. The aim of this study is to set up such protocols on two proteic systems, depicting the two main protein-heteroelement interactions: forming of metallic complexes or covalent bonds. First, we studied copper, zinc superoxide dismutase (CuZnSOD), mutants of this protein being involved in a neurodegenerative disease, the amyotrophic lateral sclerosis. Isoelectric point isoforms of wild-type and mutant CuZnSOD, separated on electrophoresis gel, were analyzed using X-ray Absorption Spectroscopy (XAS). XAS experiments on proteins separated on electrophoresis gel were performed for the first time. Data analysis at Zn K-edge demonstrated the feasibility of this technique and the ones at the Cu K-edge highlighted oxidation states Cu(I) et Cu(II) differences between isoforms. Second, we studied arsenic metabolisation to understand its carcinogenicity. Proteins extracted from hepatic cells exposed to arsenic were separated using gel electrophoresis and liquid chromatography. Samples analysis using mass spectrometry highlighted three proteic species which bind arsenic.