Techn. Universiẗat, Diss., 2000--Berlin.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in dt. Sprache.

Les régions arctiques et subarctiques constituent un défi pour la recherche sur la biodiversité en raison de leur éloignement et des conditions environnementales extrêmes. Cependant, il est essentiel d'acquérir une compréhension fondamentale du biote polaire. Les bryophytes sont une composante importante des écosystèmes polaires à cause de leur abondance et de leurs rôles écologiques, tels que la production primaire, la stabilisation des sols et le cycle des nutriments par le biais d'interactions bactériennes. Malgré leur rôle vital dans les écosystèmes polaires, l'écologie des bryophytes est loin d'être comprise. Cette thèse contribue à la connaissance des bryophytes de l'Arctique et du Subarctique, en mettant l'accent sur les populations de mousses. Je me suis concentré sur trois sujets principaux : l'histoire évolutive, la diversité génétique locale et les interactions microbiennes en utilisant la mousse *Racomitrium lanuginosum* comme espèce modèle. Une approche intégrative a été utilisée pour étudier ces sujets, englobant le séquençage Sanger, le génotypage par séquençage (GBS), des modèles de répartition des espèces, le séquençage des amplicons, les essais de réduction de l'acétylène (ARA) et la spectrométrie de masse à plasma inductif (ICP-MS). Le premier chapitre dévoile l'histoire évolutive de la mousse dans l'hémisphère nord, en découvrant quatre groupes génétiques cryptiques repartis dans des environnements subarctiques et arctiques et en montrant l'impact des dernières glaciations sur la diversité génétique des populations. Le deuxième chapitre illustre comment la reconnaissance de lignées cryptiques peut avoir un impact sur les évaluations de la diversité génétique dans les habitats et peux aider à comprendre la répartition de la variation génétique dans des populations clonales de *R. lanuginosum*. Le troisième chapitre étudie les communautés microbiennes associées à la mousses et leurs capacités de fixation d'azote dans l'écotone forêt-toundra, en mettant en évidence le microbiote central des mousses, les différences de communautés bactériennes entre les habitats et les bactéries diazotrophes qui façonnent la fixation d'azote. En résumé, cette thèse contribue de manière significative à la connaissance des aspects évolutifs et écologiques des plantes de la région subarctique, en se concentrant sur un organisme clé de la toundra. L'étude souligne l'importance des bryophytes et de leurs relations symbiotiques dans les écosystèmes polaires, et met en évidence la nécessité de poursuivre les recherches sur ces systèmes complexes. Afin d'assurer la préservation à long terme de ces écosystèmes vulnérables, il est essentiel d'acquérir une compréhension approfondie de leur dynamique et de développer des stratégies de conservation efficaces, tout en évaluant la manière dont les organismes réagissent aux changements environnementaux. / The Arctic and subarctic regions pose a challenge to biodiversity research due to their remote location and harsh environmental conditions. However, gaining a fundamental understanding of the polar biota is crucial. Bryophytes are significant components of polar ecosystems due to their abundance and ecological roles, such as primary producers, soil stabilization, and nutrient cycling through bacterial interactions. Despite their vital role in polar ecosystems, bryophyte ecology remains far from being understood. This thesis contributes to the knowledge of Artic and Subarctic bryophytes, with a focus on mosses. I covered three main topics: evolutionary history, local genetic diversity and microbial interactions using the moss *Racomitrium lanuginosum* as a model species. An integrative approach was used to study these topics, encompassing Sanger sequencing, genotyping-by-sequencing (GBS), species distribution modeling, amplicon sequencing, acetylene reduction assays (ARA), and inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). The first chapter unveils the evolutionary history of the moss in the Northern Hemisphere, uncovering four cryptic genetic groups scattered across subarctic and arctic environments and showing the impact of the last glaciations on the population's genetic diversity. The second chapter illustrates how recognizing cryptic lineages can impact genetic diversity assessments in habitats and help to understand the partition of genetic variation in clonal populations of *R. lanuginosum*. The third chapter delves into the moss-associated microbial communities and their N₂ fixation capabilities in the forest-tundra ecotone, highlighting the moss core microbiome, the bacterial community differences between habitats and the diazotrophic bacteria influencing this process. In summary, this thesis significantly contributes to the knowledge of the evolutionary and ecological aspects of plants in the subarctic region, focusing on a key tundra organism. The study emphasizes the importance of bryophytes and their symbiotic relationships in polar ecosystems, highlighting the need for further investigations into these intricate systems. A deep understanding of plant dynamics in Arctic and Subarctic environments will be crucial to ensure the long-term preservation of these vulnerable ecosystems

Schwämme (Phylum Porifera) sind der älteste rezente Tierstamm der Erde. Insbesondere marine Vertreter dieser sessilen Invertebraten sind oftmals mit einem mikrobiellen Konsortium assoziiert, welches hochgradig wirtsspezifisch und phylogenetisch divers ist. Die Biomasse dieser Mikroflora kann dabei rund die Hälfte der Masse eines Schwamms ausmachen. Die Komplexität des Konsortiums sowie der Mangel an kultivierbaren Vertretern der Schwamm-spezifischen Kladen erschwert dabei eine gezielte funktionelle Charakterisierung. Von besonderem Interesse hierbei ist das exklusiv in marinen Schwämmen vorzufindende Candidatus Phylum Poribacteria, für das bislang kein kultivierter Vertreter vorliegt. Die metabolisch aktiven und hochabundanten Poribakterien liegen in der extrazellulären Matrix des Schwammes vor und zeichnen sich durch das Vorhandensein einer Nukleoid-ähnlichen intrazellulären Struktur aus. Ziel dieser Promotionsarbeit war es, neue Einzelzell-basierte Methoden auf das Gebiet der funktionellen Charakterisierung von Bakterien anzuwenden, welche spezifisch mit dem mediterranen Schwamm Aplysina aerophoba assoziiert sind. Dabei wurden sowohl kultivierungs-abhängige, als auch kultivierungs-unabhängige Versuchsansätze verfolgt. Das Hauptaugenmerk dieser Studien lag dabei auf dem Candidatus Phylum Poribacteria. Während auf dem ‚dilution-to-extinction‘-Prinzip beruhende Hochdurchsatz-Kultivierungen nicht zum Erhalt einer Schwammsymbionten-Reinkultur führten, konnten durch eine Kombination aus FACS-Vereinzelung von Schwamm-assoziierten Bakterien und anschließenden Einzel-Genom-Amplifizierungen (‚whole genome amplifications‘) umfassende Einblicke in die metabolischen Kapazitäten von Schwammsymbionten gewonnen werden. Ferner gelang durch die Anwendung dieser neuen kultivierungs-unabhängigen Methode eine spezifische Verknüpfung von Phylogenie und Funktion Schwamm-assoziierter, nicht-kultivierbarer Bakterien. So konnte im Rahmen dieser Dissertation eine neue nicht-ribosomale Peptidsynthetase (NRPS) einem Vertreter einer Schwamm-spezifischen Chloroflexi-Klade zugewiesen werden. Ferner gelang die Zuordnung einer exklusiv in marinen Schwämmen vorgefundenen Polyketidsynthase (Sup-PKS) zu den Poribacteria. Die Klonierung von hochmolekularer, Einzel-Genom-amplifizierter DNA in Cosmide gewährte zudem Einblicke in den genomischen Kontext dieser, mit dem bakteriellen Sekundärmetabolismus assoziierten Gene. Die Pyrosequenzierung eines amplifizierten, von einem einzelnen Poribakterium abstammenden Genoms führte zudem zum Erhalt von rund zwei Megabasen an genetischer Information über diese Schwammsymbionten. Dadurch wurden detaillierte Informationen über den poribakteriellen Primär- und Sekundärstoffwechsel gewonnen. Die Auswertung der automatisch annotierten 454-Daten erlaubte die Rekonstruktion von Stoffwechselwegen, so z.B. der Glykolyse oder des Citratzyklus und bestätigte das Vorhandensein eines Sup-PKS-Gens im poribakteriellen Genom. Ferner konnten Gemeinsamkeiten mit den Schwesterphyla Planctomycetes, Chlamydiae und Verrucomicrobia gefunden werden. Zudem zeigte die vergleichende Analyse mit einem poribakteriellen Referenzklon aus einer bestehenden Metagenombank die genomische Mikroheterogenität innerhalb dieses Phylums. Nicht zuletzt konnte die Auswertung der poribakteriellen 454-Sequenzierung eine Reihe von möglichen Symbiose-Determinanten aufdecken, die beispielsweise am Austausch von Metaboliten zwischen den Interaktionspartnern beteiligt sind. Die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit stellen die Basis für eine gezielte und detaillierte funktionelle Beschreibung einzelner Bakterien innerhalb komplexer mikrobieller Konsortien dar, wie sie in marinen Schwämmen vorzufinden sind. Dieser Studie gewährte erstmalig umfassende Einblicke in das genomische Potential der nicht-kultivierten, Schwamm-assoziierten Poribacteria. Weiterführende Einzelzell-basierte Experimente werden in Zukunft dazu beitragen, das Bild von der Interaktion zwischen Bakterien und eukaryontischen Wirten zu komplettieren. / Sponges (phylum Porifera) represent the evolutionarily oldest of all extant animal phyla. Especially marine members of these sessile invertebrates are well known to be permanently associated with microbial consortia, which are highly host-specific and phylogenetically diverse. About half of the sponge’s biomass can be made up of this microflora. However, the complexity of the consortia as well as the lack of cultured representatives impedes a directed functional characterization of sponge-specific bacterial phylotypes. Of special interest in this context is the candidate phylum Poribacteria, whose members have so far been exclusively detected in marine sponges. As indicated by the annex ‘candidate’, no cultured representative exists for the Poribacteria. The metabolically active and abundant Poribacteria are located in the sponge extracellular matrix and are characterized by the presence of a nucleoid-like organelle. The aim of this dissertation was the application of novel single cell based methods to the field of sponge microbiology for functional characterization of bacteria specifically associated with the Mediterranean sponge Aplysina aerophoba. For that purpose, cultivation-dependent as well as cultivation-independent approaches were pursued. Particular attention was paid to the candidate phylum Poribacteria. While high-throughput cultivation experiments based on the ‘dilution-to-extinction’ principle did not yield a sponge symbiont in pure culture, extensive insights into the metabolic properties of sponge-associated bacteria were gained by dissecting the microbial consortia using FACS-sorting with subsequent ‘whole genome amplifications’. In addition, this approach enabled a specific linkage between phylogeny and function of sponge-specific, non-culturable bacteria. Within the scope of this PhD thesis a novel non ribosomal peptide synthetase (NRPS) could be assigned to a member of a sponge-specific clade within the phylum Chloroflexi. Moreover, an exclusively in marine sponges existing class of polyketide synthases (Sup-PKS) was shown to be encoded by the Poribacteria. Cosmide-cloning of amplified genomic DNA derived from FACS-sorted sponge microbes provided insights into genes associated with secondary metabolism and adjacent genomic context. Pyrosequencing of a single amplified genome derived from a member of the Poribacteria resulted in almost two megabases of genetic information about this sponge symbiont. Data analysis provided detailed insights into the poribacterial primary and secondary metabolism. Analysis of the automatically annotated 454-data enabled the reconstruction of metabolic pathways like glycolysis and citric acid cycle. Furthermore, the presence of the Sup-PKS gene in the poribacterial genome was confirmed. Moreover, common features with the sister phyla Planctomycetes, Chlamydiae and Verrucomicrobia were traced within the poribacterial data set. Additionally, the comparative study with a poribacterial reference clone from an existing metagenomic library revealed genomic microheterogeneity within the phylum Poribacteria. Last but not least the interpretation of the 454-sequencing approach did expose a set of putative determinants such as metabolite exchange factors required for establishment and maintenance of the symbiosis with the sponge host. The results of this dissertation provide a basis for a directed and detailed functional characterization of single bacteria within complex microbial consortia like they exist in marine sponges. This study provided a comprehensive picture of the genomic potential of the uncultured sponge-associated Poribacteria. Continued single cell based experiments will lead to a better knowledge of the mechanisms of interaction between bacteria and eukaryotic hosts.

Marine Schwämme (Phylum Porifera) gehören mit ihrem ersten Auftreten im Präkambrium vor ungefähr 580 Millionen Jahren zu den ältesten Vertretern der Metazoen weltweit. Ähnlich lange leben sie wahrscheinlich schon in Symbiose mit Mikroorganismen. In der vorliegenden Doktorarbeit soll der karibische Schwamm Ectyoplasia ferox als Modellsystem zur Erforschung der Schwamm-assoziierten mikrobiellen Konsortien, deren Weitergabe und Interaktionen mit dem Schwamm, vorgestellt werden. Mit Hilfe von 16S rRNA-Genbanken sowie der denaturierenden Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) konnte gezeigt werden, dass Symbionten aus sechs der in E. ferox gefundenen acht Phyla sowie der „sponge-associated unclassified lineage” SAUL vertikal an die nächste Schwammgeneration weitergegeben werden. Mittels phylogenetischer Analysen wurden insgesamt 21 „vertical transmission“ (VT) Cluster identifiziert, von denen 19 in „sponge specific“ Cluster (SSC) bzw. „sponge coral“ Clustern (SCC) lagen. Daraus kann man schließen, dass ein Großteil des mikrobiellen Konsortiums von E. ferox über die reproduktiven Stadien weitergegeben wird. Auch konnten zwei Cyanobakterien identifiziert werden, die nicht in den reproduktiven Stadien vorhanden waren und höchstwahrscheinlich horizontal aus dem umgebenden Meerwasser aufgenommen wurden. Eine Reduzierung von 50% der Symbionten im Mesohyl nach dem „spawning“ zeigte erstmalig experimentell auf, dass Schwammsymbionten aus dem Schwamm in das umgebende Meerwasser gelangen können. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal der „presence vs. activity“-Vergleich zur Feststellung der metabolischen Aktivität von Bakterien auf die DGGE-Methode übertragen. Es konnte gezeigt werden, dass die meisten mikrobiellen Symbionten im Adult-Schwamm, Embryo- sowie Larvalstadium metabolisch aktiv waren. Erste Versuche die Anzahl von Symbionten in den Larven von E. ferox mittels Antibiotika zu reduzieren, verliefen positiv. So wiesen die mit Antibiotika behandelten Larven in der DGGE eine deutliche Reduzierung der Bandenintensität auf. Die Verfügbarkeit aller reproduktiver Stadien von E. ferox sowie die Möglichkeit die Larven im Labor experimentell zu manipulieren, machen E. ferox zu einem geeigneten Modellschwamm für zukünftige Studien bezüglich der vertikalen Weitergabe von Symbionten. / Marine sponges (Phylum: Porifera) first appeared during Precambrian times 580 million years ago and are therefore the oldest metazoans on earth. It is most likely that they are living together in symbiosis with microorganisms from that day on. In this doctoral thesis I introduce the Caribbean sponge Ectyoplasia ferox as a model system for detailed investigations of the sponge associated microbial community, their mode of transmission to the next generation and interactions with their host sponge. The application of 16S rRNA gene clone libraries and denaturing gradient gel electrophoreses (DGGE) revealed that symbionts from six out of eight bacterial phyla as well as the ‘sponge-associated unclassified lineage’ (SAUL) were vertically transmitted to the next sponge generation. Phylogenetic analysis identified 21 vertical transmission (VT) clusters, from which 19 VT-clusters were affiliated with sponge-specific clusters (SSC) and sponge-coral clusters (SCC), respectively. This indicated that the majority of the microbial consortia of E. ferox has been passed on vertically via reproductive stages to the next generation. Furthermore two cyanobacterial clades were identified, which were absent from the reproductive stages and therefore seem to have be acquired horizontally from the surrounding seawater. Spawning led to a reduction of 50% of the sponge symbionts in the mesohyl, presenting for the first time experimental evidence, as to how sponge symbionts could end up in surrounding seawater. Moreover the presence vs. activity comparison that was undertaken to assess the metabolic activity of bacteria inside reproductive stages has been applied to DGGE for the first time. The results showed that most of the symbionts were metabolically active in the adult sponge as well as in the embryos and larvae. Initial experiments to reduce the amount of symbiotic bacteria inside larvae were positive. In the antibiotic treated larvae, the DGGE pattern showed a significantly reduced banding pattern intensity. The availability of E. ferox and its reproductive stages, as well as the possibility to maintain and to manipulate larvae in the laboratory makes E. ferox a suitable model-system for future research on vertical transmission.

Ants of the species Camponotus floridanus live in huge colonies composed of genetically identical or closely related animals, which should predispose them to an increased vulnerability towards infection by pathogens (Cremer et al. 2007). Therefore the question is how ants (or social insects in general) can nevertheless efficiently combat infections. In order to investigate the immune response of the ant C. floridanus, the present study initially focused on the identification of possible immune factors, encoded by the ant´s genome. By using the method “suppression subtractive hybridization” as well as by Illumnia sequencing technology, several immune-related genes could be identified. Among these were genes encoding proteins involved in pathogen recognition, signal transduction, antimicrobial activity, or general stress response. In accordance with the ant´s genome sequence (Bonasio et al. 2010), only three antimicrobial peptide (AMP) genes could be identified in C. floridanus. The gene and cDNA sequences of these AMPs were established and their expression was shown to be induced by microbial challenge. Two different defensin genes (type 1 and 2) were characterized. A detailed characterization of the mRNA and gene sequence of the other AMP, a hymenoptaecin, revealed a special repeat structure. The C. floridanus hymenoptaecin has a signal and a pro-sequence followed by a hymenoptaecin-like domain and six directly repeated hymenoptaecin domains (HDs). Since each HD is flanked by two known processing sites, proteolytic processing of the precursor protein may generate several mature AMPs. Bioinformatical analyses revealed the presence of hymenoptaecin genes with similar multipeptide precursor structure in genomes of other ant species suggesting an evolutionary conserved important role of this gene in ant immunity. C. floridanus ants harbor the obligate intracellular bacterium, Blochmannia floridanus, in specialized cells (so-called bacteriocytes), which are intercalated between midgut cells as well as in ovaries of females (Blochmann 1882; Sauer et al. 2002; Schröder et al. 1996). Ant hosts face the problem that on the one hand they have to maintain the beneficial symbiotic bacteria and on the other hand they need to raise an immune response against harmful pathogenic bacteria during an infection. It was investigated, if endosymbionts are actually detected by the host immune system. Injection of B. floridanus induced an immune response of its host C. floridanus, which was comparable to the one towards pathogens. This means that, despite the evolutionary established cooperation of the endosymbionts and their hosts, these bacteria are still recognized as „non-self“ by the host immune system. This finding led to the question, if the ant immune system might be involved in regulation of the endosymbiont number in the midgut tissue in order to avoid their uncontrolled replication. During the holometabolous life cycle of the ant hosts the distribution of bacteriocytes and of Blochmannia endosymbionts is remarkably dynamic and peaks in late pupal stages, in which the entire midgut is transformed into a symbiotic organ (Stoll et al. 2010). It was hypothesized that hosts could regulate the number of endosymbionts present in their tissues via the innate immune system. A quantitative gene expression analysis of assumed symbiosis-relevant candidate genes revealed distinct expression patterns of some genes according to developmental stage and tissue. Moreover, the immune gene expression in response to bacterial challenge was investigated in the pupal stage. By an artificial immune-challenge of pupae it was confirmed that in fact the immune response of the endosymbiont-bearing midgut tissue differs from that of other body parts. The data support a key role for amidase peptidoglycan recognition proteins (PGRPs), especially PGRP-LB, in endosymbiont tolerance and suggest an involvement of the lysosomal system in control of Blochmannia endosymbionts. In sum, this thesis provides a first description of the immune response of the ant C. floridanus. A comprehensive set of immune-relevant genes was determined. Especially, the identification and molecular characterization of the hymenoptaecin gene delivered new insights into the immune competence of ants in general. Moreover, first indications could be gathered for the involvement of the immune system in controlling the endosymbiont B. floridanus. / Ameisen der Art Camponotus floridanus leben in großen Kolonien, welche sich aus genetisch identischen oder nahe verwandten Individuen zusammensetzen. Demnach sollten diese Tiere eine erhöhte Anfälligkeit gegenüber Infektionen durch Pathogene haben (Cremer et al. 2007). Somit stellt sich die Frage, wie Ameisen (oder allgemein soziale Insekten) Infektionen dennoch effizient bekämpfen können. Um die Immunantwort der Ameise C. floridanus zu untersuchen, befasste sich die vorliegende Arbeit zunächst mit der Identifizierung von möglichen Immunfaktoren, welche im Genom der Ameise kodiert sind. Unter Verwendung der Methode “Suppression Subtractive Hybridization” sowie durch Illumnia Sequenzierungstechnologie konnten mehrere immun-relevante Gene ermittelt werden. Darunter befanden sich Gene, welche Proteine kodieren, die eine Rolle bei der Erkennung von Pathogenen, der Signalübertragung, der antimikrobiellen Aktivität oder der allgemeinen Stressantwort spielen. In Übereinstimmung mit der Genomsequenz der Ameise (Bonasio et al. 2010), konnten nur drei antimikrobielle Peptid (AMP) Gene in C. floridanus identifiziert werden. Die Gen- und cDNA-Sequenzen dieser AMPs wurden charakterisiert und es wurde gezeigt, dass ihre Expression durch mikrobielle Attacken induziert wird. Zwei verschiedene Defensin Gene (Typ 1 und 2) wurden charakterisiert. Eine detaillierte Charakterisierung der mRNA- und Gen-Sequenz des anderen AMPs, eines Hymenoptaecins, ergab eine besondere Wiederholungsstruktur. Das C. floridanus Hymenoptaecin hat eine Signal- und eine Pro-Sequenz gefolgt von einer Hymenoptaecin-ähnlichen Domäne und sechs direkt wiederholten Hymenoptaecin Domänen (HD). Da jede HD von bekannten Schnittstellen flankiert wird, könnte die proteolytische Bearbeitung des Vorläufer Proteins mehrere reife AMPs hervorbringen. Bioinformatische Analysen enthüllten die Anwesenheit von Hymenoptaecin Genen mit ähnlicher Multipeptid-Vorläufer-Struktur in den Genomen von anderen Ameisenarten, was eine evolutionär konservierte wichtige Aufgabe dieses Gens bei der Immunität von Ameisen andeutet. C. floridanus Ameisen beherbergen das obligat intrazelluläre Bakterium, Blochmannia floridanus, in speziellen Zellen (den sogenannten Bakteriozyten), welche sich zwischen Zellen des Mitteldarms befinden sowie in den Ovarien von Weibchen (Blochmann 1882; Sauer et al. 2002; Schröder et al. 1996). Die Wirtstiere stehen vor dem Problem, dass sie einerseits die für sie nützlichen symbiontischen Bakterien erhalten müssen und andererseits bei einer Infektion eine Immunantwort gegenüber schädlichen pathogenen Bakterien aufbringen müssen. Es wurde untersucht, ob die Endosymbionten vom Wirtsimmunsystem überhaupt erkannt werden. Injektion des eigenen Endosymbionten B. floridanus induzierte eine Immunantwort seines Wirtes C. floridanus, welche vergleichbar war mit der gegenüber Pathogenen. Dies bedeutet, dass trotz der Koevolution zwischen den Endosymbionten und ihren Wirte, diese Bakterien immer noch als „nicht-selbst“ vom Wirtsimmunsystem erkannt werden. Dieses Ergebnis warf die Frage auf, ob das Ameisen-Immunsystem an der Regulation der Anzahl von Endosymbionten im Mitteldarmgewebe beteiligt sein könnte, um deren unkontrollierte Replikation zu vermeiden. Während des holometabolen Lebenszyklus der Ameisen-Wirte ist die Verteilung der Bakteriozyten und der Blochmannia Endosymbionten bemerkenswert dynamisch und erreicht den Höhepunkt in den späten Puppenstadien, in welchen der gesamte Mitteldarm zu einem symbiotischen Organ umgewandelt wird (Stoll et al. 2010). Es wurde vermutet, dass die Wirte die vorhandene Anzahl von Endosymbionten in ihren Geweben durch das angeborene Immunsystem regulieren könnten. Eine quantitative Genexpressionsanalyse von vermeintlich Symbiose-relevanten Kandidatengenen ergab verschiedene Expressionsmuster von einigen Genen in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium und Gewebe. Außerdem wurde die Immungenexpression nach einer bakteriellen Attacke im Puppenstadium untersucht. Durch eine künstliche Immunanregung von Puppen wurde bestätigt, dass sich die Immunantwort des Endosymbiont-tragenden Mitteldarm Gewebes in der Tat von der anderer Körperteile unterscheidet. Die Daten befürworten eine Schlüsselrolle von Amidase Peptidoglykan Erkennungsproteinen (PGRPs), insbesondere von PGRP-LB, für die Duldung von Endosymbionten und deuten auf eine Beteiligung des lysosomalen Systems an der Kontrolle von Blochmannia Endosymbionten hin. Insgesamt stellt die vorliegende Arbeit eine erste Charakterisierung der Immunantwort der Ameise C. floridanus dar. Eine Vielzahl an immun-relevanten Genen wurde bestimmt. Insbesondere die Identifizierung und molekulare Charakterisierung des Hymenoptaecin Gens lieferte neue Einblicke in die Immun-Kompetenz von Ameisen im Allgemeinen. Außerdem konnten erste Hinweise für die Beteiligung des Immunsystems an der Kontrolle des Endosymbionten B. floridanus gesammelt werden.

Marine sponges are the most ancient metazoans and of large ecological importance as drivers of water and nutrient flows in benthic habitats. Furthermore marine sponges are well known for their association with highly abundant and diverse microbial consortia. Microorganisms inhabit the extracellular matrix of marine sponges where they can make up to 35% of the sponge’s biomass. Many microbial symbionts of marine sponges are highly host specific and cannot, or only in very rare abundances, be found outside of their host environment. Of special interest is the candidate phylum Poribacteria that was first discovered in marine sponges and still remains almost exclusive to their hosts. Phylogenetically Poribacteria were placed into the Planctomycetes, Verrucomicrobia, Chlamydiae superphylum and similarly to many members of this superphylum cell compartmentation has been proposed to occur in members of the Poribacteria. The status as a candidate phylum implies that no member of Poribacteria has been obtained in culture yet. This restricts the investigations of Poribacteria and their interactions with marine sponges to culture independent methods and makes functional characterisation a difficult task. In this PhD thesis I used the novel method of single-cell genomics to investigate the genomic potential of the candidate phylum Poribacteria. Single-cell genomics enables whole genome sequencing of uncultivated microorganisms by singularising cells from the environment, subsequent cell lysis and multiple displacement amplification of the total genomic DNA. This process yields sufficient amounts of DNA for whole genome sequencing and genome analysis. This technique and its relevance for symbiosis studies are discussed in this PhD thesis. Through the application of single-cell genomics it was possible to increase the number of single-amplified genomes of the candidate phylum Poribacteria from initially one to a total of six. Analyses of these datasets made it possible to enhance our understanding of the metabolism, taxonomy, and phylum diversity of Poribacteria and thus made these one of the best-characterised sponge symbionts today. The poribacterial genomes represented three phylotypes within the candidate phylum of which one appeared dominant. Phylogenetic and phylogenomic analyses revealed a novel phylogenetic positioning of Poribacteria distinctly outside of the Planctomycete, Verrucomicorbia, Chlamydiae superphylum. The occurrence of cell compartmentation in Poribacteria was also revisited based on the obtained genome sequences and revealed evidence for bacterial microcompartments instead of the previously suggested nucleotide-like structures. An extensive genomic repertoire of glycoside hydrolases, glycotransferases, and other carbohydrate active enzymes was found to be the central shared feature between all poribacterial genomes and showed that Poribacteria are among those marine bacteria with the largest genomic repertoire for carbohydrate degradation. Detailed analysis of the carbohydrate metabolism revealed that Poribacteria have the genomic potential for degradation of a variety of polymers, di- and monosaccharaides that allow these symbionts to feed various nutrient sources accessible through the filter-feeding activities of the sponge host. Furthermore the poribacterial glycobiome appeared to enable degradation of glycosaminoglycan chains, one of the main building blocks of extracellular matrix of marine sponges. Different lifestyles resulting from the poribacterial carbohydrate degradation potential are discussed including the influence of nutrient cycling in sponges, nutrient recycling and scavenging. The findings of this thesis emphasise the long overlooked importance of heterotrophic symbionts such as Poribacteria for the interactions with marine sponges and represent a solid basis for future studies of the influence heterotrophic symbionts have on their sponge hosts. / Marine Schwämme sind die ältesten rezenten Vertreter der Metazoen. Durch ihre Lebensweise als Nahrungsfiltrierer und den damit verbundenen Einfluss auf Nährstoffzyklen sind sie von großer ökologischer Relevanz. Des Weiteren zeichnen sich marine Schwämme durch das Zusammenleben mit hoch abundanten und diversen mikrobiellen Konsortien aus. Diese Mikroorganismen finden sich meist in der extrazellulären Matrix des Schwamms und können mehr als 35% der Biomasse ihres Wirtes ausmachen. Viele mikrobielle Symbionten mariner Schwämme sind hochgradig Wirts-spezifisch und können außerhalb des Schwamms, wenn überhaupt, nur in sehr geringer Anzahl gefunden werden. Von besonderem Interesse ist das Candidatus Phylum Poribacteria, dessen Vertreter erstmals in Schwämmen detektiert wurden, und bis heute fast ausschließlich in Schwämmen zu finden sind. Phylogenetisch wurden die Poribacteria dem Planctomycetes, Verrucomicrobia, Chlamydiae (PVC) Superphylum zugeordnet. Einige Vertreter dieses Superphylums zeigen einen kompartimentierten Zellplan auf, eine Eigenschaft, die auch für Poribacteria vermutet wird. Der Status der Poribacteria als Candidatus Phylum zeigt das Fehlen von Vertretern dieses Phylums in Reinkultur an. Dies beschränkt die Untersuchung von Poribacteria auf kultivierungs-unabhängige Methoden, was die funktionelle Charakterisierung dieser Symbionten erheblich erschwert. In dieser Doktorarbeit wurde das Candidatus Phylum Poribacteria mit Hilfe der Einzelzellgenomik untersucht. Diese Methode ermöglicht es aus vereinzelten mikrobiellen Zellen genomische Komplett-DNA zu gewinnen und diese, mit Hilfe der so genannten „multiple displacement amplification“ so hochgradig anzureichern, dass eine Sequenzierung und anschließende Analyse erfolgen kann. Die Anwendung dieser Methode im Allgemeinen und in der Symbiose Forschung wird in dieser Doktorarbeit diskutiert. Die Einzelzellgenomik ermöglichte die Anzahl poribakterieller Datensätze, von zunächst einem auf sechs Genome zu erhöhen. Die Analyse dieser Genome konnte unser Verständnis vom metabolischen Potential, der Taxonomie und der Diversität innerhalb dieses Phylums deutlich zu verbessern. Die poribakteriellen Genome beschrieben drei Phylotypen, von denen einer deutlich dominierte. Die phylogenetische Position des Phylums Poribacteria wurde außerdem anhand von phylogenetischen und phylogenomischen Berechnungen neu zugeordnet, und resultierte in einer deutlichen Positionierung außerhalb des PVC Superphylums. Weiterhin wurden genomische Hinweise auf einen kompartimentierten Zellplan in Poribacteria gefunden. Diese deuten aber nicht, wie vorher vermutet, auf eine Zellkern-ähnliche Struktur hin, sondern auf bakterielle Mikrokompartimente mit noch ungeklärter Funktion. Die Analysen des genomischen Potentials zeigte in allen Datensätzen eine hohe Frequenz von Genen, die für Glycosidasen, Glycosyltransferasen und weiteren Proteinen der so-genannten „carbohydrate active enzymes“ kodieren, was ein ausgeprägtes Vermögen zum Kohlehydratabbau aufzeigt. Das genomische Potential von Poribacteria zum Abbau von Kohlehydratpolymeren, Di- und Monosacchariden konnte durch detaillierte Analyse des Kohlehydratmetabolismus genau beschrieben werden. Außerdem schienen Poribacteria Glycosaminoglycanketten, die zentrale Bausteine der extrazellulären Matrix des Schwammes sind, abbauen zu können. Die aus dem poribakteriellen Glycobiome resultierenden möglichen Lebensweisen als Wiederverwerter von Nährstoffen, Mitesser, oder auch der Einfluss von Poribacteria auf Nährstoffzyklen im Schwamm werden in dieser Doktorarbeit diskutiert. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit machen Poribacteria zu den genomische am besten beschriebenen Schwammsymbionten und zeigen die lange übersehene Relevanz heterotropher Symbionten in marinen Schwämmen.

The evolutionary success of insects is believed to be at least partially facilitated by symbioses between insects and prokaryotes. Bacterial endosymbionts confer various fitness advantages to their hosts, for example by providing nutrients lacking from the insects’ diet thereby enabling the inhabitation of new ecological niches. The Florida carpenter ant Camponotus floridanus harbours endosymbiotic bacteria of the genus Blochmannia. These primary endosymbionts mainly reside in the cytoplasm of bacteriocytes, specialised cells interspersed into the midgut tissue, but they were also found in oocytes which allows their vertical transmission. The social lifestyle of C. floridanus may facilitate the rapid spread of infections amongst genetically closely related animals living in huge colonies. Therefore, the ants require an immune system to efficiently combat infections while maintaining a “chronic” infection with their endosymbionts. In order to investigate the immune repertoire of the ants, the Illumina sequencing method was used. The previously published genome sequence of C. floridanus was functionally re-annotated and 0.53% of C. floridanus proteins were assigned to the gene ontology (GO) term subcategory “immune system process”. Based on homology analyses, genes encoding 510 proteins with possible immune function were identified. These genes are involved in microbial recognition and immune signalling pathways but also in cellular defence mechanisms, such as phagocytosis and melanisation. The components of the major signalling pathways appear to be highly conserved and the analysis revealed an overall broad immune repertoire of the ants though the number of identified genes encoding pattern recognition receptors (PRRs) and antimicrobial peptides (AMPs) is comparatively low. Besides three genes coding for homologs of thioester-containing proteins (TEPs), which have been shown to act as opsonins promoting phagocytosis in other insects, six genes encoding the AMPs defesin-1 and defensin-2, hymenoptaecin, two tachystatin-like peptides and one crustin-like peptide are present in the ant genome. Although the low number of known AMPs in comparison to 13 AMPs in the honey bee Apis mellifera and 46 AMPs in the wasp Nasonia vitripennis may indicate a less potent immune system, measures summarised as external or social immunity may enhance the immune repertoire of C. floridanus, as it was discussed for other social insects. Also, the hymenoptaecin multipeptide precursor protein may be processed to yield seven possibly bioactive peptides. In this work, two hymenoptaecin derived peptides were heterologously expressed and purified. The preliminary antimicrobial activity assays indicate varying bacteriostatic effects of different hymenoptaecin derived peptides against Escherichia coli D31 and Staphylococcus aureus which suggests a functional amplification of the immune response further increasing the antimicrobial potency of the ants. Furthermore, 257 genes were differentially expressed upon immune challenge of C. floridanus and most of the immune genes showing differential expression are involved in recognition of microbes or encode immune effectors rather than signalling components. Additionally, genes coding for proteins involved in storage and metabolism were downregulated upon immune challenge suggesting a trade-off between two energy-intensive processes in order to enhance effectiveness of the immune response. The analysis of gene expression via qRT-PCR was used for validation of the transcriptome data and revealed stage-specific immune gene regulation. Though the same tendencies of regulation were observed in larvae and adults, expression of several immune-related genes was generally more strongly induced in larvae. Immune gene expression levels depending on the developmental stage of C. floridanus are in agreement with observations in other insects and might suggest that animals from different stages revert to individual combinations of external and internal immunity upon infection. The haemolymph proteome of immune-challenged ants further established the immune-relevance of several proteins involved in classical immune signalling pathways, e.g. PRRs, extracellularly active proteases of the Toll signalling pathway and effector molecules such as AMPs, lysozymes and TEPs. Additionally, non-canonical proteins with putative immune function were enriched in immune-challenged haemolymph, e.g. Vitellogenins, NPC2-like proteins and Hemocytin. As known from previous studies, septic wounding also leads to the upregulation of genes involved in stress responses. In the haemolymph, proteins implicated in protein stabilisation and in the protection against oxidative stress and insecticides were enriched upon immune challenge. In order to identify additional putative immune effectors, haemolymph peptide samples from immune-challenged larvae and adults were analysed. The analysis in this work focussed on the identification of putative peptides produced via the secretory pathway as previously described for neuropeptides of C. floridanus. 567 regulated peptides derived from 39 proteins were identified in the larval haemolymph, whereas 342 regulated peptides derived from 13 proteins were found in the adult haemolymph. Most of the peptides are derived from hymenoptaecin or from putative uncharacterised proteins. One haemolymph peptide of immune-challenged larvae comprises the complete amino acid sequence of a predicted peptide derived from a Vitellogenin. Though the identified peptide lacks similarities to any known immune-related peptide, it is a suitable candidate for further functional analysis. To establish a stable infection with the endosymbionts, the bacteria have to be transmitted to the next generation of the ants. The vertical transmission of B. floridanus is guaranteed by bacterial infestation of oocytes. This work presents the first comprehensive and detailed description of the localisation of the bacterial endosymbionts in C. floridanus ovaries during oogenesis. Whereas the most apical part of the germarium, which contains the germ-line stem cells, is not infected by the bacteria, small somatic cells in the outer layers of each ovariole were found to be infected in the lower germarium. Only with the beginning of cystocyte differentiation, endosymbionts are exclusively transported from follicle cells into the growing oocytes, while nurse cells were never infected with B. floridanus. This infestation of the oocytes by bacteria very likely involves exocytosis-endocytosis processes between follicle cells and the oocytes. A previous study suggested a down-modulation of the immune response in the midgut tissue which may promote endosymbiont tolerance. Therefore, the expression of several potentially relevant immune genes was analysed in the ovarial tissue by qRT-PCR. The relatively low expression of genes involved in Toll and IMD signalling, and the high expression of genes encoding negative immune regulators, such as PGRP-LB, PGRP-SC2, and tollip, strongly suggest that a down-modulation of the immune response may also facilitate endosymbiont tolerance in the ovaries and thereby contribute to their vertical transmission. Overall, the present thesis improves the knowledge about the immune repertoire of C. floridanus and provides new candidates for further functional analyses. Moreover, the involvement of the host immune system in maintaining a “chronic” infection with symbiotic bacteria was confirmed and extended to the ovaries. / Der evolutionäre Erfolg von Insekten wird zumindest teilweise Symbiosen zwischen Insekten und Prokaryonten zugeschrieben. Dabei übertragen bakterielle Symbionten verschiedenste Fitnessvorteile an ihre Wirte. Beispielsweise ermöglicht die Bereitstellung von Nährstoffen, welche in der Nahrung des Insekts fehlen, die Erschließung neuer ökologischer Nischen. Die Florida Rossameise Camponotus floridanus trägt endosymbiontische Bakterien der Gattung Blochmannia. Diese primären Endosymbionten kommen hauptsächlich im Zytoplasma von spezialisierten Zellen des Mitteldarms, den sogenannten Bakteriozyten, vor. Blochmannien wurden aber auch in Oozyten und Eiern gefunden, was ihre vertikale Übertragung an Individuen der nächsten Generation ermöglicht. Als soziale Insekten leben C. floridanus in großen Kolonien von nah verwandten Individuen. Ihre Lebensweise begünstigt möglicherweise die schnelle Ausbreitung von Infektionen, weshalb erwartet werden müsste, dass die Ameisen ein effizientes Immunsystem besitzen. Gleichzeitig muss jedoch die „chronische“ Infektion mit den bakteriellen Symbionten aufrechterhalten werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das Immunrepertoire der Ameisen mittels Illumina Sequenzierung charakterisiert. Zunächst wurde das vor kurzem publizierte Genom von C. floridanus funktionell re-annotiert. Dabei wurden 0.53% der annotierten Proteine der GO-Unterkategorie “Prozesse des Immunsystems” zugeordnet. Basierend auf Homologieanalysen wurden Gene identifiziert, die für 510 Immunproteine kodieren. Die Genprodukte spielen eine Rolle bei der Erkennung von Mikroben und in den Signalwegen des Immunsystems, sind jedoch auch an Prozessen der zellulären Immunantwort, wie beispielsweise Phagozytose und Melanisierung, beteiligt. Dabei sind Komponenten der Hauptsignalwege hoch konserviert. Obwohl die Anzahl der identifizierten Proteine, die Fremdorganismen erkennen (PRRs), und die Anzahl an antimikrobiellen Peptiden (AMPs) vergleichsweise gering ist, verfügt C. floridanus insgesamt über ein umfangreiches Immunrepertoire. Neben drei Genen, die für Thioester-enthaltende Proteine (TEPs) kodieren und wie in anderen Insekten möglicherweise eine Rolle als Opsonine bei der Phagozytose spielen, wurden sechs AMP-Gene identifiziert. Diese kodieren für Defesin-1 und Defensin-2, Hymenoptaecin, zwei Tachystatin-ähnliche und ein Crustin-ähnliches Peptid. Die geringe Anzahl an bekannten AMPs im Vergleich zur Honigbiene Apis mellifera (13 AMPs) und Wespe Nasonia vitripennis (46 AMPs) könnte ein möglicherweise geringeres Potential des Immunsystems anzeigen. Allerdings könnten zusätzliche Maßnahmen, die unter dem Begriff „Soziale Immunität“ zusammengefasst werden, das Immunrepertoire von C. floridanus ergänzen, wie es schon für andere Insekten diskutiert wurde. Zudem könnten durch proteolytische Prozessierung des Hymenoptaecin Multipeptid Präkursormoleküls sieben mögliche antimikrobielle Peptide freigesetzt werden. Für die vorliegende Arbeit wurden zwei verschiedene dieser Hymenoptaecin Peptide heterolog exprimiert und aufgereinigt. Die vorläufige funktionelle Charakterisierung der Peptide zeigt, dass diese Peptide möglicherweise bakteriostatische Wirkung mit einem unterschiedlichen Wirkspektrum gegen Escherichia coli D31 und Staphylococcus aureus entfalten. Dies erlaubt die Annahme, dass die Expression des Hymenoptaecins zu einer funktionellen Amplifikation der Immunantwort führt und das Immunrepertoire der Ameisen erweitert. Nach Injektion von bakteriellem Material in die Ameisen wurde die Expression von 257 Genen reguliert. Viele dieser Gene kodieren für Proteine zur Erkennung von Pathogenen oder kodieren für Effektoren des Immunsystems. Komponenten der Signalwege zeigten dagegen kaum Veränderungen in ihrer Expression auf. Außerdem zeigten Gene, die für Speicherproteine oder Proteine des Metabolismus kodieren, generell eine geringere Expression nach Stimulierung des Immunsystems auf. Dies lässt einen Ausgleich zwischen zwei energieintensiven Prozessen vermuten, um eine effektive Immunantwort zu ermöglichen. Darüber hinaus zeigt die Validierung der Expressionsdaten mittels qRT-PCR eine Abhängigkeit der Expression mehrerer Gene vom Entwicklungsstadium der Ameisen auf. Generell wurden die gleichen Tendenzen in der Regulation der Expression dieser Gene nach Immunstimulierung beobachtet. Allerdings wurde die Expression mehrerer immunrelevanter Gene in Larven weit stärker induziert als in Adulten. Wie es auch schon für andere Insekten gezeigt wurde, scheinen C. floridanus Larven und Arbeiterinnen auf individuelle Kombinationen externer und interner Immunfaktoren zurückzugreifen. Die vorher beschriebenen Transkriptomdaten wurden durch die Charakterisierung des Hämolymph-Proteoms von C. floridanus nach Immunstimulation ergänzt, wodurch die Immunrelevanz vieler Faktoren auch auf Proteinebene bestätigt werden konnte. Beispielsweise wurden zahlreiche PRRs und extrazellulär aktive Proteasen des Toll-Signalwegs, aber auch Immuneffektoren wie AMPs, Lysozyme und TEPs in der Hämolymphe identifiziert. Zusätzlich führte die Immunstimulation in Larven und Adulten zur Anreicherung nicht-kanonischer Proteine mit möglicher Immunfunktion, beispielsweise Vitellogenine, NPC2-ähnliche Proteine und Hemocytin. Aus einer früheren Arbeit ist bekannt, dass septische Verwundungen zusätzlich die transkriptionelle Aktivierung von Genen der Stressantwort hervorrufen können. So wurden auch in der Hämolymphe Proteine entdeckt, die eine Rolle bei der Stabilisierung von Proteinen, und dem Schutz gegen oxidativen Stress und Insektizide spielen. Zur Identifizierung weiterer möglicher Peptideffektoren wurden Hämolymphpeptid-Proben von immunstimulierten Larven und Adulten analysiert. Der Fokus der Analyse lag dabei auf der Identifizierung von Peptiden, die auf dem sekretorischen Weg gebildet werden, wie es zuvor für Neuropeptide von C. floridanus beschrieben worden war. 567 differentiell regulierte Peptide, die von 39 Proteinen abstammen, wurden in Larvenhämolymphe identifiziert, wohingegen in der Hämolymphe von Adulttieren 342 derartige Peptide, die 13 Proteinen zugeordnet werden können, gefunden wurden. Die meisten dieser Peptide können Hymenoptaecin oder bisher noch nicht charakterisierte Proteinen zugeordnet werden. Jedoch wurde ein Peptid in larvaler Hämolymphe identifiziert, dessen Aminosäuresequenz vollständig mit der Sequenz eines vorhergesagten, von Vitellogenin stammenden Peptids übereinstimmt. Weil dieses Peptid keine Ähnlichkeiten zu anderen bereits charakterisierten antimikrobiellen Peptiden aufweist, stellt es einen geeigneten Kandidaten für weitere funktionelle Analysen dar. Die bakterielle Infektion von Oozyten ermöglicht die transovariale Übertragung von B. floridanus und ermöglicht damit die Etablierung einer stabilen Infektion in der nächsten Wirtsgeneration. Die vorliegende Arbeit beinhaltet die erste umfassende und detaillierte Beschreibung der Lokalisation bakterieller Endosymbionten in Ovarien von C. floridanus. Im apikalen Germarium, in welchem sich die Keimbahn-Stammzellen befinden, liegt noch keine bakterielle Infektion des Gewebes vor. In späteren Segmenten des Germariums jedoch können Blochmannien das erste Mal in kleinen somatischen Zellen der äußeren Schicht jeder Ovariole detektiert werden. Mit beginnender Zystozytendifferenzierung werden die Endosymbionten von Follikelzellen ausschließlich in die heranwachsenden Oozyten transportiert, wobei sehr wahrscheinlich Exozytose-Endozytose-Prozesse involviert sind. Nährzellen zeigen zu keinem Zeitpunkt während der Oogenese eine bakterielle Infektion auf. Da in einer früheren Studie vorgeschlagen wurde, dass eine signifikant reduzierte Anregung der Immunantwort im Mitteldarmgewebe zur Toleranz der Endosymbionten beitragen könnte, wurde auch die Expression ausgewählter Immungene in den Ovarien durch qRT-PCR untersucht. Die relativ geringe Expression von Genen des Toll- und des IMD-Signalwegs und die zusätzlich vergleichsweise starke Genexpression negativer Regulatoren des Immunsystems, wie PGRP-LB, PGRP-SC2 und tollip, sind Indikatoren einer reduzierten Immunantwort in den Ovarien von C. floridanus. Wie schon für den Mitteldarm der Tiere vorgeschlagen, könnte dies möglicherweise sowohl zur Toleranz von Blochmannia als auch zur vertikalen Übertragung der Endosymbionten beitragen. Die vorliegende Doktorarbeit erweitert das Wissen über das Immunrepertoire von C. floridanus und es konnten vielversprechende Kandidaten für weitere funktionelle Analysen von möglichen Immunfaktoren identifiziert werden. Darüber hinaus konnten weitere Hinweise auf die Bedeutung von Immunfaktoren der Ameisen bei der Toleranz gegenüber den symbiontischen Bakterien gefunden und auf die Ovarien der Tiere ausgeweitet werden.

Ma thèse de doctorat a pour titre « Colonial "blue mat" ciliates from northeast Pacific hydrothermal vents: microbial symbiosis and ecology ». Les colonies de ciliés folliculines forment d'épais et éclatants tapis bleus en périphérie de plusieurs sources hydrothermales de la dorsale Juan de Fuca dans le Pacifique Nord-est et ailleurs. Ces tapis peuvent couvrir jusqu'a 70% des substrats basaltiques auxquels ils sont attachés. À ce jour, nous connaissons très peu de l'écologie et de la biologie des ciliés folliculines en provenance des sources hydrothermales ni de leur importance pour d'autres espèces. Ma thèse se veut une investigation d'une symbiose potentielle entre les ciliés folliculines et les procaryotes aux sources hydrothermales. Elle considère aussi l'écologie trophique des tapis bleus ainsi que les invertébrés qui y sont associés. Les symbioses sont un trait commun aux sources hydrothermales ainsi qu'aux protozoaires ciliés. Le succès écologique des tapis bleus, démontré notamment par leur abondance et leur distribution répandue autour des sources, pourrait être attribué aux symbiotes procaryotiques contenus dans les folliculines-hôte. L'ultrastructure des ciliés tapis bleus a été explorée en utilisant la microscopie électronique de balayage [MEB] et la microscopie électronique à transmission [MET]. En nous basant sur nos observations morphologiques et ultrastructurales, nous avons assigné ces ciliés au genre folliculine Folliculinopsis. Les ciliés folliculines secrètent et vivent dans des coques ou tubes (loricae). Nous avons trouvé que les loricae ont été colonisés à la fois par des bactéries coccoïdes et des procaryotes filamenteux. De plus grandes densités de coccoïdes et de microorganismes en bâtonnets ont été trouvées entre les rangs de cils sur le corps du cilié (zooïde), surtout sur les lobes du péristome (les extensions similaires à des bras typiques des ciliés folliculines). Le morphotype coccoïde (dedans ou indépendant des vacuoles) se retrouvait à travers tout le cytoplasme du cilié. Des groupes de cet organisme rassemblé dans des vacuoles étaient distribués régulièrement le long du cortex du cilié. Des traits denses aux électrons, bornés par des vacuoles et caractérisés par des membranelles superposées, ont été également trouvés dans le cytoplasme du cilié. Des méthodes moléculaires complémentaires [comparaison des séquences d'ARN ribosomique 16S et l'hybridation in situ avec fluorescence (FISH)] ont été utilisées pour identifier les types de microorganismes associés symbiotiquement aux tapis bleus et pour déterminer leur répartition dans la cellule du cilié. Nos résultats indiquent que le Folliculinopsis sp. héberge des endosymbiotes euryarchées. Ceux-ci se situent dans un clade d'organismes qui sont étroitement apparentés à des séquences environnementales de fluides froids qui ont des quantités élevées de méthanogènes. Sous microscope à épifluorescence équipé d'un filtre DAPI, la présence de l'enzyme 420 autofluorescente, typique aux méthanogènes, a été observée dans les cellules du cyploplasme du cilié. En plus d'archées, une haute densité de bactéries a été trouvée dans le cytoplasme du cilié de même que sur la surface du loricae. Quelques-unes de ces séquences bactériennes ont été phylogénétiquement reliées aux ecto and endo symbiotes connues d'autres types d'hôtes. Les ciliés folliculines des sources hydrothermales du Pacifique Nord-est apparaissent dès lors héberger de multiples symbioses hylogénétiquement distinctes et localisées dans diverses parties de leurs cellules. Puisque les tapis bleus sont physiquement dominants aux sources hydrothermales, ils forment un habitat physique substantiel dans lequel les espèces de méiofaune et de macrofaune peuvent trouver nourriture et refuge, comme c'est le cas avec les buissons de vestimentifères et les moulières de mytilidés de la sous-famille Bathymodiolinae qui croissent autour des sources hydrothermales et des sources de fluides froids. Afin de déterminer l'importance probable de ces ciliés pour les autres métazoaires provenant des sources, les invertébrés associés aux échantillons de tapis bleus ont été identifiés et quantifiés et des analyses d'isotopes stables de carbone et de l'azote ont été réalisées. De plus, des analyses de lipides des tapis bleus ont été faites. Nous avons trouvé une récurrence d'invertébrés associés aux tapis bleus et dans tous les échantillons, la méiofaune était numériquement dominante. Les copépodes harpaticoïdes, Amphiascus sp. étaient fort plus abondants que les autres espèces dans les tapis bleus. Alors que certains invertébrés (ex. Amphiascus sp.) dans cet assemblage semblent exclusivement liés aux tapis bleus, d'autres proviennent de sources hydrothermales différentes à proximité. Les ciliés Folliculinopsis sp. étaient davantage réduits dans δ¹³C que les invertébrés dans l'assemblage de tapis bleus indiquant du coup que ces derniers ne se nourrissent pas uniquement des premiers. Au moins deux niveaux trophiques existent dans cet assemblage. La macrofaune juvénile, les ostracodes et les nématodes occupent des niveaux trophiques supérieurs. Les analyses de lipides bactériennes indiquent que 16:1ω7 et 18:1ω7 (typiques aux sulfo-oxidantes) constituent plus de la moitié des acides gras des tapis bleus. Les tapis bleus apparaissent ainsi jouer un rôle indirect, mais important pour l'écologie des organismes qui leur sont associés. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Folliculines, Sources hydrothermales, Isotopes stable, Lipides, Méiofauna, Macrofauna, Symbiose, Microscopie électronique, Ultrastructure.

Thèse doctorat : Analyse et Modélisation des Systèmes Biologiques : Villeurbanne, INSA : 1997. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 118-132.