Les microARNs (miARNs) participent à la régulation du destin et de la différenciation cellulaire. La littérature fait état d'une variété de miARNs exprimés dans le placenta dont plusieurs sont exprimés uniquement dans les trophoblastes. Par contre, peu de chercheurs ont exploré les fonctions des miARNs dans les cellules placentaires. Dans cette étude, nous avons mis au point une approche fonctionnelle reposant sur l'inhibition d'une enzyme impliquée dans la maturation des miARNs afin d'évaluer l'implication de ceux-ci dans la régulation de la différenciation des trophoblastes in vitro. Ainsi, grâce à la technologie de I'ARNi, l'expression protéique de l'enzyme Drosha a été inhibée jusqu'à 80% dans les choriocarcinomes de la lignée BeWo. Suite à l'inhibition de Drosha, une augmentation significative du taux de fusion cellulaire a été mesurée, mais celle-ci n'a pas été accompagnée d'une augmentation de la sécrétion d'hCG par les cellules BeWo. L'activité globale des miARNs favorise donc le maintien des CT dans un état prolifératif. Des analyses de qRT-PCR subséquentes ont révélé que l'augmentation de la fusion cellulaire mesurée était accompagnée d'un accroissement de l'expression du transcrit de Syncytine-2, une protéine fusiogène connue. Des analyses in silico réalisées à l'aide des logiciels libres MiRanda et TargetScan ont dévoilé que le transcrit de Syncytine-2 serait la cible d'une vingtaine de miARNs dont plusieurs sont membres des familles miR-17, miR-515 et miR-15. En conclusion, cette étude a permis de confirmer que les miARNs ont un rôle essentiel dans la régulation de la différenciation morphologique des cellules BeWo in vitro. Il reste cependant à élucider les mécanismes moléculaires exacts par lesquels les miARNs participent à la différenciation des cellules placentaires. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : placenta, trophoblaste, différenciation, microARNs, fusion, Syncytine-2.

Près de 8% du génome humain est constitué de séquences d'origine rétrovirale. Ces séquences nommées HERVs (Human Endogenous RetroVirus) représentent des vestiges d'intégrations rétrovirales ancestrales qui font maintenant partie de notre génome. Certaines de ces séquences sont toujours aptes à produire des protéines typiques aux rétrovirus, telles que les protéines de l'enveloppe ou certaines protéines régulatrices. La présence des HERVs dans le génome humain peut se révéler être associée à divers phénomènes biologiques, favorisant ainsi l'idée qu'une corrélation entre ces rétrovirus endogènes et certaines pathologies, telles que la sclérose en plaque, la schizophrénie ou encore la pré-éclampsie pourrait exister. Cependant, il a été suggéré qu'une protéine d'enveloppe appartenant à une séquence d'HERV, nommée Syncytine-l, pourrait participer au développement du placenta. La fonction de cette dernière serait de provoquer des événements de fusion cellulaire entre les cellules cytotrophoblastiques du placenta, permettant la formation de la structure cellulaire nommée syncytiotrophoblaste. Cependant, d'autres protéines d'enveloppe d'HERVs découvertes récemment, telle que la Syncytine-2, pourraient aussi participer à ces événements fusogéniques de façon équivalente, voir plus importante que la Syncytine-l. L'étude menée ici a tout d'abord eu pour but d'approfondir et de présenter des mécanismes possibles de régulation du gène Syncytine-l ainsi que d'un autre gène env d'HERVs, soit la Syncytine-2, possiblement impliquée dans les événements fusogéniques des cellules trophoblastiques. D'abord, des expériences de 5'/3' RACE ont permis de caractériser les extrémités du transcrit Syncytine-2. L'expression de ces enveloppes rétrovirales a été ensuite étudiée en utilisant la technique RT-PCR. En effet, l'ARN total a été extrait de différentes lignées cellulaires de choriocarcinomes trophoblastiques (BeWo, Jar et JEG-3), stimulées ou non avec les agents activateurs, forskoline (un activateur de l'adénylate cyclase) et bpV[pic] (un inhibiteur de phosphotyrosine phosphatase) dont l'impact dans les événements de fusion a été étudié parallèlement. D'autres amplifications par RTPCR, utilisant l'ARN de cellules primaires humaines placentaires, ont été envisagées, afin de mettre en évidence l'expression de ces gènes dans un contexte plus représentatif du placenta. D'autre part, une étude des différentes activités promotrices a été réalisée à l'aide de différents clonages des régions LTR-5' de ces deux gènes dans un vecteur rapporteur de la luciférase. Dans un second temps, il s'agissait d'étudier l'implication fonctionnelle de ces deux protéines d'enveloppe d'HERVs, au cours de la syncytialisation des trophoblastes, par différentes expériences de fusion en présence d'inhibiteurs de l'expression de ces enveloppes rétrovirales telles que des molécules d'ARN Interférents. Enfin, leur localisation cellulaire a été mise en évidence au travers de la microscopie confocale. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : HERV, Rétrovirus endogène, Env, Syncytine-1, Syncytine-2, Placenta, Trophoblaste, Fusion, Syncytium, Expression, Transcription, LTR, Localisation, siRNA.

Près de 8% du génome humain est constitué de séquences d'origine rétrovirale. Ces séquences HERV s représentent des vestiges d'intégrations rétrovirales ancestrales et font maintenant partie de notre génome. Certaines de ces séquences sont toujours aptes à produire des protéines typiques aux rétrovirus, telles que les protéines de l'enveloppe. La présence des HERVs dans le génome humain est associée à divers phénomènes biologiques. En effet, il a été démontré que deux protéines d'enveloppe appartenant à des séquences d'HERV, soit la Syncytine 1 et Syncytine 2, participent au développement du placenta, en provoquant des événements de fusion cellulaire entre les cellules cytotrophoblastiques du placenta, permettant la formation du syncytiotrophoblaste. Cependant, deux autres protéines d'enveloppe d'HERVs ont été récemment identifiées et suscitent un intérêt particulier. Il s'agit de EnvP(b), une protéine fusogénique mais ubiquitaire et, EnvV, dont l'expression est spécifique au placenta. La présente étude visait d'abord à caractériser les transcrits de ces protéines et approfondir notre connaissance du rôle suggéré dans les événements fusogéniques des cellules trophoblastiques. Nos travaux ont démontré que, bien que possédant chacune un transcrit et une régulation transciptionnelle similaires aux deux Syncytines 1 et 2, EnvP(b) et EnvV ne semblent pas être indispensables lors des événements fusogéniques des cytotrophoblastes. La Syncytine 1 et 2 restent alors les deux seules protéines d'enveloppe d'HERVs connues à ce jour, impliquées dans ce processus. Ainsi, dans un second volet, nous voulions vérifier si une altération de l'expression de ces deux gènes env corrélait avec un défaut de fusion des trophoblastes humains et qui plus est, avec les symptômes de la pré-éclampsie (PE). Nos résultats ont démontré hors de tout doute, que l'expression de la Syncytine 1 et 2 est altérée suivant la condition PE, induisant probablement la diminution de la fusion cellulaire des cytotrophoblastes, laquelle est observée dans des cas de pré-éclampsie. Cette altération fusogénique, dont les conséquences conduiraient à un dysfonctionnement du placenta et donc à la condition « prééclampsie » aurait donc pour origine un défaut en terme d'expression de ces deux protéines d'enveloppe. Complétant un dernier volet, nous voulions étudier et élucider les mécanismes faisant intervenir les exosomes cytotrophoblastiques. L'abondance des protéines d'enveloppe Syncytine 1 et 2 au sein de ces exosomes, a pour la première fois clairement été mise en évidence et, un rôle dans l'adressage et le transfert d'information visant une cellule cible de la couche syncytiale leur a été fortement suggéré. Finalement, l'étude de la composition de ces exosomes dans la circulation maternelle de patientes pré-éclamptiques nous a permis de mettre en évidence une déficience pour la Syncytine 2. Cette association exosome/Syncytine 2 devient alors un excellent biomarqueur de la condition pré-éclampsie. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : RétroVirus Endogène Humain (HERV), Syncytine 1, Syncytine 2, EnvP(b), EnvV, cytotrophoblaste, placenta, syncytialisation, pré-éclampsie, exosomes, biomarqueur.

Les syncytines sont des gènes d'enveloppes rétrovirales (env) capturés qui sont essentiels pour l'établissement du placenta chez les mammifères. Il a été proposé que la diversité des syncytines capturées explique pourquoi le placenta est l'organe le plus variable chez les mammifères. Ici nous avons employé deux approches pour étudier le lien entre la capture d'env et l'émergence et la diversité des structures placentaires. D'abord, nous avons étudié la placentation des Hyaenidae, les seuls carnivores à présenter un placenta très invasif hémochorial, comme l'humain. Comme tous les carnivores, les hyènes expriment la syncytin-Car1 précédemment décrite, mais nous avons identifié une nouvelle env, capturée uniquement chez ces dernières, que nous avons nommée Hyena-Env2. Ce nouveau gène est présent au même locus chez toutes les hyènes, ayant été capturé pendant la radiation de la famille. Il est non-fusiogène mais a néanmoins été conservé pendant plus de 10 millions d'années et est exprimé à l'interface materno-fœtale du placenta, ce qui en fait un gène candidat pour expliquer le passage à la placentation hémochoriale qui a eu lieu chez les Hyaenidae. Ensuite, nous avons cherché des gènes syncytine dans le genre non-mammifère Mabuya, des lézards vivipares présentant un type rare de placenta très complexe et proche de celui des mammifères. Nous avons identifié une env qui a été capturée et conservée dans ce genre depuis sa radiation, il y a 25 millions d'années. Ce gène, que nous avons appelé syncytin-Mab1, est capable d'induire la fusion cellule-cellule et est exprimé dans une couche de cellules fusionnées à l'interface materno-fœtale du placenta, deux propriétés canoniques de syncytine. Nous avons aussi identifié le récepteur de syncytin-Mab1, MPZL1, et avons montré que leur interaction induit son activation et sa phosphorylation. L'activation de MPZL1 a été liée à la migration et à l'invasion cellulaire, indiquant que cette interaction env-récepteur pourrait jouer un rôle dans l'invasion placentaire du tissu maternel observée chez les Mabuya. Pour conclure, la caractérisation de ces deux nouvelles env indique que les gènes de type syncytine ont pu jouer un rôle à la fois dans l'émergence du placenta de Mabuya et dans la structure atypique du placenta des hyènes, supportant la notion que la capture d'env est une force évolutive majeure. / Syncytins are captured retroviral envelope genes (env) that are essential for the establishment of placental structures in mammals. The syncytins present in different mammalian families are highly diverse, resulting from distinct capture events, and it has been suggested that this might play a role in making the placenta the most diverse structure in mammals. Here we used two different approaches to investigate the links between env capture and emergence and diversity of placental structures. First, we investigated placentation in Hyaenidae, the only carnivorans that present a highly invasive hemochorial placenta, as is also found in humans. Hyenas express the previously identified syncytin-Car1 gene, as do all carnivorans, but we identified a new hyena-specific captured env that we named Hyena-Env2. This new gene is present at the same locus in all hyenas, having been captured during the radiation of this family. It is non-fusiogenic but still conserved over at least 10 million years of evolution and expressed at the materno-fetal interface in the hyena placenta, making it a candidate gene for explaining the endotheliochorial to hemochorial placental transition that occurred in Hyeanidae. Second, we searched for syncytin-like genes in the non-mammalian Mabuya lizards, which are viviparous and present a rare type of highly complex placenta that is very reminiscent of mammalian placentas. We identified an env gene that was captured and conserved in this genus since its radiation 25 million years ago. This gene, that we named syncytin-Mab1, is able to mediate cell-cell fusion in vitro and is expressed in a fused cell layer at the materno-fetal interface of the placenta in vivo, characteristic features of canonical mammalian syncytin genes. We also identified the cellular gene MPZL1 as the cognate receptor of syncytin-Mab1 and showed that their interaction induces activation and phosphorylation of the former. MPZL1 activation has been linked with cell migration and invasion, indicating that this env-receptor interaction could play a role in the placental invasion of maternal tissues observed in Mabuya. In conclusion, the characterization of these two novel env genes indicates that syncytin-like env might have played a role both in the emergence of the Mabuya placenta and the atypical placental structure of hyenas, reinforcing the notion that env capture is a major driving force in evolution.

Les rétrovirus endogènes (ERV) sont des éléments constitutifs de la plupart des génomes eucaryotes, et représentent chez l’humain environ 400000 loci. Les HERV sont divisés en familles distinctes, composées d’éléments apparentés mais structurellement hétérogènes. Leur activité peut être néfaste, neutre, mais aussi bénéfique. La majorité des HERV semble silencieuse dans les cellules somatiques. Cependant certains présentent une forte activité en contextes physiologiques. Par ailleurs, une expression significative de HERV est fréquemment observée dans des contextes pathologiques, tels que les cancers. La mise sous silence des éléments répétés est supposée se produire principalement par la méthylation de leur ADN. Nous nous sommes donc intéressés à l’implication de la méthylation des régions régulatrices des HERV, les LTR, dans le contrôle de leur expression. D’une part cette étude nous a permis de mettre en évidence une méthylation locus- et tissu- spécifique de LTR HERV en contexte physiologique, impliquant notamment des modalités particulières de méthylation contrôlant l’expression placentaire de HERV domestiqués. D’autre part ce travail nous a permis de déterminer que six loci HERV-W, incluant un locus domestiqué, sont réactivés de manière autonome dans des tumeurs testiculaires sous l’influence d’un changement de modalité de méthylation intra-famille. Ainsi la méthylation des HERV influence leur expression, mais sous des modalités variables selon les loci et les contextes concernés / Endogenous retroviruses are constitutive elements of most eukaryotic genomes. They represent about 400,000 loci in the human genome. HERVs are divided into distinct families on the basis of phylogenetic identities but are highly heterogeneous in structures. Their activity can be detrimental, neutral, or beneficial to the host. Majority of HERVs seems silent in somatic cells. Still, some are highly expressed in physiological contexts. Besides, a significant expression of HERVs is frequently observed in pathological contexts such as cancers. Silencing of repeated elements is supposed to occur mainly through DNA methylation. We were therefore interested by the implication of HERV regulatory region (LTR) methylation in the control of their expression. First, this study identified locus and tissues –specific HERV LTR methylation in physiological context, worth noting particular methylation modalities that control domesticated HERVs placental expression. Second, we could determine a change in intra-family LTR methylation modalities in testicular tumors leading to the autonomous reactivation of six HERV-W loci, among which a domesticated one. Thus methylation clearly influences HERVs expression, but under modalities varying upon the loci and the contexts