Synovial joints enable frictionless movement between the adjacent bones. Lubricating fluid enclosed within the joint reduce the pressure to allow free movement. Previously synovial joints have been associated with a terrestrial life and have mainly been studied in tetrapods, such as mammals and chicken, under the assumption that the joint did not evolve before animals adapted to a life on land. However, a recent study described the production and function of lubricin in the jaw and pectoral fin joints in ray-finned fishes, such as zebrafish, suggesting previous assumption to be questionable. The current study aim to further investigate the jaw joints in the ray-finned zebrafish, by examininge the morphology and presence of specific cell types, called synoviocytes, associated with the synovial joint. The synoviocytes are divided into two groups: macrophage-like cells and fibroblast-like cells. Tissue sections were histologically investigated with nuclear staining and immunohistochemically with antibodies to chondroitin sulphate (CS-56) and uridine diphosphoglucose dehydrogenase (UDPGD, UGDH) to investigate the presence of fibroblast-like cells. Small and circular cells were observed in the joint line and surrounding cartilage nascent to the joint. These cells could not be identified as chondrocytes or part of the perichondrium, and their UDPGD activity witness on similarities to the fibroblast-like cells. UDPGD is associated to the synthesis of hyaluronan (HA) which plays a key role in joint cavitation, hence, suggesting functional similarities in the development of zebrafish jaw joint to synovial joints. Furthermore a double transgenic zebrafish, fli1:EGFP/mpeg1:mCherry, was used to examine the presence of macrophages within the joint area. Macrophages were observed on the surface of the jaw joint in close association with blood vessels but did not show signs of incorporation within the joint. These results present further similarities of joints in ray-finned fish to the synovial joint but also the need to further examine similarities in order to understand the development and evolution of the joints. The possibility to implement the zebrafish model would facilitate future studies on the healthy synovial joint as well the diseases related to it.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第18886号 / 医博第3997号 / 新制||医||1009(附属図書館) / 31837 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 三森 経世, 教授 戸口田 淳也, 教授 開 祐司 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire chronique qui touche les articulations synoviales. La PR se caractérise par une expansion pseudo-tumorale des cellules synoviales de types fibroblastiques (FLS) qui envahissent et détruisent les articulations. Le Facteur de Necrose Tumorale (TNF) alpha joue un rôle primordial dans cette pathologie et le blocage de son action constitue une thérapie efficace contre la PR. Il existe néanmoins des patients non-répondeurs aux anti-TNFs ce qui suggére la participation d'autres cytokines dans la PR. La Lymphotoxine (LT) alpha est le plus proche homologue du TNFalpha, mais son rôle dans la PR reste peu étudié et le potentiel thérapeutique de son blocage pour traiter la maladie doit encore être établi. La déplétion des FLS hyperprolifératives constitue une autre stratégie pour le traitement de la PR. L'utilisation des membres de la Famille du TNF, TRAIL et Fas ligand (FasL), a été proposée pour induire la mort cellulaire pa r apoptose des FLS dans les articulations synoviales. Toutefois, ces cytokines sont pleiotropiques et peuvent causer des effets secondaires. Nous avons caractérisé les effets de la LTalpha, de TRAIL et FasL dans les FLS pour mieux comprendre ses rôles dans la PR. Nos résultas montrent que les niveaux sériques de la LTalpha sont augmentés dans la PR comparés aux patients sains ou atteints d'arthrose. Toute comme le TNFalpha, la LTalpha induit la prolifération et l'activation des FLS. Ainsi, l'inhibition simultanée de la LTalpha et du TNFalpha pourrait fournir un avantage thérapeutique dans le cadre des traitements contre la PR. Nous avons par ailleurs démontré que TRAIL est un facteur protecteur en début de la PR mais a un rôle promoteur au cours de la maladie. Le double rôle de TRAIL est corrélé à l'expression de TRAIL récepteur 1. Enfin, nous avons montré que FasL joue un rôle non-apoptotique dans les FLS, en modulant leur prolifération. Pour cette raison, une thérapie basée sur TRAIL ou FasL demande une sensibilisation à l'apoptose des FLS. / Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease affecting synovial joints. A hallmark of RA is the pseudo-tumoral expansion of fibroblast-like synoviocytes (FLS), which invade and destroy the joint. Blocking of Tumor Necrosis Factor (TNF) alpha is effective to treat RA. However, some patients are nonresponsive to anti-TNF therapies, suggesting the participation of other cytokines in RA. Lymphotoxin (LT) alpha is the closest homologous to TNFalpha, but little is known about its role in RA and therapeutic potential of blocking this cytokine to treat RA. Another strategy to treat RA is the depletion of hyperproliferative FLS. The TNF family members TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) and Fas ligand (FasL) have been proposed for targeting FLS in arthritic joints. However, these cytokines are pleiotropic and can thus cause unwanted effects. We aimed to characterize the effects of LTalpha, TRAIL and FasL in RA FLS and better understand their role in the pathog enesis of RA. Our results show that serum levels of LTalpha are increased in RA compared to osteoarthritis and healthy controls and LTalpha induces proliferation and activation of RA FLS to the same extent that TNFalpha. Thus, simultaneous blocking of LTalpha and TNFalpha appears to be of benefit for RA patients. Additionally, we demonstrated that TRAIL could be a protective factor in the initial phase of RA but subsequently has a disease-promoting role. The dual role of TRAIL is correlated to TRAIL receptor 1 expression of RA FLS. Moreover, we showed that FasL induces non-apoptotic effects in RA FLS, such as proliferation. Therefore, a TRAIL or FasL based therapeutic strategy in RA requires sensitization for apoptosis of FLS.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune qui mène à une inflammation chronique et à une destruction progressive des articulations. Les effecteurs principaux de cette pathologie sont les synoviocytes de type fibroblastique (FLS). Ces derniers utilisent les invadosomes, des structures riches en actine et en métalloprotéases, afin de dégrader la matrice extracellulaire (ECM). Ce phénotype pro-destructif résulte d’une activation des FLS par différents facteurs de croissance, dont le PDGF et le TGF-β. Les récepteurs à activité tyrosine kinase, dont le PDGFR, sont impliqués dans la pathogenèse de plusieurs maladies, incluant le cancer et la PR. Une activation de ces récepteurs peut mener, entre autres, à la survie, à la différenciation et à la prolifération des cellules. L’étude présentée dans ce mémoire montre que parmi les RTK les plus communs, le PDGFR est spécifiquement phosphorylé chez les cellules synoviales de patients atteints de PR, contrairement aux cellules de patients non arthritiques ou atteints d’arthrose. De plus, l’activation du PDGFR résulte en une augmentation de la formation d’invadosomes par les FLS. Nous avons aussi démontré que la formation d’invadosomes par le PDGFR nécessite l’activation de la voie de signalisation PI3K/Akt faisant intervenir les isoformes α et δ de la PI3K. De plus, l'inhibition de l’activation du PDGFR ou la neutralisation du PDGF endogène inhibe la formation des invadosomes et la dégradation de l'ECM par les synoviocytes, ce qui suggère la présence d'une boucle d'activation autocrine impliquant le PDGF. Parmi les isoformes du PDGF, nous avons démontré que le PDGF-B est exprimé de façon significativement plus élevée dans les synoviocytes provenant de patients atteints de PR. Nos données indiquent également une association entre le PDGF et le TGF-β dans la formation des invadosomes. Cette dernière implique la production autocrine de ligands du PDGFR induite par le TGFβ via la signalisation TβR1/Smad et PI3K/Akt. L’inhibition des isoformes de PI3K de classe I indique que le PI3Kα est impliquée de façon sélective dans l'expression de PDGF-B. Ces résultats démontrent que le PDGFR est un RTK nécessaire au phénotype destructeur des cellules synoviales d’arthrite. Ils fournissent aussi des preuves d'une association entre le TGF-β et le PDGFR dans la formation d’invadosomes chez les synoviocytes de patients atteints de la PR. / Abstract : Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation and progressive joint destruction. The main effectors of this pathology are fibroblast-like synoviocytes (FLS). They use invadosomes, actin-rich structures that concentrate metalloproteinases to degrade the extracellular matrix (ECM). This pro-destructive phenotype is due to the activation of FLS by various growth factors, including PDGF and TGF-β. Receptor tyrosine kinases, including PDGFR, are involved in the pathogenesis of several diseases, including cancer and RA. Activation of these receptors may lead to cell survival, differentiation and proliferation. The study presented in this thesis shows that among the most common RTKs, PDGFR is specifically phosphorylated in synovial cells of RA patients, unlike cells of non-arthritic or osteoarthritic patients. In addition, activation of PDGFR results in an increase in invadosome formation by FLS. We also shown that formation of invadosome by PDGFR requires the activation of the signaling pathway PI3K/Akt, that specifically involves the α and δ isoforms of PI3K. In addition, inhibition of PDGFR activation or neutralization of endogenous PDGF inhibits the formation of invadosomes and the degradation of the ECM by synoviocytes, suggesting the presence of an autocrine activation loop involving PDGF. Among the PDGF isoforms, we demonstrate that PDGF-B expression is significantly higher in synoviocyte cell lines from RA patients. Our data also indicates an association between PDGF and TGF-β for invadosome formation that involves autocrine production of PDGF-B induced by TGF-β through the Smad/T β R1 and PI3K/Akt pathways. Inhibition of class I PI3K isoforms indicates that PI3K α is selectively involved in the expression of PDGF-B. These results demonstrate that PDGFR is an RTK necessary for the pro-destructive phenotype of RAFLS. They also provide evidence of an association between TGF-β and PDGFR in invadosome formation by synovial cells from RA patients.

Articular cartilage is an avascular, aneural, and alymphatic tissue with a structure consisting of a superficial, a middle and a deep zone, overlie a calcified zone at the cartilage border between. Each zone has biological and mechanical properties. Self-repair of damaged cartilage seldom if ever occurs, and joint injuries that harm cartilage surfaces often result in osteoarthritis. This has prompted researchers to explore diverse approaches to cartilage regeneration. The superficial zone shows the highest cellularity and the lowest matrix density. Cartilage cells (chondrocytes) residing in the superficial zone had been thought to be a subpopulation of chondrocytes. However, our laboratory identified a second population of cells that were distinguishable from chondrocytes based on their clonogenicity, multipotency, migratory activity, higher proliferate rate and substantial morphological differences. These cells later proved to be chondrogenic progenitor cells (CPCs). Our continuing studies have shown that CPCs are less chondrogenic than normal chondrocytes and their function is to protect the cartilage surface rather than to regenerate cartilage matrix as previously supposed. In addition, we found evidence to suggest that CPCs act as pro-inflammatory cells in the context of cartilage injury. For these reasons, we undertook a more comprehensive comparison of the phenotypic differences between CPCs and normal chondrocytes and between CPCs and joint cells (tissue synoviocytes from the joint capsule and cells present in synovial fluid) which have been shown to be play roles in joint inflammation. Gene expression microarray analysis of >25,000 genes revealed that the overall pattern of gene expression in CPCs was distinct from normal chondrocytes, but closely related to synoviocytes and synovial fluid cells. Analysis of specific genes by quantitative PCR (qPCR) showed profound differences between CPCs and normal chondrocytes in terms of cartilage matrix gene expression (Collagen Type ІІ, Aggrecan, Link Protein and COMP) and pro-inflammatory gene expression (IL6, IL8, CCL2 and CXCL12). In contrast, the pattern of CPC gene expression closely resembled. Sulfated glycosaminoglycan assays revealed that cartilage matrix deposition by CPCs, as well as synoviocytes and synovial fluid cells, was significantly inferior to normal chondrocytes. However, chondrogenic and osteogenic differentiation assays, showed no significant differences among the four cell types. In addition to establishing that CPCs are distinct from chondrocytes, this work suggests significant revisions to our understanding of CPC function in cartilage. The weak chondrogenic ability and higher expression of inflammatory cytokines, suggests these cells don't play a regenerative role as previously thought. On the other, we found evidence that CPCs may form a protective layer on the top of the injured cartilage surfaces, preventing further cartilage injury. In vivo studies are needed to fully elucidate the significance of these roles in cartilage health and disease.

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13195号 / 論医博第2159号 / 新制||医||1030(附属図書館) / (主査)教授 松田 秀一, 教授 三森 経世, 教授 妻木 範行 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Einleitung: Die Entnahme von Synovialgewebe wird sowohl in in-vivo als auch in in- vitro-Studien verwendet, um das Fortschreiten und den Schweregrad der Osteoarthritis (OA) zu beurteilen oder um die Wirkungseffekte einer Behandlung zu bewerten. Um die histomorphologischen Veränderungen im Verlauf von Gelenkerkrankungen zu verstehen, sind detaillierte Informationen über die histomorphometrischen Parameter nicht erkrankter Synovialis erforderlich. Derzeit fehlen vergleichende Daten zur Darstellung juvenilen synovialen Gewebes. Ziele der Untersuchungen: Ziel der Studie war es, die mittlere Breite der intimalen Synovialschicht und ihre Zellularität sowie die Vaskularisierung der subsynovialen Schicht bei jugendlichen und erwachsenen Pferden, die nicht von einer Gelenkerkrankung betroffen sind, zu untersuchen. Tiere, Material und Methoden: Einhundert Synovialproben aus Metakarpophalangeal- gelenken von 25 lahmfreien euthanasierten Pferden wurden entnommen. Die histologische Untersuchung erfolgte an digitalisierten, mit Hämatoxylin-Eosin gefärbten Schnitten der Synovialproben anhand folgender Parameter: 1) Breite der intimalen Synovialauskleidung. Für die Messung der der Breite der intimalen Synovialschicht wurde die Grenze zwischen dem Stratum subsynoviale und der 36 initmalen Synovialschicht mittels Photoshop (Version 19, Adobe, San Jose, CA, USA) gekennzeichnet. 2) Dichte der Zellen, aus denen die intimale Synovialauskleidung besteht (Berechnet durch die Anzahl der Zellkerne im Verhältnis zur intimalen Synovialfläche in Zellen pro μm2) und 3) Vaskularisierung der subsynovialen Schicht (Bestimmung des Gefäßumfangs, Zählung der Gesamtanzahl der Blutgefäße pro Zotte, Berechnung der Dichte der Blutgefäße pro mm2 subsynovialer Schicht, minimaler und maximaler Abstand vom Gefäßschwerpunkt zur Gelenkinnenfläche). Im Rahmen der statistischen Analyse wurden die Daten mit dem Shapiro-Wilk-Test auf Normalverteilung geprüft. Nicht-parametrische Daten wurden mittels Mann-Whitney- U-Test und parametrische Daten mittels Student’s t-Test analysiert. Das Signifikanz- Niveau für alle durchgeführten statistischen Tests lag bei p < 0,05. Ergebnisse: Die mediane Breite der intimalen Auskleidung zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen jugendlichen (22,34 μm) und erwachsenen (23,34 μm) Pferden (p=0,327). Die Zellularität der Intimalauskleidung war bei juvenilen Proben (eine Zelle/143,8 μm2) signifikant geringer als bei Synovialproben adulter Tiere (eine Zelle/188,7 μm2), (p < 0,001). Auch die Dichte der Blutgefäße pro mm2 innerhalb der subsynovialen Schicht war bei juvenilen Tieren mit einem Blutgefäß/mm2 signifikant geringer als bei adulten Pferden mit 0,5 Blutgefäßen/mm2) (p < 0,001). Schlussfolgerung: Diese Studie liefert morphometrische Daten über die synoviale Intimalbreite, die intimale Zellularität und die Vaskularisierung der Synovialis von juvenilen und adulten Pferden ohne Gelenkerkrankungen. Dabei stellen die Zellularität und die Dichte der Blutgefäße geeignete Parameter zur Unterscheidung junger und adulter Tiere dar. Diese Daten bieten Referenzwerte für zukünftige Untersuchungen an Synovialexplantaten klinisch erkrankter oder experimentell erkrankter Tiere oder für invitro-Studien.

Les maladies ostéoarticulaires représentent environ 10% de l’ensemble des pathologiessurvenant en France chaque année. Les difficultés pour identifier les causes de ces maladiesproviennent pour une part d’un manque de compréhension du mécanisme de lubrificationd’une articulation synoviale saine. Dans ce contexte, un premier objectif de ce travail a été d’analyser la structurediscontinue du liquide synovial à partir de prélèvements animaux sains et de la reproduire àpartir de composants biomoléculaires commerciaux afin de comprendre le mécanisme delubrification dans le cas sain. Le deuxième objectif de cette thèse a été d’analyser l’évolution de la structure et despropriétés lubrifiantes du liquide synovial dans le stade précoce de pathologies noninflammatoiresou inflammatoires à partir de prélèvements pathologiques humains. Afind’étudier plus finement l’évolution de la lubrification pathologique cette thèse a visé àdévelopper aussi des modèles de lubrifiants obtenus à partir de cultures cellulaires desynoviocytes humains en combinant l’action de facteurs inflammatoire (cytokines).L’ensemble des résultats montre l’importance de la structure supramoléculaire duliquide synovial dans l’obtention de bonnes propriétés lubrifiantes ; cette relation devraitconstituer d’une part un paramètre clé dans le diagnostic précoce des pathologies articulaireset d’autre part une voie de développement de liquides thérapeutiques à base de lubrifiantsnanostructurés / Osteoarticular diseases account for approximately 10% of all diseases occurring inFrance each year. The difficulties in identifying their causes are also due to a deficiency inunderstanding the lubrication mechanism of healthy synovial joint.In this context, the first objective of the present study was to analyze the discontinuousstructure of synovial fluid samples from healthy animals and to reproduce it using commercialbiomolecular components in order to understand the lubrication mechanism in the healthycase. The second objective of this thesis was to analyze the evolution of the structure andthe lubricating properties of synovial fluid in the early stage of non-inflammatory andinflammatory diseases using pathological human fluid samples. In order to study moreprecisely the evolution of pathological lubrication this work aimed to develop lubricantmodels obtained from cell cultures of human synoviocytes adding the action of pathologicalinflammatory factors (cytokines). All together the results show the importance of the supramolecular structure of thesynovial fluid in obtaining good lubricating properties what may be a key parameter in theearly diagnosis of joint diseases and even more a chance to develop therapeutic fluids basedon nanostructured lubricants