Le réseau xyloglucanes-cellulose est la structure portante de la paroi primaire des cellules végétales chez les plantes supérieures. Les interactions entre ces deux polysaccharides ont été examinées lors de travaux antérieurs, mais le manque de substrats parfaitement caractérisés limite ces études. La préparation d'une gamme de xylogluco-oligosaccharides branchés complexes par synthèse chimio-enzymatique, utilisant la glycosynthase Cel7B E197A, associée à des xyloglucanes naturels obtenus par extraction et hydrolyse enzymatique, a permis l'étude de l'influence de nombreuses caractéristiques structurales de ces hémicelluloses, sur leur capacité d'interaction avec la cellulose. Afin d'évaluer l'impact de ces paramètres, plusieurs techniques ont été mise en oeuvre. La détermination d'isothermes d'adsorption a illustré une amélioration de la capacité d'adsorption par augmentation de la masse molaire et une taille critique, à partir de laquelle l'adsorption est significative. Les résidus galactosyle et xylosyle n'ont pas montré de conséquences majeures sur ces interactions contrairement aux résidus fucosyle qui semblent favorables, bien que la variation de répartition des ramifications puisse également être en jeu. La titration calorimétrique isotherme a montré la présence de deux types de sites identifiés comme : (i) site de surface exothermique et (ii) site endothermique localisé au niveau des rainures de la cellulose, dans le cas des substrats de faible masse molaire ou à l'auto-association dans le cas des xyloglucanes natifs. Enfin, une analyse RMN du solide de composites xyloglucanes-cellulose de contraste isotopique variable a mis en évidence la conservation de la grande mobilité des chaînes latérales après adsorption ainsi qu'une absence de modification conformationnelle des signaux relatifs aux chaînes de surface de la cellulose.

Ces travaux de thèse portent sur la conception par voie chimio-enzymatique de polymères amphiphiles issus de glycolipides, capables de s’auto-assembler en phase aqueuse et susceptibles de répondre à des applications de vectorisation de principes actifs. Après une étude préalable des paramètres influents lors de la synthèse enzymatique, huit monomères glycolipidiques porteurs de fonctions esters vinyliques,méthacrylate ou [alpha]-méthylstyrène ont été synthétisés à partir de dérivés d’huile de ricin et de glucose. Les monomères porteurs d’une fonction ester vinylique comme groupement polymérisable ont été copolymérisés en présence d’acétate de vinyle mais les copolymères ainsi formés n’ont pas montré de capacité à s’autoassembler. Les monomères fonctionnalisés par un groupement méthacrylate, ont été copolymérisés en présence de méthacrylate de méthyle ; trois gammes de copolymères ont ainsi été synthétisées par polymérisation radicalaire, les deux premières selon un mécanisme non contrôlé en présence d’un agent de transfert thiolé ou pas et la troisième selon la méthodologie RAFT. Dans tous les cas, des nanoparticules bien définies et stables pendant plusieurs mois ont été obtenues par auto-assemblage de ces trois gammes de copolymères en phase aqueuse. Le Rouge de Nil a été piégé au sein de ces nanoparticules puis relargué par ajout de chlorure de sodium, laissant entrevoir des applications de stabilisation et de vectorisation de principes actifs pour ces nouveaux copolymères. / The aim of this thesis was the conception of amphiphilic polymers able to self-assembly in water forpotential drug delivery applications, from glycolipidic monomers synthesized by a chemo-enzymatic pathway.After a preliminary study of the influent parameters on glycolipid synthesis via enzymatic catalysis, eightmonomers bearing either vinyl ester, methacrylate or a-methylstyrene groups have been synthesized fromglucose and castor oil derivatives. The vinyl ester-bearing monomers have been copolymerized with vinylacetate. Unfortunately, the resulting copolymers did not show interesting self-assembly properties in water.Three families of copolymers were synthesized from the methacrylate-bearing monomers and methylmethacrylate, either by free radical polymerization in the presence or not of a transfer agent or by reversibleaddition-fragmentation polymerization (RAFT). Well-defined and stablenanoparticles were obtained from allthose copolymers. Nile Red was successfully trapped into those nanoparticles and released by adding sodiumchloride, allowing perspectives as potential drug delivery applications for those new copolymers.

La valorisation de la biomasse saccharidique pour la production de dérivés biosourcés d'intérêt est un enjeu important. La cellulose est le polysaccharide le plus abondant sur Terre et représente une source de matière première considérable. Dans ce travail, de nouveaux procédés de dépolymérisation de la cellulose pour l'obtention contrôlée de cellodextrines sont décrits. Ils proposent une approche alternative plus douce aux procédés de production actuels en privilégiant l'utilisation d'enzymes, et de liquides ioniques comme solvants alternatifs. Ce travail rapporte l'élaboration de deux méthodes d'obtention contrôlée d'oligosaccharides à partir de cellulose et de cellulose acétate par combinaisons successives d'hydrolyses acide et enzymatique. Ces procédés ont permis l'obtention de cellodextrines de tailles ciblées avec de bons rendements, et constituent une voie prometteuse pour la valorisation de la cellulose en dérivés biosourcés. La deuxième partie de ce travail consiste en la modification chimio-enzymatique des oligosaccharides de cellulose produits pour leur valorisation en biomolécules d'intérêt, plus particulièrement dans le domaine de l'agrochimie. Les cellodextrines sont utilisées en tant que base saccharidique pour la synthèse d'analogues de lipo-chitooligosaccharides comme potentiels fertilisants verts. Deux méthodes de préparation ont été élaborées à l'aide des glycoside-hydrolases comme outils de synthèse. Les stratégies développées permettent un accès efficace à la synthèse d'analogues et peuvent être adaptées pour la production d'autres molécules.

La valorisation de la biomasse saccharidique pour la production de dérivés biosourcés d'intérêt est un enjeu important. La cellulose est le polysaccharide le plus abondant sur Terre et représente une source de matière première considérable. Dans ce travail, de nouveaux procédés de dépolymérisation de la cellulose pour l'obtention contrôlée de cellodextrines sont décrits. Ils proposent une approche alternative plus douce aux procédés de production actuels en privilégiant l'utilisation d'enzymes, et de liquides ioniques comme solvants alternatifs. Ce travail rapporte l'élaboration de deux méthodes d'obtention contrôlée d'oligosaccharides à partir de cellulose et de cellulose acétate par combinaisons successives d'hydrolyses acide et enzymatique. Ces procédés ont permis l'obtention de cellodextrines de tailles ciblées avec de bons rendements, et constituent une voie prometteuse pour la valorisation de la cellulose en dérivés biosourcés. La deuxième partie de ce travail consiste en la modification chimio-enzymatique des oligosaccharides de cellulose produits pour leur valorisation en biomolécules d'intérêt, plus particulièrement dans le domaine de l'agrochimie. Les cellodextrines sont utilisées en tant que base saccharidique pour la synthèse d'analogues de lipo-chitooligosaccharides comme potentiels fertilisants verts. Deux méthodes de préparation ont été élaborées à l'aide des glycoside-hydrolases comme outils de synthèse. Les stratégies développées permettent un accès efficace à la synthèse d'analogues et peuvent être adaptées pour la production d'autres molécules. / Valorisation of biomass is a timely challenge and its bio-conversion raises a growing interest from academics and industrials. Cellulose is the most abundant biopolymer on Earth and offers a wide range of applications including value added bio-derived compounds. In this work we report the design of new methods to produce cellodextrins from cellulose and from cellulose acetate, by a combination of successive hydrolyses. These strategies imply the use of ionic liquids and enzymes to perform the depolymerisation. They represent a soft alternative to the current processes of production. The controlled hydrolysis of cellulose was realised in two steps involving first the partial fragmentation of cellulose in ionic liquids by acid catalysis. Then, the selective hydrolysis of those cellulose fragments was performed by an endoglucanase to produce the targeted sizes of cellodextrins. The second method deals with the depolymerisation of water soluble cellulose acetate by enzymatic hydrolysis. Those two methods have led to the controlled production of cellodextrins of interest, with significantly improved yields. In the second part of this work, cellodextrins were used as building block for the synthesis of analogs of lipo-chitooligosaccharides as potential natural fertilizers. Several chemo-enzymatic routes were investigated to produce these biomolecules, and two methods of synthesis were elaborated using glycoside-hydrolases as coupling tools. Those methods offer an easy access to analogs and can be adapted for the production of further molecules.

Le but du projet est de mettre au point de nouveaux outils enzymatiques permettant la production de chitinoligosaccharides de taille et de degré d'acétylation parfaitement contrôlés pour l'étude d'enzymes impliquées dans la biosynthèse, la biodégradation et la modification de la chitine, et pour l'étude de récepteurs protéiques d'origine animale ou végétale. Des études récentes ont montré que les oligomères de la chitine et leurs dérivés sont des molécules qui interviennent dans les phénomènes symbiotiques et de reconnaissance hôte-pathogène dans le règne végétal. Ces molécules sont utilisées en agrochimie comme biofertilisants, et potentiellement en phytosanitaire. Ils sont connus également pour posséder de nombreuses activités biologiques dans le domaine de la santé (effets antimicrobiens, anticancéreux, anti-inflammatoires, immunostimulants...). Si les activités de cette classe d'oligosaccharides sont parfaitement reconnues, leurs modes d'actions restent encore à éclaircir, ce qui nécessite de disposer de molécules pures aux structures chimiques parfaitement contrôlées. La production d'oligomères de la chitine nécessite traditionnellement la mise en œuvre d'une chimie fastidieuse, qui peut être facilitée par une approche chimio-enzymatique.Dans le cadre de cette thèse, nous souhaitons donc développer des outils enzymatiques permettant la synthèse d'une bibliothèque de molécules de taille et de degré d'acétylation contrôlés en vue d'études structure-activité biologique. Pour cela, nous chercherons à produire des N-désacétylases et des chitinases dans différents systèmes d'expression et à caractériser leur activité afin de générer une panoplie de molécules de structure moléculaire parfaitement définie à partir de fragments saccharidiques issus de la biomasse. Les molécules ainsi préparées pourront ensuite être modifiées de façon chimio-sélective afin d'obtenir des sondes photoactivables et/ou biotinylées pour la caractérisation de récepteurs, des substrats fluoro- ou chromogéniques pour le dosage spécifique d'activités enzymatiques ou encore des lipochitinoligosaccharides capables de favoriser la croissance des plantes. Les approches utilisées pour mener à bien ce projet pluridisciplinaire seront : l'ingénierie et la production de protéines recombinantes, la caractérisation biochimique d'activités enzymatiques ainsi que la synthèse chimio-enzymatique et la modification chimique d'oligosaccharides qui devront être caractérisés d'un point de vue physicochimique. Il s'agit d'un projet intégré dans une collaboration nationale financée par l'ANR réunissant des équipes de l'Université de Grenoble, de Lyon, d'Orsay, et l'entreprise Bayer CropScience. / The aim of the project is to develop new tools for enzymatic production of chitooligosaccharides size and degree of acetylation perfectly controlled for the study of enzymes involved in biosynthesis, biodegradation and modification of chitin and for the study of protein receptors of animal or vegetable origin. Recent studies have shown that oligomers of chitin and its derivatives are molecules involved in the phenomena of symbiotic and host-pathogen recognition in plants. These molecules are used as agrochemicals biofertilizers. They are also known to possess numerous biological activities in the field of health (anti-microbial, anti-cancer, anti-inflammatory, immunostimulant ...). If the activities of this class of oligosaccharides are well recognized, their modes of action remain to be clarified, which requires having pure molecules with chemical structures perfectly controlled. The production of chitin oligomers traditionally requires the implementation of a tedious chemistry, which can be facilitated by a chemoenzymatic approach.As part of this thesis, we want to develop enzymatic tools for the synthesis of a library of molecules of size and degree of acetylation controlled studies for structure-biological activity. For this, we will seek to produce N-deacetylase and chitinases in different expression systems and characterize their activity to generate a variety of molecules well-defined molecular structure from saccharide fragments derived from biomass. The molecules thus prepared can then be modified so as to achieve chemoselective photoactivatable probes and / or biotinylated for the characterization of receptors, substrates or fluoro-chromogenic assay for specific enzyme activities or lipo-chitooligosaccharides can promote plant growth. The approaches used to complete this multidisciplinary project are: engineering and production of recombinant proteins, the biochemical characterization of enzymatic activities and chemoenzymatic synthesis and chemical modification of oligosaccharides to be characterized from the point of physicochemical view. This is an integrated project in a national collaboration funded by the ANR with teams from the University of Grenoble, Lyon, Orsay, and Bayer CropScience.

La synthèse d’oligosides complexes reste difficilement réalisable par voie chimique. Le recours aux catalyseurs enzymatiques permettrait de pallier aux contraintes de la chimie mais les enzymes naturelles ne présentent pas toujours les propriétés adéquates et nécessitent d’être optimisées par ingénierie moléculaire. Le couplage de la chimie et de biocatalyseurs conçus « sur mesure », peut offrir une alternative prometteuse pour explorer de nouvelles voies de synthèse des sucres, notamment pour la mise au point de glycovaccins. L’objectif de cette thèse a ainsi visé à mettre en œuvre des stratégies d’ingénierie semi-rationnelles de l’amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (ASNp), une α-transglucosylase utilisant le saccharose comme substrat, afin de concevoir de nouvelles spécificités de substrats et d’étendre le potentiel de cette enzyme à catalyser de nouvelles réactions, permettant ainsi d’aller bien au-delà de ce que la Nature peut offrir. Dans une première étude, une approche assistée par ordinateur a été suivie afin de remodeler le site actif de l’enzyme (sous-sites +1, +2 et +3) pour la reconnaissance et la glucosylation en α-1,4 d’un accepteur disaccharidique non-naturel (l’allyl 2-deoxy-2-N-trichloroacetyl-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranose). Le produit attendu, un trisaccharide, est un précurseur dans la synthèse chimio-enzymatique des oligosaccharides mimant les unités répétitives des lipopolysaccharides de Shigella flexneri, dont l’utilisation ultime est le développement de vaccins contre la Shigellose. Une approche computationnelle faisant appel à des outils dédiés au design automatisé de protéines et à une analyse des séquences a conduit au design d’une librairie d’environ 2.7x104 séquences, qui a ensuite été construite expérimentalement puis criblée. Au final, 55 variants actifs sur saccharose (le substrat donneur) ont été identifiés, et un mutant, appelé F3, a révélé sa capacité à glucosyler en α-1,4 le disaccharide cible. De manière étonnante, ce mutant possède 7 mutations au sein de son site actif, nécessaires au déploiement de sa nouvelle spécificité tout en maintenant son aptitude à utiliser le saccharose comme donneur d'unité glucosyle. Dans une deuxième étude, trois variants ont été identifiés lors du criblage de la librairie semi-rationnelle sur saccharose comme présentant de nouvelles spécificités de produits. Ces mutants ont été caractérisés plus en détails, ainsi que leurs produits, sur un plan biochimique et structural. Ces mutants, appelés 37G4, 39A8 et 47A10, contiennent entre 7 et 11 mutations dans leur site actif. Il a été montré qu’ils étaient capables de reconnaitre le saccharose et le maltose (un produit de la réaction avec le saccharose) comme donneur et accepteur pour synthétiser en quantités variables de l’erlose (α-D-Glucopyranosyl-(1→4)-α-D-Glucopyranosyl-(1→2)-β-D-Fructose) et du panose (α-D-Glucopyranosyl-(1→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→4)-α-D-glucose), des molécules non produites par l’enzyme sauvage. Des taux de production relativement élevés ont été obtenus pour ces molécules, dont les propriétés acariogènes et le pouvoir sucrant pourraient présenter un intérêt applicatif pour l’industrie alimentaire. Dans une dernière partie, un autre mutant, appelé 30H3, a été isolé lors du criblage primaire de la librairie de par son activité élevée sur saccharose (une amélioration d’un facteur 6.5 comparé à l’enzyme sauvage). Après caractérisation, le mutant s’est avéré synthétiser un profil unique de produits en comparaison de l’enzyme sauvage ASNp. Il s’est ainsi montré très efficace pour la synthèse de maltooligosaccharides solubles, de taille de chaînes contrôlée allant d’un DP 3 à 21, et de faible polydispersité. Aucun polymère insoluble n’a été identifié. La structure 3D du mutant résolue par cristallographie des rayons X a révélé un agrandissement de la poche catalytique en raison de la présence de 9 mutations introduites dans la première sphère.... / Chemical synthesis of complex oligosaccharides still remains critical. Enzymes have emerged as powerful tools to circumvent chemical boundaries of glycochemistry. However, natural enzymes do not necessarily display the required properties and need to be optimized by molecular engineering. Combined use of chemistry and tailored biocatalysts may thus be attractive for exploring novel synthetic routes, especially for glyco-based vaccines development. The objective of this thesis was thus to apply semi-rational engineering strategies to Neisseria polysaccharea amylosucrase (NpAS), a sucrose-utilizing α-transglucosylase, in order to conceive novel substrate specificities and extend the potential of this enzyme to catalyze novel reactions, going beyond what nature has to offer. In a first study, a computer aided-approach was followed to reshape the active site of the enzyme (subsites +1, +2 and +3) for the recognition and α-1,4 glucosylation of a non-natural disaccharide acceptor molecule (allyl 2-deoxy-2-N-trichloroacetyl-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranose). The trisaccharide product is a building block for the chemo-enzymatic synthesis of oligosaccharides mimicking the repetitive units of the Shigella flexneri lipopolysaccharides, and ultimately, for the production of a vaccine against Shigellosis disease. Using computational tools dedicated to the automated protein design, combined with sequence analysis, a library of about 2.7x104 sequences was designed and experimentally constructed and screened. Altogether, 55 mutants were identified to be active on sucrose (the donor substrate), and one, called mutant F3, was subsequently found able to catalyze the α-1,4 glucosylation of the target disaccharide. Impressively, this mutant contained seven mutations in the first shell of the active site leading to a drastic reshaping of the catalytic pocket without significantly perturbing the original specificity for sucrose donor substrate. In a second study, three variants were identified from the screening of the semi-rational library on sole sucrose as displaying totally novel product specificities. They were further characterized, as well as their products, at both biochemical and structural level. These mutants, called 37G4, 39A8 and 47A10, contained between 7 and 11 mutations into their active site. They were found able to use sucrose and maltose (a reaction product from sucrose) as both donor and acceptor substrates to produce in varying amounts erlose (α-D-Glucopyranosyl-(1→4)-α-D-Glucopyranosyl-(1→2)-β-D-Fructose) and panose (α-D-Glucopyranosyl-(1→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→4)-α-D-glucose) trisaccharides, which are not produced at all by parental wild-type enzyme. Relatively high yields were obtained for the production of these molecules, which are known to have acariogenic and sweetening properties and could be of interest for food applications. In a last part, another mutant 30H3 was isolated due to its high activity on sucrose (6.5-fold improvement compared to wild-type activity) from primary screening of the library. When characterized, the mutant revealed a singular product profile compared to that of wild-type NpAS. It appeared highly efficient for the synthesis of soluble maltooligosaccharides of controlled size chains, from DP 3 to 21, and with a low polydispersity. No formation of insoluble polymer was found. The X-ray structure of the mutant was determined and revealed the opening of the catalytic pocket due to the presence of 9 mutations in the first sphere. Molecular dynamics simulations suggested a role of mutations onto flexibility of domain B’ that might interfere with oligosaccharide binding and explain product specificity of the mutant.