Le système nerveux central est constamment patrouillé par des leucocytes afin d’y assurer une protection contre les agents pathogènes et un maintien de l’homéostasie. L’objectif principal de cette thèse était de caractériser la cascade biomoléculaire responsable du recrutement de leucocytes dotés d’une morphologie particulière dite « en bâtonnets » dans le système vasculaire cérébral lors de différentes conditions neuroinflammatoires, soit l’exposition à la toxine pertussique (PTX) et dans l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE). Un premier mécanisme de recrutement, identifié dans un modèle d’endotoxémie au lipopolysaccharide (LPS), ne permettait pas d’expliquer le recrutement de leucocytes observé dans les deux conditions neuroinflammatoires. Nous avons ainsi voulu caractériser ce mécanisme alternatif. Dans le cadre de cette thèse, nous avons identifié la nature des leucocytes bâtonnets recrutés à la vasculature cérébrale dans les conditions neuroinflammatoires comme étant des neutrophiles. Nous avons également mis en lumière un mécanisme de recrutement alternatif propre à la PTX et à l’EAE reposant sur l’interleukine 6 (IL-6), l’intégrine aM, la molécule d’adhésion ICAM-1 et la chimiokine CXCL1 et menant à l’adhésion du neutrophile à la vasculature cérébrale. L’identification de la voie de signalisation impliquée dans l’activation endothéliale par l’IL-6 et contribuant au recrutement des leucocytes bâtonnets à la vasculature cérébrale a permis d’observer l’expression du récepteur IL6Ra sur l’endothélium cérébral, mais les données préliminaires concernant son implication dans le développement pathologique sont peu concluantes. Cette thèse contribue à identifier un mécanisme de recrutement de neutrophiles effecteurs en conditions neuroinflammatoires et propose la chimiokine CXCL1 comme cible thérapeutique potentielle dans le traitement de maladies neuroinflammatoires comme la sclérose en plaques. / The central nervous system (CNS) is constantly patrolled by leukocytes in order to protect tissue against pathogens and maintain homeostasic conditions. The main objective of this thesis was to characterize the biomolecular cascade responsible for leucocyte recruitment to the cerebral vasculature, during two neuroinflammatory conditions: pertussis toxin (PTX) exposure and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). These leukocytes, presenting a particular "rod-shaped" morphology, have been first reported during examination of peripheric immune response in the central nervous system following induction of endotoxemia by lipopolysaccharide (LPS) administration. In the framework of this thesis, we first looked to characterize the identity of the rod-shaped leukocytes recruited to the brain vasculature during these neuroinflammatory conditions, which revealed to be mainly constitued of neutrophils. Starting with the hypothesis of a recruitment mechanism similar to the one induced by LPS, we uncovered the existence of an alternative mechanism of rod-shaped leukocytes recruitment that relies on interleukin 6 (IL-6), aM integrin, ICAM-1 adhesion molecule and CXCL1 chemokine during the two neuroinflammatory conditions. We sought to identify the molecular pathway responsible for cerebral endothelium activation that promote rod-shaped leukocytes to the CNS vasculature. These works allowed to confirm expression of IL-6Ra receptor on CNS vasculature but preliminary data regarding the involvement of classic IL-6 pathway in endothelium are inconclusives. This thesis contributes to identify a mechanism of neutrophil recruitment during neuroinflammatory contexts and suggests CXCL1 chemokine as a potential therapeutic target in the treatment of neuroinflammatory pathologies like multiple sclerosis.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La reelin est une glycoprotéine sécrétée de la matrice extracellulaire essentielle pour le développement embryonnaire des structures laminaires du système nerveux central (SNC): cortex, hippocampe et cervelet. Dans le cerveau postnatal et adulte, la reelin potentialise la plasticité synaptique, exerce une action trophique sur la croissance neuritique dans l’hippocampe et contrôle la maturation des récepteurs NMDA. Le but de ma thèse a été d’étudier les mécanismes cellulaires à l’origine des fonctions de la reelin dans la plasticité postnatale des structures stratifiées du SNC. Nous avons utilisé une stratégie intégrant des approches d’électrophysiologie, d’imagerie calcique, d’immunocytochimie, de biochimie et de pharmacologie, sur des modèles in vitro (culture primaires de neurones d’hippocampe et de cervelet) et ex vivo (tranches aigues de cortex frontal). Dans les neurones d’hippocampe in vitro, nous avons mis en évidence que la reelin est synthétisée et sécrétée par des neurones GABAergiques montrant un marquage reelin intense alors que les neurones cibles de la reelin sont caractérisés par une expression ponctiforme et de faible intensité. En revanche, dans le cervelet in vitro, les 2 fonctions, sécrétion et liaison de la reelin, sont assurées par la quasi totalité des cellules granulaires glutamatergiques. Nous avons finalement examiné les conséquences physiologiques de l’absence ou de la diminution de reelin endogène dans l’hippocampe et dans le cortex frontal. Nous avons mis en évidence que dans l’hippocampe in vitro la sécrétion continue de reelin régule l’homéostasie des récepteurs NMDA. Nous montrons également que dans le cortex frontal ex vivo, la reelin facilite la maturation des fonctions synaptiques glutamatergiques. Nos résultats démontrent donc que la reelin joue un rôle majeur dans la plasticité neuronale du SNC postnatal. / Reelin is an extracellular matrix protein essential for the correct formation of laminated structures during embryonic brain development. In the postnatal and adult brain, reelin promotes hippocampal dendrite development, enhances long term potentiation (LTP) at hippocampal synapses and favors the maturation of glutamatergic transmission. During my thesis, I studied the cellular mechanisms underlying the functions of reelin in laminated structures of the postnatal central nervous system: hippocampus, cerebellum and cortex. By combining immunocytochemical, biochemical and pharmacological approches, we first characterized the expression profile of reelin in primary cultures of hippocampal and cerebellar neurons. Our results showed that in the hippocampus reelin is synthesized and secreted by a population of GABAergic neurons expressing an intense reelin immunoreactivity (IR). We also showed that secreted reelin binds lipoprotein receptors present on a different neuronal population characterized by a punctate and light reelin IR. In contrast, in cerebellar cultures, we observed that reelin is synthesized and secreted by glutamatergic cells expressing a single type of reelin punctate and light staining. Using calcium imaging, we demonstrated that the continuous secretion of reelin is necessary to regulate glutamate receptor homeostasis and maintain the subunit composition of NMDARs in the hippocampus in vitro. We next examined the effect of decreased levels of reelin in the postnatal development of prefrontal cortex (PFC) glutamatergic synapses using electrophysiology on heterozygotes reeler mice (HRM) slices. Our data revealed that reelin facilitates the maturation of glutamatergic synaptic functions in the PFC and plays a central role in neuronal plasticity in the central nervous system.

Les perturbations vers la gauche ou vers la droite sont des occurrences quasi-quotidiennes pour un bon nombre de gens. Se faire bousculer en marchant dans la foule ou subir les effets inertiels d'un véhicule de transport en commun tournant ou s'arrêtant soudainement ne sont que deux exemples communs de telles situations. De plus, les perturbations dues aux glissements latéraux sont fréquemment observées chez les personnes âgées. Les articulations des membres inférieurs et du tronc ont moins de latitude de mouvement dans le plan frontal que dans le plan sagittal. En conséquence, lors d'une translation médio-latérale inattendue le système nerveux central (SNC) utilise probablement des stratégies compensatoires différentes du cas de la direction antéro-postérieure. Le but de cette étude était d'évaluer les stratégies compensatoires utilisées lors de perturbations perpendiculaires au plan du mouvement. Un vélo ergométrique modifié fut utilisé comme modèle de mouvements rythmiques; dans une telle situation, les effets de l'équilibre sont de beaucoup amoindris et les réactions compensatoires peuvent être attribuées à la perturbation du mouvement rythmique. Pour les fins de cette étude les sujets eurent à pédaler sous quatre conditions expérimentales différentes: dynamique active (DA), au cours de laquelle les sujets pédalaient à une fréquence de 1 Hz maintenue à l'aide d'un métronome et d'information présentée sur un écran d'ordinateur; dynamique passive (DP), au cours de laquelle les mouvements enregistrés sous la condition DA étaient reproduits à l'aide d'un moteur dynamométrique tandis que les sujets devaient simplement relaxer; statique active (SA), au cours de laquelle chaque sujet devait essayer de reproduire l'activité musculaire produite par leur soléaire sous la condition DA; statique passive (SP), au cours de laquelle les sujets devaient simplement maintenir chacune des positions du cycle de pédalage tout en relaxant. Des mouvements vers la gauche et vers la droite d'à peu près 1 g (9.8 ms-2) d'accélération furent appliqués aléatoirement à l'aide d'un cylindre électrique pendant une des quatre phases du cycle de pédalage: propulsion (P), récupération (R), transition PR, et transition RP. L'activité électromyographique (EMG) du soléaire (SOL), du médial du gastrocnémien (MG), du tibial antérieur (TA), du vaste latéral (VL), du biceps fémoral [chef court] (BF), et du tenseur du fascia lata (TFL) furent enregistrés et analysés. Les réponses EMG furent divisées en deux époques (E) selon la latence de la réponse: E₁ (80-250ms) et E₂ (250-400ms). Autant pour E₁ que pour E₂ les perturbations vers la gauche et vers la droite provoquèrent des réactions condition-dépendantes dans le TFL, le BF, le MG et le SOL, des réactions phase-dépendantes dans le TFL, le BF et le VL, et des réactions direction-dépendantes dans le BF et le TA. Les réactions durant E₁ furent notablement atténuées par la répétition de la perturbation alors que les réactions durant E₂, déjà moins prononcées, eurent tendance à demeurer relativement constantes au fil des répétitions successives. Ces résultats permettent de conclure que, même dans des situations où l'équilibre n'est pas un facteur important, les mouvements soudains vers la gauche ou vers la droite provoquent des réactions musculaires spécifiques et complexes dépendantes de la condition, de la phase, et de la direction lors du pédalage sur vélo ergométrique. De plus, les résultats de l'étude suggèrent que le feedback sensoriel, causé soit par le mouvement actif ou passif, joue un rôle important dans le déclenchement des réponses musculaires. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Mouvement rythmique, Perturbation, EMG, Phase-dépendance, Tâche-dépendance.

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Les hormones thyroïdiennes (HT) ont un rôle majeur dans le développement du système nerveux central (SNC). Trois récepteurs nucléaires dirigent l'action des HT et deux sont majoritairement exprimés dans le cerveau : TR?1 et TR?1. L'ontogenèse du récepteur TR?1 coïncide avec la fenêtre d'action des HT, ce qui suggère un rôle majeur dans les effets postnataux des HT chez les rongeurs. Pour étudier son rôle in vivo, nous avons créé des souris transgéniques surexprimant, spécifiquement dans les neurones, un récepteur TR?1 muté pour sa liaison à l'hormone. Le cervelet de ces souris présente les mêmes altérations de développement que les souris hypothyroïdiennes. L'inhibition de l'expression du facteur de transcription BTEB, régulé par les HT probablement via TR?1, dans des cultures primaires de neurones affecte la ramification mais pas l'élongation neuritique dépendante de la T3. La phosphorylation spécifique de certains sites des protéines MAP2 et Tau par la T3 pourrait participer à ces processus.

Une des causes principales de la Maladie d’Alzheimer et des autres Tauopathies est la présence d’enchevêtrements neurofibrillaires (ENF). Les ENF sont des agrégations intracellulaires de la protéine Tau hyperphosphorylée. Plusieurs études ont montré que les ENF sont associés à la pathogénèse des troubles neurodégénératifs et à la neurotoxicité. De plus, il a été démontré qu’une diminution du niveau de la protéine Tau permet de prévenir les déficits cognitifs dans les modèles murins. Basé sur ces études, notre hypothèse de recherche est que réduire le niveau total de Tau dans le cerveau, pourrait diminuer les ENF et retarder la pathologie. Notre objectif est de développer une molécule capable de cibler l’ARNm de Tau plutôt que la protéine Tau hyperphosphorylée. Ainsi, nous avons développé le SOFA-delta ribozyme, capable de cliver l’ARNm de Tau. Notre ribozyme a trois composantes soit le bloqueur, le biosenseur et l’effecteur. Nous avons développé des deltaribozymes capable cibler les exons constitutifs et l’exon 10 (spécifique au Tau4R) de l’ARNm de Tau, ainsi nous pouvons cibler tous les isoformes de Tau. Dans ce projet, nous avons tout d’abord synthétisé le deltaribozyme par clonage moléculaire et nous avons confirmé son effet grâce au clivage in vitro. Dans un second temps, nous avons transfecté le ribozyme dans des cellules neuronales, et nous avons caractérisé son effet sur l’ARNm de Tau par RT-PCR. Enfin, nous avons produit des virus AAV, infecté des cellules neuronales et caractérisé encore une fois l’effet du ribozyme sur l’ARNm de Tau par RT-PCR. Cette approche thérapeutique est basée sur la spécificité et l’efficacité du SOFA-delta-ribozyme, qui identifie et coupe l’ARNm de Tau. Ainsi, dans ce mémoire nous avons identifié le ribozyme 350 et 395 comme candidats potentiellement capable de cliver l’ARNm de Tau. / One of the main causes of Alzheimer’s disease and Tauopathies is the presence of neurofibrillary tangles (NFT). NFT consist in intracellular aggregation of the abnormally hyperphophorylated protein Tau. Several studies have shown that NFT are associated with the pathogenesis of neurodegenerative disorders and neurotoxicity. Moreover, it has been demonstrated that decreasing the level of Tau protein could prevent cognitive deficits in mouse models. Based on these studies, our hypothesis is that reducing the level of total Tau in the brain could decrease NFTs and delay the pathology. Our objective is to design a molecule that will target directly Tau mRNA instead of the hyperphosphorylated protein. We developed a modified delta-ribozyme, the SOFA (Specific On/Off Adaptor) ribozyme, which is able to cleave the Tau mRNA. Our ribozyme is composed of three components: the blocker, the biosensor, and the effector. We have designed delta-ribozymes that target constitutive exons of Tau mRNA as well as the exon 10 specific of Tau 4R. Therefore, we can target all the Tau isoforms. In this project, we first synthesized the delta-ribozyme by molecular cloning and we confirmed its effect by in vitro cleavage. Secondly, by transfecting it in neuronal cells we characterized its effects on Tau mRNA by RT-PCR. Finally, we produced AAV viruses and infected neuronal cells and characterized its effects on Tau mRNA by RT-PCR. This therapeutic approach is based on specificity and efficiency of the SOFA-ribozymes, which identify and cut the Tau mRNA. Thus, in this project we identified ribozymes 350 and 395 as potential good candidates able to cleave the Tau mRNA.

Chez les individus infectés par le VIH-1, nous retrouvons des particules virales dans le système nerveux central dès la phase aiguë de l'infection. De ce fait, plusieurs complications neurologiques peuvent émerger chez ces individus tels que des troubles neurocognitifs modérés, certaines déficiences neurocognitives asymptomatiques et même de la démence. De nombreuses recherches démontrent que la neuropathogénèse du VIH-1 est surtout reliée à la neuroinflammation plutôt qu'à la charge virale dans le système nerveux central. Plusieurs molécules proinflammatoires sont produites par les cellules neurologiques lorsqu'il y a infection par le VIH-1. Parmi celles-ci, nous retrouvons les eicosanoides tels que les leucotriènes (LTs) qui sont souvent présents dans le liquide cérébrospinal d'individus infectés. À ce jour, le rôle que peut jouer ces médiateurs lipidiques inflammatoires dans la pathogénèse du VIH-1 est méconnu. Nous nous sommes donc intéressés à mieux comprendre comment les LTs peuvent affecter l'infection du système nerveux central par le VIH-1. Dans une première étude, nous avons tenté de caractériser les interactions entre les LTs, les cellules microgliales et le VIH-1. Nous montrons que les LTs inhibent non seulement l'entrée virale, mais aussi les étapes précoces de l'infection qui suivent la fusion membranaire du VIH-1 dans les microglies. En effet, lorsque ces cellules sont traitées aux LTs, on observe une diminution significative du niveau d'ADN proviral dans les cellules microgliales résultant d'un blocage d'étapes de la replication virale après l'importation nucléaire de façon protéine kinase C (PKC)-dépendante. Dans le cadre d'un deuxième projet, nous avons étudié l'effet des LTs sur les astrocytes. Ainsi, nous avons pu mettre en évidence la capacité des astrocytes stimulés par le leucotriène C₄(LTC₄) à induire la transmigration de lymphocytes T CD4+ infectées par le VIH-1 au travers d'un modèlew vitro de barrière hémato-encéphalique. De plus, nos résultats démontrent l'implication de la CX3CL1 à cet effet. Ainsi, cette étude décrit comment les LTs produits dans le système nerveux central peuvent contribuer à la neuroinvasion et l'infection du VIH-1 dans ce compartiment. Globalement, nos travaux permettent une mise en perspective du rôle des LTs dans la neuropathogénèse du VIH-1 et ouvre la voie vers de nouvelles stratégies thérapeutiques.

La douleur ainsi que l’apprentissage moteur sont deux éléments importants à considérer en contexte de réadaptation. Même s’ils sont souvent abordés de manière isolée, des interactions ont été identifiées entre ces deux phénomènes. En effet, de nombreuses études montrent que les exercices de réadaptation musculaire pourraient réduire le développement de douleur pathologique. D’autre part, il semble que l’activité nociceptive pourrait altérer la plasticité du système moteur, une composante essentielle dans l’apprentissage d’une tâche motrice. Des recherches récentes ont aussi montré que la douleur pouvait interférer avec la plasticité du système moteur, même après que les signaux de douleurs se soient dissipés. Toutefois, ces observations ont été faites chez l’animal à la suite d’une lésion de la moelle épinière. De ce fait, la compréhension de cette interaction entre le système nociceptif et la plasticité motrice est assez limitée. Dans ce mémoire, l’effet d’un épisode de douleur passé sur la capacité d’apprentissage d’une tâche motrice a été évalué, chez le rat intact. Pour ce faire, nous avons élaboré une tâche dans laquelle les rats devaient apprendre à se déplacer d’un côté à l’autre d’un couloir sur des barres métalliques dont l’espacement pouvait être modifié. L’injection de substances inflammatoires à différentes durées d’action a permis d’identifier l’impact d’un épisode de douleur récent sur la capacité d’apprentissage d’une tâche motrice. Nos résultats montrent que, tout comme chez l’animal ayant une lésion de la moelle épinière, la douleur peut interférer avec l’apprentissage d’une tâche motrice même lorsque le système nerveux est intact. De plus, il semble que les déficits d'apprentissage moteur puissent également être influencés par la durée de l'épisode douloureuse antérieure. / Pain and motor learning are two important elements in rehabilitation context. Despite being mostly studied independently, important interactions exist between them in the context of spinal cord injury. Indeed, many studies show that rehabilitation exercises could reduce the development of pathological pain. On the other hand, it seems that the nociceptive activity could alter motor system plasticity. Recent studies have also shown that pain can interfere with motor plasticity, even when the acute pain signals have dissipated. However, these observations have mostly been made in animals following a spinal cord injury. As a result, this interaction between the nociceptive system and motor plasticity is poorly understood. In this master’s thesis, the effect of a prior pain episode on the motor learning ability was evaluated in neurologically intact rats. To do this, we trained rodents to walk on a custommade horizontal ladder. After initial training, the rats underwent a week-long rest, during which they were randomly assigned to a control group, or one out of two pain conditions. Nociceptive stimuli were then used to identify the impact of a prior pain episode on the motor learning ability. Our results show that pain can interfere with motor learning even in neurologically intact animals. Motor learning deficits also appear to be influenced by the duration of the previous pain episode. Taken together, these results suggest that previous pain episodes may negatively influence motor learning, and that the amplitude and duration of the learning disability is proportional to the duration of the prior pain episode.

La neuroinflammation est présente dans la vaste majorité des maladies neurologiques et est soupçonnée de contribuer de façon importante à un éventail de pathologies causées, entre autres, par une dégénérescence neuronale. Que les événements neuroinflammatoires surviennent en période développementale ou au sein du cerveau mature, plusieurs composantes de la réponse inflammatoire sont susceptibles de participer à la dégénérescence neuronale, lesquelles varient selon le contexte pathologique. Cette thèse porte sur l'identification de nouveaux acteurs potentiels contribuant aux dommages neuronaux dans différents contextes, en plus de porter une attention sur le rôle de ces acteurs en conditions physiologiques. En premier lieu, il est question de la contribution des voies dépendantes du myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88) - une protéine adaptative cruciale à la signalisation de la majorité des récepteurs toll-like et aux interleukines-1 et -18 - à la dégénérescence des neurones dopaminergiques des systèmes nerveux centraux et entériques. Les résultats de ces études démontrent une contribution importante de ces voies à la dégénérescence des neurones dopaminergiques du plexus myentérique, par opposition à une absence d'implication de ces mêmes voies au niveau du cerveau. De plus, nous rapportons une participation potentielle des voies dépendantes de MyD88 aux fonctions cognitives et motrices. En second lieu, la contribution de la réponse neuroinflammatoire a été examinée dans un contexte de dégénérescence neuronale induite par une lésion excitotoxique durant une période critique du développement cérébral. Les résultats de cette étude démontrent que le blocage de la neuroinflammation prévient l'apparition de signes pathologiques tels la mort neuronale ainsi que les déficits comportementaux. Cette étude identifie également une nouvelle cible thérapeutique anti-inflammatoire potentielle, soit le récepteur métabotropique du glutamate de type 5 (mGluR5) exprimé sur la microglie activée. Dans son ensemble, cette thèse présente des évidences du rôle critique de la réponse inflammatoire à la dégénérescence neuronale dans deux contextes expérimentaux pathologiques différents, en plus de mettre en évidence le potentiel des voies dépendantes de MyD88 et le mGluR5 dans le développement de stratégies thérapeutiques pour des maladies telles que le Parkinson et la schizophrénie.