Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La brucelosis ovina causada por Brucella ovis es una enfermedad infectocontagiosa que afecta a los ovinos, principalmente a los machos, que cursa con alteraciones reproductivas que merman los indicadores productivos de los rebaños. En hembras la susceptibilidad a la infección es menor y puede causar abortos. Existen pocos estudios sobre la prevalencia en Chile. Sólo hay estudios parciales que muestran que la seroprevalencia en algunos predios es de 52% (Arévalo, 2004). Este trabajo tuvo por objetivo desarrollar un ELISA-I utilizando un antígeno soluble de la cepa rugosa B. abortus RB51, extraído mediante el método de Galanos et al (1969), para la detección de anticuerpos contra B. ovis en sueros de carneros previamente estudiados en los Laboratorios de Microbiología de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Chile. Las alternativas evaluadas fueron placas Nunc 69620 y Maxisorp con 2 temperaturas de sensibilización (4ºC y ambiente) y “buffers” carbonato/bicarbonato pH 9,6 y PBS pH 7,2. Se utilizaron 6 diluciones de antígeno (1/10, 1/100, 1/1000, 1/2000, 1/5000 y 1/10000) y 4 de conjugado (1/4000, 1/6000, 1/8000 y 1/10000). Se estudiaron dos grupos de animales: los inoculados experimentalmente con 2 cepas de B. ovis (una de laboratorio y otra de campo) y los de animales sospechosos de campo. La infección estaba comprobada por el diagnóstico previo mediante las pruebas de inmunodifusión en gel de agar (AGID) y contrainmunoelectroforesis, en los sueros recibidos en el laboratorio, clasificándolos en positivos y negativos. En los animales cuya infección fue experimental, se extrajo una muestra antes de la inoculación (sueros considerados negativos) y 35 días posteriores a una segunda inoculación (sueros considerados positivos). Los sueros de los animales infectados de campo arrojaron resultados de densidad óptica (DO) más altos que los de inoculados experimentalmente, incluso en algunos casos los valores fueron casi el doble. También se observó un efecto similar en los valores de DO de animales negativos, donde los valores DO de los sueros negativos de campo eran muy similares a los de positivos inoculados. Estos bajos valores de DO de los sueros positivos inoculados, podría ser explicado por la patogenicidad atenuada de la cepa de laboratorio o que las dosis inoculadas fueron insuficientes para provocar una seroconversión de magnitud similar a la presentada por los animales expuestos naturalmente a la infección. Para calcular la Razón de Absorción (RA) con el fin de reconocer las mejores alternativas de fase sólida, se utilizaron los valores de DO de los sueros de animales negativos previa inoculación y los valores de DO de los animales de campo positivos. Los mejores resultados de RA (5,72 en la placa sensibilizada a 4ºC y 5,29 a temperatura ambiente) fueron obtenidos en las placas Nunc 69620, con “buffer” carbonato/bicarbonato, dilución de 1/10 y 1/6000 de antígeno y conjugado, respectivamente. Estos resultados son concordantes con los trabajos realizados anteriormente por varios autores. Estos resultados demuestran que existió adhesión de LPS-R de B. abortus RB51 a la placa de poliestireno y reconocimiento de los anticuerpos del suero de los animales positivos contra B. ovis con el LPS-R adherido. Por lo tanto, se podría desarrollar un ELISA-I utilizando como antígeno soluble el LPS-R de B. abortus cepa RB51, con un estudio que abarque mayor número de muestras. Palabras claves: Brucella ovis, Brucella abortus RB51, LPS-R, ELISA

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Brucella ovis (B. ovis) es el agente etiológico de la “epididimitis del carnero”, enfermedad de distribución mundial que provoca pérdidas económicas importantes en la producción ovina, debido a una baja en la fertilidad por la epididimitis y orquitis que induce en los carneros y a esporádicos abortos en ovejas. El objetivo del presente trabajo fue evaluar en el tiempo, mediante la prueba de inmunodifusión doble en gel de agar (ID), dos antígenos obtenidos por extracción salina caliente de B. ovis elaborados de dos cepas diferentes, uno de la cepa estándar 63/290 y el otro de la cepa chilena Til Til. Ambos antígenos fueron enfrentados a los sueros de dos carneros, cada uno inoculado experimentalmente con una de las cepas, además estos dos antígenos fueron reaccionantes positivos con el suero control positivo. Se comparó la reactividad de cada antígeno frente a los sueros tanto homólogos como heterólogos. Se utilizaron 54 sueros de cada carnero infectado, obtenidos sistemáticamente durante un periodo de 420 días de observación. Los sueros del carnero inoculado con la cepa Til Til, enfrentados a su antígeno heterólogo Ag. 63/290, presentaron un mayor porcentaje de positividad (65%) que con el Ag. homólogo TilTil (25%). La positividad detectada por el Ag 63/290 se mantuvo por un periodo continuo de 23 semanas mientras que con el Ag TilTil fue de solo 9 semanas y con un alto número de sueros sospechosos. La positividad de los sueros del carnero inoculado con cepa Til Til no se mantuvo hasta el final de la experiencia. Los sueros del carnero inoculado con la cepa 63/290 no presentaron reactividad con ninguno de los dos antígenos. El análisis del contenido proteico de cada antígeno fue de 1,4 y 1,1 mg/ml para Ag Til Til y 63/290 respectivamente

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Existe una amplia variedad de patologías que afectan a los gatos domésticos, generando gastos económicos por parte de sus dueños en busca de soluciones y la eventual mejoría de sus mascotas. Dentro de todas éstas, el virus herpes felino tipo 1 (VHF-1) uno de los agentes etiológicos del llamado complejo respiratorio felino, genera múltiples problemas en los gatos domésticos, dejando incluso secuelas importantes que afectan posteriormente su calidad de vida. Además, por ser un patógeno altamente distribuido alrededor del mundo y de fácil transmisión, existe un gran porcentaje de animales infectados y por su característica de patógeno latente, continúa distribuyéndose sin control a través de las poblaciones de gatos. En la clínica de animales pequeños su diagnóstico es en base a los signos clínicos presentados por los gatos afectados, existiendo hasta la fecha en Chile sólo una forma de diagnóstico de laboratorio específico para identificar el agente que no se utiliza rutinariamente en clínica. Por lo anterior, el tratamiento generalmente se basa en el conocimiento y experiencia del médico veterinario tratante, sin confirmación real del agente que está actuando. Por esta razón, en esta memoria de título se propuso implementar un método de diagnóstico molecular alternativo en gatos menores de un año de edad con signología clínica correspondiente a infección con VHF-1. Para ello se realizó la detección del gen de la glicoproteína B del virus a través de la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y se determinó el porcentaje de identidad nucleotídica (PIN) del segmento obtenido, comparándolo con datos de la base genómica online Genbank®. De los once gatos analizados, en solo uno de ellos se logró amplificar un segmento correspondiente al gen de la glicoproteína B. El valor de PIN obtenido (96%) validaría que el segmento obtenido corresponde al gen de la glicoproteína B del VHF-1. Se discute la eficiencia del método implementado / PROGRAMA AUCAI 2011

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La Encefalopatía Espongiforme Bovina (BSE) pertenece a un grupo de enfermedades neurodegenerativas denominadas Espongiformes Transmisibles (EET), dentro de las cuales se destacan además la Enfermedad de Creutzfeld Jakob (CJD) con su nueva variante (NV-CJD) en los humanos y el Scrapie en animales. Estas patologías se caracterizan por ser mortales, tener un largo período de incubación y presentar signos neurológicos progresivos. En el análisis histopatológico del sistema nervioso central (SNC) de los afectados predomina una vacuolización de la sustancia gris. El agente etiológico de estas patologías se denomina "prión" (partícula infecciosa de naturaleza proteica) y consiste en una isoforma infectiva (PrPsc) de una proteína celular normal (PrPc) que, además de poseer una gran resistencia a la proteinasa K, adquiere la capacidad de transformar la isoforma normal en patológica. La BSE ha adquirido gran importancia en el último tiempo debido a sus graves consecuencias económicas y por su posible transmisión al hombre, dando origen a la nueva variante de la Enfermedad de Creutzfeld Jakob (nv-CJD) a través del consumo de productos cárneos infectados. A pesar de que nuestro país es considerado libre de BSE y con bajo riesgo de introducción de esta enfermedad, es muy importante contar con métodos de diagnóstico específicos, rápidos, reconocidos y utilizados internacionalmente. En este estudio se logró purificar la proteína priónica celular (PrPc), a partir de cerebros de bovino y se caractrizó mediante electroinmunotransferencia utilizando un anticuerpo monoclonal específico 6H4. Además se caracterizó una proteína priónica recombinante (PrPrec). Por otra parte, se realizó una inmunodetección de proteínas priónicas mediante la utilización de un "kit" de inmunoensay enzimático (ELISA), aprobado por la Comisión Europea en 1999 como método de diagnóstico para BSE. Mediante este ensayo se analizaron 45 muestras de óbex de bovinos, mayores de 30 meses de edad, provenientes de mataderos de la Región Metropolitana. En un estudio inicial se obtuvieron 2 muestras sospechosas, lo cual se pudo deber a errores de operación. Posteriormente estas muestras fueron analizadas nuevamente, resultando finalmente el 100% de las muestras en estudio negativas. A través de este estudio se logró implementar en forma pionera en nuestro país este método diagnóstico para BSE, utilizado y reconocido ampliamente a nivel internacional, aportando así un nuevo método a las medidas epidemiológicas nacionales destinadas a mantener a nuestro país libre de BSE / FINANCIAMIENTO: CENTRO DE BIOLOGIA Y BIOTECNOLOGIA (CBB) DEL INSTITUTO MILENIO DE ESTUDIOS AVANZADOS DE LA UNIVERSIDAD DE CHILE SERVICIO AGRICOLA Y GANADERO (SAG

Memoria para optar al Título Profesional de Médico / Existe un grupo de patologías neurodegenerativas letales que afectan a los humanos y a los animales denominadas encefalopatías espongiformes transmisibles (EET). En los humanos, destaca la enfermedad de Creutzfeldt Jacob (CJD), y la aparición en los últimos años de una nueva variante (nvCJD) que es causada por el agente de la encefalopatía espongiforme bovina (BSE). Dentro de las EET animales, destaca el scrapie de ovinos y caprinos, y la BSE, que además de afectar al ganado bovino, es transmisible a los humanos. La teoría más aceptada sobre el agente etiológico de estas enfermedades es la teoría del prión, que corresponde a una proteína priónica patológica (PrPsc) resistente a proteasas, que se origina por un cambio conformacional de una proteína priónica celular del huésped (PrPc). La encefalopatía espongiforme bovina (BSE) ha causado impacto mundial por el daño que ha provocado en la salud animal y en la economía, y por su relevancia en la salud pública al ser una enfermedad zoonótica. Durante años, el método de diagnóstico de rutina para la BSE fue el examen histopatológico del SNC de los bovinos sospechosos. Sin embargo, la epidemia desencadenada en Europa, principalmente en el Reino Unido, aumentó la necesidad de implementar métodos diagnósticos más rápidos y certeros. Esto originó el desarrollo de pruebas rápidas de diagnóstico, basadas en técnicas de inmunodetección del agente patológico (PrPsc) como es la inmunotransferencia o western blot. El presente trabajo se orientó por una parte, a la purificación, caracterización y detección inmunológica de proteínas priónicas en óbex de bovinos, mediante la utilización de la inmunotransferencia. Para obtener la PrPc, se utilizó un método de purificación de proteínas priónicas, y en el caso de la PrPsc se utilizó una proteína priónica recombinante (PrPrec); además, se evaluó la respuesta de ambas proteínas frente a la actividad enzimática de la proteinasa K. Para la posterior caracterización y detección inmunológica de estas proteínas, se realizó una electroinmunotransferencia. Por otra parte, para evaluar un método rápido de diagnóstico que detecte el agente de la BSE, se utilizaron 84 muestras de óbex de bovinos provenientes de mataderos de la Región Metropolitana, las que se analizaron individualmente por Western Blot mediante un kit comercial (Prionics Check-Western), aceptado y utilizado internacionalmente para el monitoreo y diagnóstico de esta enfermedad. Los resultados del presente estudio muestran la caracterización y detección inmunológica de la PrPc y la PrPrec mediante la inmunotransferencia. Además, se demuestra la sensibilidad a la digestión de ambas proteínas con la proteinasa K, lo que las diferencia de la PrPsc, que es una proteína proteasa resistente. En cuanto a los resultados obtenidos con el kit (Prionics Check-Western), de las 84 muestras analizadas 60 arrojaron un resultado negativo a BSE, ya que no se detectó inmunológicamente la PrPsc. El resto de las muestras (24) fueron analizadas nuevamente por dar resultados inconclusos, al aparecer bandas en el rango de peso molecular de la PrPsc. Sin embargo, finalmente el total de las muestras (84) arrojaron resultados negativos a BSE, lo que indica que las muestras inconclusas eran falsas positivas originadas por una deficiente digestión enzimática de la PrPc. La importancia de esta memoria de título radica en el hecho de ser pionera en la caracterización e inmunodetección de las proteínas priónicas de bovinos utilizando la inmunotransferencia, y en lograr la utilización e implementación en nuestro país de un método de diagnóstico rápido para BSE basado en un kit comercial, que es utilizado y aceptado internacionalmente para la detección del agente etiológico de esta patología

Memoria para optar al Título Profesional de Medico Veterinario / El identificar eventuales agentes patógenos que podrían afectar a animales silvestres, a futuro podría ser una herramienta útil para preservar el patrimonio natural. En base a esto se analizaron 167 muestras de heces y 3 órganos digestivos completos provenientes de ejemplares de pingüino Adelia (Pygoscelis adeliae), provenientes de una zona Antártica especialmente protegida (ZAEP Nº150). Para el análisis de las heces (112 de polluelos y 55 de adultos) se utilizaron 4 metodologías parasitológicas -Flotación, Sedimentación, Observación Directa y Tinción de Ziehl Neelsen-, donde se obtuvieron diversos resultados, siendo los más relevantes: la obtención de ooquistes de Cryptosporidium spp. mediante la técnica de Ziehl Neelsen (lo que corresponde a una primera descripción en el continente Antártico), la obtención de huevos de Tetrabothrius spp. mediante las técnicas de sedimentación y flotación, y la obtención de ooquistes de Coccidias y huevos de Nematodos -ambos por la técnica de flotación- sin ser posible la determinación de la especie en ninguno de los dos casos. De los tres aparatos digestivos analizados, los resultados más interesantes de mencionar son: la obtención de un ejemplar de Tetrabothrius spp. completo (excepto por el escolex) de 81 cm. de largo y la obtención de una gran cantidad de ejemplares de nematodos identificados como Streptocara spp. recuperados de los 3 estómagos analizados. / Financiamiento: FIV (121002019102079)

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La anemia infecciosa del salmón es una enfermedad que afecta principalmente a los salmones del Atlántico (Salmo salar) y es causada por el virus ISA (infectious salmon anemia), el cual pertenece al género Isavirus de la familia Orthomyxoviridae. En Chile fue detectado por primera vez en salmones del Atlántico en el año 2007, causando innumerables pérdidas a la industria salmonera. El virus posee variadas proteínas de superficie, siendo las más estudiadas la neuroaminidasa, y la hemaglutinina-esterasa (HE). El gen que codifica para la proteína HE, posee una “región altamente polimórfica”, la cual le confiere gran variabilidad entre diferentes aislados del virus ISA. En el presente estudio se utilizó el gen HE del genotipo viral aislado con mayor frecuencia en Chile (genotipo EU), el cual fue sintetizado químicamente y optimizado para ser expresados por levaduras. El gen HEopt fue subclonado dentro del vector de expresión pPICZα junto a un péptido señal de secreción extracelular, el cual fue integrado al genoma de la levadura Pichia pastoris por recombinación homóloga. La cepa de la levadura que se obtuvo como resultado, fue sometida a fermentación y la cantidad de proteína HE secretada al medio de cultivo fue medida a través de la técnica de Bradford. Con el fin de corroborar la especificidad de la inmunorreacción de las proteínas recombinantes secretadas se realizaron ensayos Western blot y ELISA, utilizando un anticuerpo específico anti-ISA y sueros de salmones infectados naturalmente con el virus, respectivamente. De estos análisis se concluyó que la proteína recombinante producida y secretada por la cepa de levadura es específica y presenta inmunorreactividad positiva. De lo anterior puede inferirse que la plataforma montada y las proteínas recombinantes producidas en esta memoria serían de gran utilidad para la futura generación de técnicas tanto de diagnóstico como de control del virus de la anemia infecciosa del salmón en Chile / Financiamiento: Proyecto Bicentenario PSD 23 Conicyt y Proyecto de Iniciación en Investigación VID I/07

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Cryptosporidium spp. es un protozoario cosmopolita, que posee un amplio rango de hospederos. En los animales afecta principalmente a recién nacidos y se caracteriza clínicamente por distintos grados de diarrea. Es considerado un agente zoonótico y re emergente, ya que en el hombre inmunocomprometido puede producir una enfermedad clínica grave. Se ha informado que los terneros menores de 1 mes de edad son los más comúnmente infectados. El diagnóstico de esta enfermedad es de laboratorio y se realiza a través de distintas técnicas. La de rutina en nuestro país a nivel veterinario es la de Ziehl-Neelsen (ZN) y detecta los ooquistes del parásito en las heces de los animales infectados, mediante un examen microscópico de extendidos teñidos con ZN, previa concentración. Otra técnica de tinción para el diagnóstico de este protozoo es la de Aureamina (AU), la cual también permite la visualización de ooquistes de Cryptosporidium spp. en extendidos de heces previamente concentradas, pero a través de microscopía de fluorescencia. Esta última posee ventajas frente a ZN, en cuanto a la rapidez en su realización y lectura. Sin embargo, en nuestro país no existen antecedentes o estudios al respecto. El objetivo de la presente memoria fue comparar la eficiencia diagnóstica de ZN frente a AU en el diagnóstico de Cryptosporidium spp. en heces de terneros diarreicos menores a un mes de edad. Para esto se recolectaron 205 muestras de dos rebaños lecheros de la Región Metropolitana. El nivel de infección detectado fue de 57,1% independiente del predio de origen o de la técnica utilizada. En tanto que 49,8% resultaron positivas a ZN y 56,1% a AU. La mayor intensidad de infección se observó en los animales de entre 7 y 14 días de edad. Sin embargo, es destacable el hallazgo de 2 animales positivos al día de nacido. También se aplicó una prueba inmunocromatográfica (CR) diagnóstica de uso humano, como confirmatoria. Este trabajo es el primer reporte en Chile del uso la prueba de AU y CR para el diagnóstico de la criptosporidiosis en heces bovinas. Se pudo concluir que AU fue más sensible que ZN (p<0,05), y que el nivel de concordancia fue óptimo entre ambas pruebas. Con CR se logró confirmar mayoritariamente los diagnósticos efectuados mediante ZN y AU. Además, fue posible detectar, una frecuencia de infección en terneros mayor a la descrita para predios lecheros de la Región Metropolitana y del país. Se concluye también, que estaríamos frente a una infección altamente prevalente y re emergente. Por último, este es el primer reporte de detección de este agente en animales de un día de edad / Financiamiento: Proyecto DI MULT 06/17-2

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El método de diagnóstico del botulismo conocido como Prueba de Protección en Ratón (PPR) fue implementado para su futuro uso frente a la sospecha de esta enfermedad durante brotes de mortalidad en aves silvestres acuáticas en Chile. Este bioensayo consiste en inocular un par de ratones (Mus musculus) con el suero de un ave sospechosa de presentar la enfermedad, siendo uno de ellos previamente protegido con la antitoxina correspondiente. Se considera un suero como positivo si el ratón no protegido muere y el ratón protegido vive. Debido a que la gran mayoría de los brotes de botulismo en aves son causados por la toxina botulínica tipo C1, decidimos implementar la PPR con la antitoxina tipo C. Para validar este diagnóstico se generaron experimentalmente, a partir de patos domésticos sanos, sueros positivos y negativos a la toxina botulínica tipo C1. Se utilizaron cuatro grupos de ratones; dos grupos fueron inoculados con suero positivo, siendo uno de ellos previamente protegido con la antitoxina tipo C; el otro grupo fue inoculado con suero fisiológico. La misma operación se realizó con los dos grupos de ratones restantes inoculados con suero negativo. Luego de obtener el resultado esperado, es decir, el grupo de ratones inoculados con suero positivo a la toxina botulínica tipo C1 e inyectados previamente con suero fisiológico murieron mostrando la signología característica, mientras que los ratones de los otros 3 grupos vivieron, aplicamos la PPR con sueros provenientes de aves acuáticas silvestres sospechosas de presentar botulismo aviar tipo C. Los sueros obtenidos a partir de aves capturadas en el humedal Laguna de Batuco y en el tranque de Relave Las Tórtolas resultaron negativos, sin embargo, los sueros de patos domésticos capturados en un Fundo Pangalillo, Melipilla, resultaron positivos, reportándose así el primer diagnóstico de botulismo aviar tipo C en Chile

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La brucelosis es una enfermedad infectocontagiosa zoonótica que afecta a los mamíferos, con amplia distribución mundial y de gran importancia económica. Muchos países han implementado programas de control y/o erradicación dirigidos a especies domésticas. Sin embargo, Brucella spp. es capaz de infectar a animales silvestres y en Chile casi no existen registros tanto en aquellos de vida libre como en cautiverio. En zoológicos, es importante conocer los riesgos de las principales enfermedades, especialmente las zoonóticas, para dimensionar a lo que se enfrentan tanto quienes trabajan con los animales como quienes los visitan. Se realizó un estudio serológico en 80 ungulados en cautiverio, pertenecientes a 9 especies, para detectar anticuerpos contra Brucella spp. mediante las técnicas Rosa de Bengala y ELISA de Competencia. Ambas pruebas fueron similares en sus resultados. Para la técnica Rosa de Bengala todas las muestras fueron negativas, y para el ELISA de Competencia, 2 muestras reaccionaron positivamente con valores levemente superiores a la línea de corte validada para el bovino